鼠痘病毒的GFP示踪系统及其应用.pdf

本发明公开了一种鼠痘病毒的GFP示踪系统及其应用。本发明所提供系统为重组鼠痘病毒，是将野生型鼠痘病毒基因组DNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为：将所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的片段a中的任一片段替换为片段b；所述插入为：在所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；所述片段a为序列表中序列1所示DNA片段；所述片段b为含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段。本发明的ECTV-GFP可与野生型病毒平行用于研究。另外，由于GFP的信号放大效应，ECTV-GFP可极大提高病毒监测灵敏度，为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供新思路，为抗鼠痘病毒药物筛选等应用研究也提供新技术平台。

权利要求书
1.   重组鼠痘病毒，是将野生型鼠痘病毒基因组DNA进行替换或插入得到的重组病毒；
所述替换为：将所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的片段a中的任一片段替换为片段b；
所述插入为：在所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；
所述片段a为序列表中序列1所示DNA片段；所述片段b为含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段。

2.   根据权利要求1所述的重组鼠痘病毒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.   根据权利要求2所述的重组鼠痘病毒，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第142‑861位。

4.   根据权利要求1‑3中任一所述的重组鼠痘病毒，其特征在于：所述含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。

5.   根据权利要求1‑4中任一所述的重组鼠痘病毒，其特征在于：所述野生型鼠痘病毒为野生型鼠痘病毒Moscow株；
所述插入中，所述片段a中的任一位点处为所述片段a中的序列1的第478位和第479位之间的位置。

6.   根据权利要求5所述的重组鼠痘病毒，其特征在于：所述重组鼠痘病毒的基因组DNA的序列为在GenBank号为NC_004105.1的序列的第89518位和第89519位之间插入序列表中序列3后得到核苷酸序列。

7.   制备权利要求1‑6中任一所述重组鼠痘病毒的方法，包括如下步骤：
（a）将权利要求1‑5任一中所述的野生型鼠痘病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2‑gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
（b）用所述野生型鼠痘病毒感染CV‑1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV‑1细胞，所述野生型鼠痘病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型鼠痘病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型鼠痘病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组鼠痘病毒载体甲；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为权利要求1‑4任一中所述的含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；
（d）用步骤（b）得到的重组鼠痘病毒载体甲感染新的CV‑1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV‑1细胞，所述重组鼠痘病毒载体甲与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组鼠痘病毒载体甲中所述gpt基因的重组鼠痘病毒载体乙，所述重组鼠痘病毒载体乙即为权利要求1‑6中任一所述重组鼠痘病毒。

8.   根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_004105.1的序列的第89041‑89518位和第89519‑90053位的序列。

9.   权利要求1‑6中任一所述重组鼠痘病毒在如下（a1）或（a2）中的应用：
（a1）制备研究鼠痘病毒感染机制的产品；
（a2）制备筛选抗鼠痘病毒药物的细胞模型。

10.   如下（b1）或（b2）的生物材料：
（b1）含有权利要求1‑6中任一所述重组鼠痘病毒的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有权利要求1‑6中任一所述重组鼠痘病毒的基因组RNA或cDNA的载体。

