一种产凝乳酶的交织顶孢霉及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103421696 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421696 A *CN103421696A* (21)申请号 201310383103.6 (22)申请日 2013.08.28 CGMCC NO.7620 2013.04.15 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/64(2006.01) A23C 19/032(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 光明乳业股份有限公司 地址 201103 上海市闵行区吴中路 578 号 (72)发明人 杭锋 宋馨 陈万义 王钦博 穆海菠 夏永军 侯建平。

2、 刘振民 郭本恒 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 薛琦 (54) 发明名称 一种产凝乳酶的交织顶孢霉及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株交织顶孢霉 (Acremonium implicatum)， 所述交织顶孢霉保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏编 号为 CGMCC No.7620。该菌株具有产凝乳酶的特 征， 是一株新分离鉴定的能够生产凝乳酶的交织 顶孢霉菌株， 该菌株具有独特的生理生化特征和 遗传背景， 是一种新的安全菌种。 利用所述交织顶 孢霉 (Acremonium implicatum) 菌株制备的凝乳 酶可使液态奶在短时。

3、间内发生凝乳， 该菌株以及 利用该菌株制备的凝乳酶在原制干酪生产加工方 面具有广阔的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103421696 A CN 103421696 A *CN103421696A* 1/1 页 2 1.一株交织顶孢霉(Acremonium implicatum)， 其特征在于， 所述交织顶孢霉保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏。

4、编号为 CGMCC No.7620。 2. 一种如权利要求 1 所述交织顶孢霉的培养方法， 其特征在于， 将所述交织顶孢霉接 种在脱脂乳琼脂培养基中， 25 28培养 2 3 天即得。 3. 一种凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 利用小麦麸皮培养基培养权利要求 1 所述交 织顶孢霉， 2528固态发酵37天， 将含有菌丝体的小麦麸皮培养基按与水的体积比 为 1:3 1:5 的比例加入水， 25 28， 160 180r/min 震荡培养 1 2 小时， 所得的水 相在 -4 0， 8000 10000r/min 离心后取上清液即得。 4. 如权利要求 3 所述凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 。

5、所述含有菌丝体的小麦麸皮培 养基按与水的体积比的加入量为 1:4 1:5， 所述固态发酵的时间为 3 7 天。 5. 如权利要求 3 所述凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 所述小麦麸皮培养基中水的质 量百分比添加量为 50% 200%， 该培养基中脱脂乳的质量百分比添加量为 0 1.0%， 该培 养基中葡萄糖的质量百分比添加量为 0 1.0%。 6. 如权利要求 5 所述凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 所述小麦麸皮培养基中中脱 脂乳的质量百分比添加量为 1.0%， 所述小麦麸皮培养基中葡萄糖的质量百分比添加量为 1.0%。 7. 如权利要求 3 所述的凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 将所得。

6、上清液经过精制干燥 即得。 8. 如权利要求 7 所述的凝乳酶的制备方法， 其特征在于， 所述精制干燥为真空冷冻干 燥， 冷冻干燥的温度为 -30 -20。 9. 如权利要求 3 8 任一项所述制备方法所得的凝乳酶。 10. 权利要求 1 所述交织顶孢霉 (Acremonium implicatum) 在制备干酪中的用途。 权 利 要 求 书 CN 103421696 A 2 1/7 页 3 一种产凝乳酶的交织顶孢霉及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种产凝乳酶的交织顶孢霉 (Acremonium implicatum) 及其应用。 背景技术 0002 凝乳是生产。

7、原制干酪关键步骤， 凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用， 并直接 关系到干酪的品质和得率。传统干酪加工中所使用的凝乳酶 （rennet） 来源于未断奶小牛 的第四胃 （皱胃） ， 主要由凝乳酶 （chymosin） 和胃蛋白酶 （pepsin） 组成。商业化的小牛皱 胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在 50 95%。凝乳酶介导凝乳反应涉及两个步骤 ：（1） 酶解 酪蛋白 ： 凝乳酶 （Chymosin,E.C.3.4.23.4） 对 -CN 具有高度特异性， 主要水解 -CN 中 的 Phe105-Met106的肽键， 生成由 106-109 残基氨基酸组成的 - 酪蛋白巨肽 （-casein mac。