说明书鼠痘病毒的GFP示踪系统及其应用
技术领域
本发明涉及一种鼠痘病毒的GFP示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型鼠痘病毒Moscow株基因组中插入GFP编码基因后得到的重组鼠痘病毒。
背景技术
鼠痘病毒（poxvirus of mice）隶属痘病毒科脊索动物痘病毒亚科正痘病毒属，核酸为双链DNA，具囊膜，自然宿主为小鼠，可导致鼠痘疫情的暴发流行，致死率较高，常造成小鼠全群淘汰，危害极大。临床表现以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征，故鼠痘病毒又称脱脚病病毒(Ectromelia virus，ECTV)。在血清学和免疫学上与天花病毒及牛痘病毒有密切关系，在国际上广泛应用于构建抗天化病毒药物筛选的小动物模型。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是来源于发光水母（aequorea victoria）的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，由238个氨基酸组成。自1992年Prasher等克隆到GFP的cDNA以来，GFP示踪技术已广泛应用于分子生物学研究领域。结合GFP荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子或物质进行荧光示踪监测和定量检测。
目前尚未有对鼠痘病毒进行GFP示踪的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠痘病毒的GFP示踪系统及其应用。所述鼠痘病毒的GFP示踪系统即为一种表达绿色荧光蛋白的重组鼠痘病毒。
本发明所提供的重组鼠痘病毒，是将野生型鼠痘病毒基因组DNA进行替换或插入得到的重组病毒；
所述替换为：将所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的片段a中的任一片段（可由1个、2个或更多个核苷酸组成）替换为片段b；
所述插入为：在所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；
所述片段a为序列表中序列1所示DNA片段；所述片段b为含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段。
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。
在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码基因具体为序列表中序列3的第142‑861位。
进一步，所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。
在本发明的一个实施例中，所述野生型鼠痘病毒具体为野生型鼠痘病毒Moscow株。
进一步，所述野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_004105.1的序列（Up date：2012‑11‑22）。
在本发明的一个实施例中，所述重组鼠痘病毒是将野生型鼠痘病毒基因组DNA进行插入外源基因得到的重组病毒；具体的，所述插入中，所述“片段a中的任一位点处”为所述片段a中的序列1的第478位和第479位之间的位置。
由于所述野生型鼠痘病毒的基因组DNA序列为GenBank号为NC_004105.1的序列（Up date：2012‑11‑22），相应的，所述重组鼠痘病毒的基因组DNA序列为在GenBank号为NC_004105.1的序列（Up date：2012‑11‑22），的第89518位和第89519位之间插入序列表中序列3后得到的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组鼠痘病毒的方法。
本发明所提供的制备所述重组鼠痘病毒的方法，可包括如下步骤：
（a）将所述野生型鼠痘病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2‑gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
（b）用所述野生型鼠痘病毒感染CV‑1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV‑1细胞，所述野生型鼠痘病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型鼠痘病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型鼠痘病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组鼠痘病毒载体甲；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；
（d）用步骤（b）得到的重组鼠痘病毒载体甲感染新的CV‑1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV‑1细胞，所述重组鼠痘病毒载体甲与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组鼠痘病毒载体甲中所述gpt基因的重组鼠痘病毒载体乙，所述重组鼠痘病毒载体乙即为本发明所提供的表达绿色荧光蛋白的重组鼠痘病毒。
在上述方法的步骤（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_004105.1的序列的第89041‑89518位（对应序列1的第1‑478位）和第89519‑90053位（对应序列1的第479‑1013位）。
在本发明的一个实施例中，制备所述重组鼠痘病毒的方法具体包括如下步骤：
（a）将GenBank号为NC_004105.1的野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（Up date：2012‑11‑22）的第89041‑89518位（对应序列1的第1‑478位，命名为上游同源臂）和第89519‑90053位（对应序列1的第479‑1013位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2‑gpt的gpt基因的上游（如酶切位点Not I和Sal I之间）和下游（如酶切位点Pst I和BamH I之间），得到重组质粒，将其命名为pGPT‑IN；
（b）用野生型鼠痘病毒Moscow株感染CV‑1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒pGPT‑IN转染所述CV‑1细胞，所述野生型鼠痘病毒Moscow株与所述重组质粒pGPT‑IN通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因插入所述野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号为NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）的第89518位和第89519位之间的重组鼠痘病毒，将其命名为ECTV‑inf‑gpt‑in；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒pGPT‑IN中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段（序列3），得到重组质粒，将其命名为pGPT‑OUT‑GFP；
（d）用步骤（b）得到的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in感染新的CV‑1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒pGPT‑OUT‑GFP转染所述新的CV‑1细胞，所述重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in与所述重组质粒pGPT‑OUT‑GFP通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段（序列3）替代所述重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in中所述gpt基因的重组鼠痘病毒，将其命名为ECTV‑GFP。所述ECTV‑GFP即为本发明所提供的表达绿色荧光蛋白的重组鼠痘病毒。
所述重组鼠痘病毒在如下（a1）或（a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a1）制备研究鼠痘病毒感染机制的产品；
（a2）制备筛选抗鼠痘病毒药物的细胞模型。
本发明的又一个目的是提供如下（b1）或（b2）的生物材料：
（b1）含有所述重组鼠痘病毒的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有所述重组鼠痘病毒的基因组RNA或DNA的载体。
在本发明的一个实施例中，所述动物细胞具体为CV‑1细胞。
本发明选择绿色荧光蛋白（GFP）作为示踪蛋白具有以下优点：
1、对细胞既无毒性，也无种属、组织和位置特异性；
2、不需要任何反应底物及其他辅助因子，只需要激发光源的激发即可发光；
3、荧光品质稳定，能够克服穿透、毒素、光漂白，高温等不利因素。
实验证明，本发明建立的鼠痘病毒绿色荧光示踪系统—重组鼠痘病毒（ECTV‑GFP）与野生型鼠痘病毒Moscow株相比，ECTV‑GFP重组病毒的毒力、复制能力和致病力均无明显差异，即ECTV‑GFP重组病毒中，外源基因GFP的导入，对病毒的致病力无显著影响。本发明的ECTV‑GFP可与野生型病毒平行用于研究。另外，由于GFP的信号放大效应，EVTV‑GFP可极大提高病毒监测灵敏度，为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供新思路，为抗鼠痘病毒药物筛选等应用研究也提供新技术平台。
附图说明
图1为鼠痘病毒TK基因上下游同源序列的PCR扩增结果。其中，1为DNA Markers(DL2000)（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；2为上游同源片段（L）；3为下游同源片段（R）。
图2为重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的PCR检测结果。其中，1,2样品的模板为ECTV‑inf‑gpt‑in；3为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；4,5样品的模板为鼠痘病毒Moscow株；1,4为引物ECTV L‑up和GPT L的扩增产物；2,5为引物GPT R和ECTV R‑down的扩增产物。
图3为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的PCR扩增产物电泳结果。其中，1为DNA Markers（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；2，3样品的模板为ECTV‑inf‑gpt‑in的DNA；4,5样品的模板为ECTV‑GFP的DNA；2,4为引物ECTV L‑up和GFP L的扩增产物；3,5为引物GFP R和ECTV R‑down的扩增产物。
图4为GFP重组基因片段PCR扩增产物电泳结果。其中，1样品的模板为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的DNA模板，扩增引物为ECTV L‑up和ECTV R‑down；2为DNA Markers（由大到小依次为15000bp、10000bp、75000bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp）。
图5为野生型鼠痘病毒Moscow株（ECTV‑Moscow）和重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的一步生长曲线。
图6为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的荧光显微镜观察结果。其中，A为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP感染CV‑1细胞24小时的病毒增殖和绿色荧光蛋白表达情况；B为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP感染CV‑1细胞48小时的病毒增殖和绿色荧光蛋白表达情况；C为重组鼠痘病毒ECTV‑GFP感染CV‑1细胞72小时的病毒增殖和绿色荧光蛋白表达情况。
图7为感染病毒的小鼠症状观察结果。其中，A：PBS对照组小鼠；B：感染野生型鼠痘病毒（ECTV‑Moscow）小鼠；C：感染重组鼠痘病毒（ECTV‑GFP）小鼠。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毒株、细胞与小鼠：
野生型鼠痘病毒Moscow株（Ectromelia virus，Moscow strain）：（参见文献：Chen,N.,Danila,M.I.,Feng,Z.,Buller,R.M.L.,Wang,C.,Han,X.,Lefkowitz,E.J.&Upton,C.The genomic sequence of ectromelia virus,the causative agent of mousepox.Virology(2003)317,165–186.。
质粒pSV2‑gpt（购自ATCC公司，产品目录号：37145TM）、质粒phMGFP（购自Promega公司，产品目录号：E6421）、CV‑1细胞（购自ATCC，产品目录号：CCL‑70）、BHK‑21细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL‑10）、D980R细胞（参见文献：Kerr,S.M.,and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virus replication:recovery of plasmids from virus‑infected cells.Virology，180:625–632.）、Vero细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL‑81）。
雌性Balb/c小鼠：15‑18g，6‑8周龄，购自维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂和材料：
DMEM培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase，SuoerscriptⅢ反转录酶，脂质体（Lipofectamine2000）转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX RNA T7试剂盒购自Promega公司；Gelrite等均购自sigma公司；Eag Ⅰ限制性内切酶购自NEB公司；RNeasy Mini Kit购自QIAGEN。
实施例1、GFP标记的重组鼠痘病毒的构建及鉴定
一、同源重组质粒的构建及鉴定
1、重组质粒pGPT‑IN的构建及鉴定
将野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号为NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）的第89041‑89518位（对应序列1的第1‑478位，命名为上游同源臂）和第89519‑90053位（对应序列1的第479‑1013位，命名为下游同源臂）分别克隆至质粒pSV2‑gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT‑IN。具体操作如下：
（1）野生型鼠痘病毒Moscow株基因组DNA的提取
具体操作如下：
将野生型鼠痘病毒Moscow株用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK‑21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取鼠痘病毒DNA或‑70℃冻存备用。
提取鼠痘病毒DNA，具体步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris‑Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase‑free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入对倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比为25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40‑100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并‑70℃冻存备用。
（2）引物的设计与合成
根据野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号为NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）设计并合成如下两个引物对：
扩增上游同源臂的引物对：
ECTV L‑up：5’‑GCGGCCGCtggatcacaaccag‑3’（下划线部分为酶切位点Not Ⅰ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第89041‑89054位，即序列1的第1‑14位）；
ECTV L‑down：5’‑GTCGACatgatgacaataaag‑3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第89504‑89518位的反向互补序列，即序列1的第464‑478位的反向互补序列）
扩增下游同源臂的引物对：
ECTV R‑up：5’‑CTGCAGgaacggtggacatattc‑3’（下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第89519‑89535位，即序列1的第479‑495位）