8、ropeptide） 和由 1-105 残基氨基酸组成的副 - 酪蛋白 （para-casein） ， 凝乳酶也 能够水解 s1-CN、 s2-CN、 -CN ；（2） 当足够的 -CN 被水解时， 副 - 酪蛋白发生聚集形 成三维网状凝胶， Ca2+促发酪蛋白胶束聚集， 进而引起酪蛋白胶束失稳并形成干酪凝块。 0003 干酪加工中使用的凝乳酶的早在 50 多年前凝乳酶的需求已超过其产量， 与此同 时自1961年以来， 世界干酪产量大约增加了3.5倍， 小牛皱胃凝乳酶供应量确呈下降趋势， 目前， 世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的 20 30%。小牛皱胃凝 乳酶的供需矛盾和价。

9、格高昂、 宗教 （伊斯兰教和犹太教） 、 饮食 （素食主义） 以及食品法规等 因素， 使得寻求其替代物成为乳品领域科学研究的热点之一， 寻求小牛皱胃凝乳酶替代物 的研究主要动物、 植物、 基因重组以及微生物四个方面开展。 动物和植物来源的凝乳酶主要 用于特定种类的干酪， 其来源和产量同样受到限制 ； 利用基因重组技术制备的凝乳酶具有 成分单一等优点， 但是， 一些国家如法国、 德国和荷兰禁止使用重组凝乳酶。 0004 微生物能够产生许多种酶类， 其中绝大部分分泌量很小并涉及细胞代谢过程， 胞 外酶能够消化不溶的纤维素、 淀粉和蛋白质大分子物质， 并转移至胞内作为细胞生长的营 养物质。许多微生物。

10、， 尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性质， 较植 物和动物来源凝乳酶 （MCEs） ， 微生物来源的凝乳酶 （MCEs） 具有生产成本低、 具有更加广泛 的生化多样性以及简便的基因改造方法。微生物来源凝乳酶可分为两类 ：（a） 来源于曲霉 （Aspergillus spp.） 和根霉菌 （Rhizopus spp.） 的类胃蛋白酶 （pepsin-like） ，（b） 来源 于毛霉菌 （Mucorspp.） 、 根霉菌 （Rhizomucor spp.） 和板栗疫病菌 （Endothiaparasitica） 的 类 凝 乳 酶 （rennin-like） 。 目 前， 米 黑。

11、 根 毛 霉 （Rhizomucormiehei） 、 微 小 根 毛 霉 （Rhizomucorpusillus） 和板栗疫病菌 （Endotiaparasitica） 三种来源凝乳酶已用于大规模 商业化生产中， 已占到了全球蛋白酶市场的 33%。然而， 近年来微生物凝乳酶研究主要集中 在芽胞杆菌属 （Bacillus） ， 其蛋白酶通常具有较高的蛋白酶水解活力， 并耐热性较强、 不易 灭活， 导致蛋白质降解并转化为乳清， 因此， 对干酪得率具有负面作用， 只有部分适合于干 酪生产。尽管部分微生物凝乳酶已产业化， 筛选新型产凝乳酶的微生物菌种仍是该领域的 重要研究工作。 说 明 书 CN 1。

12、03421696 A 3 2/7 页 4 发明内容 0005 因此， 本发明要解决的技术问题就是针对目前干酪加工中使用的凝乳酶的来源和 产量严重不足的技术问题， 提供了一株新的交织顶孢霉 (Acremonium implicatum)HF， 以及 该菌株在制备凝乳酶和干酪中的应用。 0006 本发明人通过对巴氏杀菌后再待用过程中出现凝乳现象的牛乳进行菌种筛选， 获 得了一株产生凝乳酶的交织顶孢霉 (Acremonium implicatum)HF， 从而完成了本发明。 0007 为解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案之一是 ： 一株交织顶孢霉 (Acremonium implicatum)。

13、， 其中所述交织顶孢霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 其保藏编号为 CGMCC No.7620。 0008 将经过巴氏杀菌在待用过程中出现凝乳现象的牛乳进行梯度稀释至合适浓度并 将其涂布于脱脂乳琼脂平板上， 分别于2528和好氧培养。 于28好氧培养的脱脂乳 琼脂平板在培养两天后出现明显酪蛋白水解圈的菌落， 对这些菌落采用画线法进一步分离 纯化， 利用菌落形态及显微镜观察对其进行初步鉴定， 并初步确定具水解圈的菌株具有典 型的霉菌特征。 0009 本发明所述交织顶孢霉的形态学特征 ： 0010 菌落特征 ： 将菌株在 PDA 平板上划线分离， 25黑暗条件培养 10 天，。

14、 菌落直径 25mm， 质地丝绒状， 乳白色， 后期近粉色。 0011 菌体特征 ： 分生孢子梗发生于气生菌丝， 产孢细胞 （小梗）侧生， 锥形， 长或短， 12-201.5-2m。分生孢子顶生， 呈链状， 梭形， 长椭圆形， 无色， 光滑， 3.5-51-1.5m。 产生厚垣孢子， 褐色， 近球形， 直径 3-5m。 0012 为解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案之二是 ： 一种上述交织顶孢霉的培 养方法， 培养方法为 ： 将该交织顶孢霉在脱脂乳琼脂培养基中， 25 28培养 2 3 天即 得。 0013 其中所述脱脂乳琼脂培养基的组分为 ： 脱脂乳百分比含量较佳地为 1 1.5%， 。

15、最 佳地为 1.5%， 所述脱脂乳琼脂培养基中酪蛋白的百分比含量较佳地为 1 1.5%， 最佳地为 1%。 所述交织顶孢霉的培养温度较佳地为 ： 2528， 最佳地为28， 培养时间较佳地为 2 3， 最佳地为 3 天。 0014 为解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案之三是 ： 一种凝乳酶的制备方法， 包 括以下步骤 ： 利用小麦麸皮培养基培养上述交织顶孢霉， 25 28固态发酵 3 7 天， 将 含有菌丝体的小麦麸皮培养基按与水的体积比为 1:3 1:5 的比例加入水， 25 28， 160 180r/min 震荡培养 1 2 小时， 所得的水相在 -4 0， 8000 10000r/。

16、min 离心 后取上清液即得。 0015 其中所述培养温度较佳地为 25 28， 最佳地为 28， 小麦麸皮培养基中水分 按体积比的添加量较佳地为 1:3 1:5， 更佳地为 1 ： 4 1:5， 最佳地为 1 ： 4， 固态发酵较佳 地为 3 7 天， 更佳地为 4 6 天， 最佳地为 6 天。所述摇床的震荡速度较佳地为 160 180r/min， 最佳地为 180r/min， 培养时间较佳地为 1 2 小时， 最佳地为 1 小时， 离心温度 较佳地为 -4 0， 最佳地为 -4， 离心速度较佳地为 8000 10000r/min， 最佳地为 10000r/min。 说 明 书 CN 103。

17、421696 A 4 3/7 页 5 0016 其中所述小麦麸皮培养基中的水份添加量较佳地为 50% 200%， 小麦麸皮培养基 中脱脂乳的添加量较佳地为 0 1.0%， 最佳地为 1.0%， 小麦麸皮培养基中 0 葡萄糖的添加 量较佳地为 0 1.0%， 最佳地为 1.0%， 所述百分比均为质量百分比含量。 0017 其 中 所 述 精 制 干 燥 较 佳 地 为 真 空 冷 冻 干 燥， 冷 冻 干 燥 的 温 度 较 佳 地 为 -30 -20， 更佳地为 -30。 0018 为解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案之四是 ： 如上所述制备方法所得的 凝乳酶。本发明所得凝乳酶活力比普通。

18、的微生物来源的凝乳酶活力更高。 0019 为解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案之五是 ： 如上所述的交织顶孢霉 (Acremonium implicatum) 在制备干酪中的用途。 0020 在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可任意组合， 即得本发明各较佳实 例。 0021 本发明所用试剂和原料均市售可得。 0022 本发明的积极进步效果在于 ： 本发明所得菌株具有产凝乳酶的特征， 是一株新分 离鉴定的能够产凝乳酶的交织顶孢霉菌株， 具有独特的生理生化特征和遗传背景， 是一种 公认的安全菌种。所述菌株产生的凝乳酶可使液态奶在短时间内发生凝乳， 在原制干酪生 产加工方面具有广阔。