ECTV R‑down：5’‑GGATCCatattatgagtcgatg‑3’（下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第90038‑90053位的反向互补序列，序列1的第998‑1013位的反向互补序列）
（3）重组质粒pGPT‑IN的构建及鉴定
以步骤（1）获得的野生型鼠痘病毒MOSCOW株基因组DNA为模板，以步骤（2）设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂。
PCR扩增体系组成：
DNA模板2μldNTP mix（10mM）1μl引物vv L/R‑up1μl引物vv L/R‑down1μl10×反应缓冲液5μlTaq酶1μl无核酸酶水40μl总体积50μl
扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增25个循环，最后72℃延伸10min。
扩增反应结果：扩增出目的片段，大小约为500bp（上游同源臂：492bps；下游同源臂：547bps），结果如图1。
首先用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切所述上游同源臂，将其与经过同样双酶切的质粒pSV2‑gpt大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2‑gpt质粒的酶切位点Not I和Sal I之间插入了GenBank号为NC_004105.1（Up date：2012‑11‑22）的序列的第89041‑89518位（对应序列1的第1‑478位）的核苷酸序列，同时在酶切位点Pst I和BamH I之间插入了GenBank号为NC_004105.1（Up date：2012‑11‑22）的序列的第89519‑90053位（对应序列1的第479‑1013位）的核苷酸序列的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT‑IN。
2、重组质粒pGPT‑OUT‑GFP的构建及鉴定
（1）GFP基因片段的获得
从质粒phMGFP中获得本发明所需的绿色荧光蛋白的编码基因，并在其两端添加上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
利用GFP特异引物GFP up和GFP down从质粒phMGFP中获得带有相应酶切位点的GFP基因片段。
GFP up：5’‑GTCGACATGGACTACCAAGACGATGACG‑3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，整个序列为序列3的第1‑28位的序列）
GFP down：5’‑CTGCAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC‑3’（下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列，整个序列为序列3的第843‑873位反向互补序列）
PCR扩增产物的序列为序列表中的序列3。
（2）重组质粒pGPT‑OUT‑GFP的构建及鉴定
用限制性内切酶Sal I和Pst I双酶切步骤（1）获得的GFP基因片段，与将其与经过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT‑IN的载体大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定将重组质粒pGPT‑IN的酶切位点Sal I和Pst I之间的gpt基因取代为序列表中序列3的第7‑867位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT‑OUT‑GFP。序列表中序列3的第142‑861位为绿色荧光蛋白的编码基因。
二、重组鼠痘病毒的构建及鉴定
1、重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的构建及鉴定
通过感染‑转染CV‑1细胞，使鼠痘病毒与重组质粒pGPT‑IN通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阳性筛选标记，利用蚀斑纯化，获得以所述gpt基因插入鼠痘病毒Moscow株基因组（GenBank号:NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）的第89518位和第89519位之间的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in。具体操作如下：
（1）GPT‑IN同源重组细胞培养物的获得
将CV‑1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80‑90%，感染鼠痘病毒Moscow株（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV‑1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT‑IN转染所述感染后的CV‑1细胞，继续培养2‑3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT‑IN同源重组细胞培养物，于‑70℃保存备用。
（2）GPT阳性筛选
GPT阳性的DMEM培养基（pH7.0）：由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培养基组成；所述霉酚酸在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为250μg/ml。
2×MEM培养基（pH7.0）：将100ml10×MEM、10ml100×MEM非必需氨基酸和100ml胎牛血清混合后，用水定容至500ml。
将CV‑1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至80%汇合度时，换成GPT阳性的DMEM培养基继续培养24h。
取上述步骤（1）获得的GPT‑IN同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阳性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阳性的DMEM培养基中培养的CV‑1细胞（MOI=1），37℃吸附1h。其间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃，且在2×MEM培养基中加入GPT阳性筛选药物（霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2×MEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为250μg/ml）。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25%Gelrite和加入了GPT阳性筛选药物的2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温防治3‑5min，待其凝固后，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in，于‑70℃保存备用。
（3）重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的鉴定
A.引物设计
根据野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号：NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）及GPT基因序列设计鉴定引物如表1。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，‑20℃保存备用。
表1重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的PCR鉴定所用引物
引物名称引物序列(5’‑3’)位置ECTV L‑up（上游引物）GCGGCCGCTGGATCACAACCAGNC_004105.1的第89041‑89054位GPT L（下游引物）CACACCTCCCCCTGAACCTGAA位于pSV2‑gpt载体中gpt基因内部靠左侧GPT R（上游引物）GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC位于pSV2‑gpt载体中gpt基因内部靠右侧ECTV R‑down（下游引物）GGATCCATATTATGAGTCGATGNC_004105.1的第90038‑90053位
B.重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的PCR检测
为了鉴定野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组内相应序列（序列1）与gpt基因的重组情况，以已纯化的相应重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的DNA为模板，分别以两对引物ECTV L‑up和GPT L、GPT R和ECTV R‑down进行PCR检测反应。同时设置以野生型鼠痘病毒Moscow株的DNA模板为对照。
反应体系配置如下：


PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、72℃1min，反应30个循环；72℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果，电泳结果如图2所示，以引物对ECTV L‑up和GPT L、GPT R和ECTV R‑down进行PCR扩增，待鉴定的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in均扩增出相应的目的条带（图2中泳道1和2），而作为对照的野生型鼠痘病毒Moscow株无目的条带（图2中泳道4和5）。以上结果说明步骤（2）得到的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in构建成功。
2、重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的构建及鉴定
再次通过感染‑转染CV‑1细胞，使重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in与重组质粒pGPT‑OUT‑GFP通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阴性筛选标记，利用蚀斑纯化，最终获得以含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段（序列3）替代重组鼠痘病毒载体ECTV‑inf‑gpt‑in中所述gpt基因的重组鼠痘病毒ECTV‑GFP。并通过序列测定，验证GFP基因是否准确导入野生型鼠痘病毒Moscow株基因组相应位点。具体操作如下：
（1）GPT‑OUT同源重组细胞培养物的获得
将CV‑1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80‑90%汇合度，感染步骤1制备的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获得感染后的CV‑1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒pGPT‑OUT‑GFP转染所述感染后的CV‑1细胞，继续培养2‑3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT‑OUT同源重组细胞培养物，于‑70℃保存备用。
（2）GPT阴性筛选
GPT阴性的DMEM培养基（pH7.0）：由6‑硫鸟嘌呤和DMEM培养基组成；所述6‑硫鸟嘌呤在GPT阴性的DMEM培养基中的终浓度为0.5μg/ml。
将D980R细胞按照1：6的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至60‑70%汇合度时，换成GPT阴性的DMEM培养基继续培养6h。
取上述步骤（1）获得的GPT‑OUT同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阴性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阴性的DMEM培养基中培养的D980R细胞（MOI=1），37℃吸附1h。待吸附完成后，吸除病毒液，每孔补加GPT阴性DMEM培养基3ml，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组鼠痘病毒ECTV‑GFP，于‑70℃保存备用。
（3）重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的鉴定
A.引物设计
根据野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号:NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）、GFP基因序列设计鉴定引物如表2。引物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，‑20℃保存备用。
表2重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的PCR鉴定所用引物
引物名称引物序列(5’‑3’)位置ECTV L‑up（上游引物）GCGGCCGCTGGATCACAACCAGNC_004105.1的第89041‑89054位GFP L（下游引物）GGGTAGCGGCTGAAGCACTG序列3的第349‑368位GFP R（上游引物）CAAGCAGAAGAACGGCATCA序列3的第609‑628位ECTV R‑down（下游引物）GGATCCATATTATGAGTCGATGNC_004105.1的第90038‑90053位
B．重组鼠痘病毒ECTV‑GFP基因组DNA的提取
将重组鼠痘病毒ECTV‑GFP用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK‑21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取鼠痘病毒DNA或‑70℃冻存备用。
提取病毒DNA，具体操作步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris‑Cl pH9.0，1mM EDTA）充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4℃冰箱。
4）加适量RNase‑free DNase到病毒重悬液，37℃，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40‑100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并‑70℃冻存备用。
DNA纯度=A260/A280=2.0，浓度达2000ng/μl。
C.重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的PCR检测
为了鉴定重组鼠痘病毒基因组内相应序列（序列1）与GFP基因的重组情况，以纯化的相应重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的DNA为模板，以引物对ECTV L‑up和GFP L、GFP R和ECTV R‑down进行PCR反应。同时设置以重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：