19、的应用前景。 0023 生物材料保藏信息 0024 本发明提供的交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） 菌株 HF， 已于 2013 年 4 月 15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） ， 保藏地址 ： 北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮政编码 ： 100101， 其保藏编号为 CGMCC No.7620。 附图说明 0025 以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。 0026 图 1 为本发明所述交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） HFCGMCC No.7620 的菌 落形态图。

20、。 0027 图 2 为本发明所述交织顶孢霉的细胞形态图。 0028 图 3 为本发明所述交织顶孢霉在乳平板上产生的水解圈形态图。 0029 图4为本发明所述交织顶孢霉18SrDNA PCR产物电泳图谱， 其中泳道1为18s rDNA 片段， 泳道 2 为 ITS 片段， 泳道 3 为 DNA Marker。 0030 图 5 为本发明所述交织顶孢霉 ITS 测序策略示意图。 具体实施方式 0031 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规方法和条件， 或按照商 品说明书选择。 0032 实施例 。

21、1 0033 本发明从经巴氏杀菌在待用过程中出现凝乳现象的牛乳中分离纯化出一株霉菌 HF， 利用形态特征、 生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性 18s rDNA 和 ITS 测序， 鉴 说 明 书 CN 103421696 A 5 4/7 页 6 定该霉菌 HF 为交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） ， 该菌株已于 2013 年 4 月 15 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC） ， 其保藏编号为 CGMCC No.7620。 0034 对经过巴氏杀菌并且在待用过程中出现凝乳现象的牛乳进行梯度稀释至合适浓 度 （10-4-10-。

22、5） 并将其涂布于脱脂乳琼脂平板上， 分别于 25和 28好氧培养。于 28好 氧培养的脱脂乳琼脂平板在培养两天后出现明显酪蛋白水解圈的菌落， 如图 3 所示。对这 些菌落采用画线法进一步分离纯化， 利用菌落形态及显微镜观察对其进行初步鉴定， 并初 步确定具水解圈的菌株具有典型的霉菌特征。 0035 本发明所述交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） HF， 其保藏编号为 CGMCC No.7620 的形态学特征是 ： 0036 菌落特征 ： 该菌株在 PDA 平板 （所述 PDA 平板的组分为 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 15-20g， 加水至 1L） 。

23、上划线分离， 25黑暗条件培养 10d， 菌落直径 25mm， 质地丝绒状， 乳白色， 后期近粉色， 其菌落形态如图 1 所示。 0037 菌体特征 ： 分生孢子梗发生于气生菌丝， 产孢细胞 （小梗）侧生， 锥形， 长或短， 12-201.5-2m， 分生孢子顶生， 呈链状， 梭形， 长椭圆形， 无色， 光滑， 3.5-51-1.5m， 如图 2 所示。产生厚垣孢子， 褐色， 近球形， 直径 3-5m。 0038 18s rDNA 测序 0039 由上海生工生物工程有限公司进行 18s rDNA 测序。基因组提取过程 ： 按照生工 SK1375 真菌基因组 DNA 抽提试剂盒说明书提取， 并对。

24、 18s rDNA 序列进行 PCR 扩增。 0040 PCR 反应 ： PCR 体系为 （25L） ： 0041 模板 （基因组） 1L 0042 上游引物 (10M) 0.5L 0043 下游引物 (10M) 0.5L 0044 dNTP 混合溶液 (10Mm)0.5L 0045 10Taq 反应缓冲液 2.5L 0046 Taq 酶 (5u/L) 0.2L 0047 加水至 25L 0048 PCR 程序为 ：（1） 预变性 94 5 分钟，（2） 94 30 秒，（3） 55 35 秒 （4） 72 1 分 钟， 步骤 （2） （4） 重复 35 个循环，（5） 72延伸 8min。 。