PCR反应条件如下：
94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、72℃1min反应30个循环；72℃7min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果，电泳结果如图3所示，以引物对ECTV L‑up和GFP L、GFP R和ECTV R‑down进行PCR反应，待鉴定的重组鼠痘病毒ECTV‑GFP均扩增出预期目的条带（图3中泳道4和5）；而作为对照的重组鼠痘病毒ECTV‑inf‑gpt‑in则无目的条带（图3中泳道2和3）。以上结果说明步骤（2）得到的重组鼠痘病毒ECTV‑GFP构建成功。
D.重组鼠痘病毒ECTV‑GFP基因组的序列测定
以步骤B获得的ECTV‑GFP重组病毒的DNA为模板，通过PCR技术，扩增病毒基因，通过序列测定，完成ECTV‑GFP重组病毒与野生型鼠痘病毒Moscow株基因序列的比对。
①PCR引物设计如下：
ECTV L‑up：5’‑GCGGCCGCtggatcacaaccag‑3’（下划线部分为酶切位点Not Ⅰ的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第89041‑89054位，即序列1的第1‑14位）；
ECTV R‑down：5’‑GGATCCatattatgagtcgatg‑3’（下划线部分为酶切位点BamH I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_004105.1的第90038‑90053位的反向互补序列，序列1的第998‑1013位的反向互补序列）
②配制PCR反应体系如下：