25、0049 18s rDNA 测序引物序列 ： 0050 NS1（上游引物） 5 -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 （SEQ ID NO ： 1） ； 0051 NS6（下游引物） 5 -GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3 （SEQ ID NO:2） 。 0052 所得18s rDNA的PCR反应产物经凝胶电泳分析， 结果为1340bp （如图4所示） ， 将产 物经过胶回收测序， 将测序结果与 NCBI 基因数据库进行比对后与交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） 基因组 18s rDNA 序列相匹配。 0053 ITS 测序 0054 由上海。

26、生工生物工程有限公司和中国科学院微生物研究所分别进行两次 ITS 测 序， ITS 测序策略如图 5 所示。 0055 基因组提取过程 ： 按照生工 SK1375 真菌基因组 DNA 抽提试剂盒说明书提取， 并对 说 明 书 CN 103421696 A 6 5/7 页 7 ITS区间序列进行PCR扩增， 所述ITS区间序列包括 ： 部分18SrDNA序列 （131bp） ， ITS1序 列 （32172bp） ， 5.8SrDNA序列 （173329bp） ， ITS2序列 （330477bp） 以及部分28SrDNA 序列 （478 502bp） 。 0056 PCR 反应 ： PCR 体。

27、系为 （25L） ： 0057 模板 （基因组） 1L 0058 上游引物 (10M) 0.5L 0059 下游引物 (10M) 0.5L 0060 dNTP 混合溶液 (10Mm each)0.5L 0061 10Taq 反应缓冲液 2.5L 0062 Taq 酶 (5u/L) 0.2L 0063 加水至 25L 0064 PCR 程序为 ：（1） 预变性 94 5 分钟，（2） 94 30 秒，（3） 55 35 秒 （4） 72 1 分 钟， 步骤 （2） （4） 重复 35 个循环，（5） 72延伸 8 分钟。 0065 ITS 引物序列 ： ITS1（上游引物） ： 5-TCCGTA。

28、GGTGAACCTGCGG-3 ， 其序列如序列表中 SEQ ID NO:3 所示， 0066 ITS4（下游引物） ： 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ， 其序列如序列表中 SEQ ID NO:4 所示。 0067 DNA 琼脂糖切胶纯化 0068 将 PCR 产物经凝胶电泳分析， 结果显示 ： PCR 产物片段长度为 585bp， 如图 4 所示 （其中泳道 1 为 18s rDNA 片段， 泳道 2 为 ITS 片段， 泳道 3 为 DNA Marker） ， 切割所需 DNA 目 的条带， 纯化产物， 测序结果经 NCBI 数据库比对， 与交织顶孢霉 （Acremo。

29、nium implicatum） 基因组相同， 将该菌株命名为交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） HF， 并将所得菌株保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （简称 CGMCC） ， 其保藏编号为 CGMCC No.7620。 0069 实施例 2 0070 将培养 5 天的交织顶孢霉 （Acremonium implicatum） HFCGMCC No.7620 斜面接入 3mL无菌去离子水， 制备孢子悬浮液， 吸取2mL接种至含有15g小麦麸皮培养基中并混匀， 于 28， 相对湿度为 70% 的条件下， 进行固态发酵 3 天。其中小麦麸皮培养基的水份百分。

30、比含 量为小麦麸皮重量的 50%， 脱脂乳含量为 0， 葡萄糖含量为 0。 0071 培养结束后， 称取 5g 培养好的含有菌丝体的小麦麸皮培养置于 250mL 含有玻璃 珠的锥形瓶中， 按 1:3 比例的加入去离子水， 28， 180r/min 摇床 1h， 所得的水相经 -4， 10000r/min 离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。 0072 将制备得到的 500L 的粗酶液按照下述方法进行凝乳实验 ： 0073 将脱脂奶粉以 10%（w/v） 的比例配置成 pH6 含有 10mmol/L CaCl2的溶液， 在 35 水浴中孵育10min后， 将500L的凝乳酶加入至35的10m。

31、L脱脂乳溶液中， 每15s将样品 取出并倾斜 45观察样品组织状态， 以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1 个凝乳酶 单位 （Soxhlet unite， SU） 定义为 35条件下， 使 1mL 脱脂乳在 40min 发生凝乳所需的酶 量。 说 明 书 CN 103421696 A 7 6/7 页 8 0074 0075 T凝乳时间， 秒 0076 VS底物体积， mL 0077 VE酶液体积， mL 0078 D稀释倍率 0079 测得的凝乳时间为 315 秒， 计算得到的粗酶液凝乳酶活力为 152SU/mL。 0080 实施例 3 0081 将培养 5 天的交织顶孢霉 （Acremon。