③PCR反应条件如下：
94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min反应30个循环；68℃7min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。观察结果并回收相应的目的条带（约1900bp）结果如图4。将回收的目的片段送样测序。将测序结果与野生型鼠痘病毒的基因组DNA相应序列进行比对，再次对同源重组进行确认分析。结果显示：重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的基因组DNA序列为在野生型鼠痘病毒Moscow株的基因组DNA序列（GenBank号：NC_004105.1，Up date：2012‑11‑22）的第89518位和第89519位（对应序列1的第478位和第479位）之间插入序列表中序列3（含有GFP编码基因的DNA片段序列）后得到的DNA序列。
实施例2、重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的生物学活性检测
一、重组鼠痘病毒ECTV‑GFP一步生长曲线的测定
用实施例1制备的ECTV‑GFP重组病毒感染（MOI=1）CV‑1细胞，37℃吸附1h后，移除病毒液，用DMEM清洗细胞3次，以去除残留的未感染病毒，然后于37℃用含有10%（体积百分含量）FBS的DMEM培养细胞。于感染后0‑24h内不同时间点（0、2、4、6、8、10、12、24h）收取病毒，对收取病毒在37℃进行蚀斑分析以测定其病毒滴度（PFU/ml），进而绘制一步生长曲线。实验同时以野生型鼠痘病毒Moscow株（ECTV‑Moscow）作为对照，检测ECTV‑GFP重组病毒与其一步生长曲线的差异。实验重复三次。
病毒的一步生长曲线的测定结果如图5所示，从图中可以看出，ECTV‑GFP重组病毒的复制周期和病毒的最高滴度，与野生型鼠痘病毒Moscow株（ECTV‑Moscow）没有明显差异，两者体外增殖周期基本一致，且病毒滴度均可达107PFU/ml。
二、重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的细胞水平评价
用实施例1制备的ECTV‑GFP重组病毒感染（MOI=1）CV‑1细胞，37℃吸附1h后，移除病毒液，用DMEM清洗细胞3次，以去除残留的未感染病毒，然后于37℃用含有10%（体积百分含量）FBS的DMEM培养细胞。于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。
荧光显微镜的连续观察结果显示：感染重组鼠痘病毒ECTV‑GFP的单层细胞，不仅在病毒的蚀斑区域可观察到明亮的绿色荧光，同时，在蚀斑区域的外围也可清晰地观察到细胞间连成一线并呈放射状扩散的绿色荧光（图6）。
因此，获得的重组鼠痘病毒ECTV‑GFP，不仅可通过绿色荧光的观察，准确、清晰的反映病毒在细胞水平的增殖、感染情况，同时，也可通过荧光信号的放大示踪效果，对病毒的早期感染进行定量监测和病毒的细胞间扩散进行实时监测。
三、ECTV‑GFP重组病毒的动物水平评价
将60只6‑8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为3组：A：PBS对照组、B：野生型鼠痘病毒Moscow株（ECTV‑Moscow）组、C：ECTV‑GFP重组病毒组，每组20只。
每组的接种方案如表3示。接种方式为滴鼻，三组均为单次接种，每次接种剂量均为0.1ml。
表3每组小鼠的接种方法
组别PBS组ECTV‑Moscow组ECTV‑GFP组剂量0.1ml100PFU/0.1ml100PFU/0.1ml
感染后，对各组乳鼠的发病情况及死亡率进行观察和统计，结果如表4：
表4各组小鼠发病及死亡情况统计
分组／症状病毒株感染病毒3天后感染病毒7天后
 100PFU/只发病率死亡率发病率死亡率APBS0000BECTV‑Moscow70%60%100%100%CECTV‑GFP70%50%100%100%
结果显示，染毒3天后，ECTV‑Moscow组和ECTV‑GFP组被感染的小鼠均出现：精神萎靡、体重减轻、行走不稳等症状，7天后，感染ECTV‑Moscow和ECTV‑GFP的小鼠全部死亡；PBS对照组乳鼠正常生长，如图7。
综合本实施例的实验结果，可见与野生型ECTV‑Moscow相比，ECTV‑GFP重组病毒的毒力、复制能力和致病力均无明显差异，即ECTV‑GFP重组病毒中，外源基因GFP的导入，对病毒的致病力无显著影响。