32、ium implicatum） HFCGMCC No.7620 斜面接入 3mL无菌去离子水， 制备孢子悬浮液， 吸取2mL接种至含有15g小麦麸皮培养基中并混匀， 于 25， 相对湿度为 70% 的条件下， 进行固态发酵 7 天。其中， 小麦麸皮培养基的水份百分比 含量为小麦麸皮重量的 50%， 脱脂乳的百分比含量为 0.45%， 葡萄糖的百分比含量为 0.45%。 0082 培养结束后， 称取 5g 培养好的含有菌丝体的小麦麸皮培养置于 250mL 含有玻璃 珠的锥形瓶中， 按 1:5 比例的加入去离子水， 25， 160r/min 摇床 2h， 所得的水相经 0、 8000r/min 离。

33、心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。将制备得到的 500L 的粗酶液， 按照实施例 3 所述方法进行凝乳实验， 测得的凝乳时间为 296s， 计算得到的粗酶液凝乳酶 活力为 162SU/mL。 0083 实施例 4 0084 将培养 5 天的交织顶孢霉斜面接入 3mL 无菌去离子水， 制备孢子悬浮液， 吸取 2mL 接种至含有 15g 小麦麸皮培养基中并混匀， 于 28、 相对湿度为 70% 的条件下， 进行固态发 酵 5 天。其中， 小麦麸皮培养基的水份含量为小麦麸皮重量的 200%， 脱脂乳为 1.0%， 葡萄糖 为 1.0%。 0085 培养结束后， 称取 5g 培养好的含有菌丝体的小。

34、麦麸皮培养置于 250mL 含有玻璃 珠的锥形瓶中， 按 1:4 比例的加入去离子水， 28、 180r/min 摇床 2h， 所得的水相经 -4、 10000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。 将制备得到的500L的粗酶液， 按照实施例 2 所述的方法进行凝乳实验， 测得的凝乳时间为 1260s， 计算得到的粗酶液凝乳 酶活力为 38SU/mL。 0086 实施例 5 0087 将培养 5 天的交织顶孢霉菌斜面接入 3mL 无菌去离子水， 制备孢子悬浮液， 吸取 2mL 接种至含有 15g 小麦麸皮培养基中并混匀， 于 28、 相对湿度为 70% 的条件下， 进行固 态发酵 。

35、5 天。其中， 小麦麸皮培养基的水份含量为小麦麸皮重量的 50%， 脱脂乳为 1.0%， 葡 萄糖为 1.0%。 0088 培养结束后， 称取 5g 培养好的含有菌丝体的小麦麸皮培养置于 250mL 含有玻璃 珠的锥形瓶中， 按 1:4 比例的加入去离子水， 28、 180r/min 摇床 1h， 所得的水相经 -4、 10000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。 将制备得到的500L的粗酶液， 按照实施例 2 所述的方法进行凝乳实验， 测得的凝乳时间为 60s， 计算得到的粗酶液凝乳酶 活力为 800SU/mL。 0089 对比实施例 1 0090 将500L其他微生物来源的。

36、粗酶液按照实施例2所述方法进行凝乳实验， 所得粗 说 明 书 CN 103421696 A 8 7/7 页 9 酶液的凝乳酶活力数据如表 1 所示 ： 0091 表 1. 其他微生物来源的粗酶液凝乳酶活力测试结果 0092 微生物粗酶液酶活 Mucor rouxii11.90SU/mL Penicilliumoxalicum216.8SU/mg Nocardiopsis spp.34.7SU/mL 0093 表 1 所述微生物 Mucor rouxii 请参考文献 1 ： Yu P J,Chou C C.Factors affecting thegrowth and production of。

37、 milk clotting enzyme by Amylomycesrouxii in rice liquid mediumJ.Food Technology and Biotechnology,2005,43(3):283-288. 0094 表1所述微生物Penicilliumoxalicum请参考文献2 ： Hashem MA.Purification and properties of a milk clotting enzyme producedbyPenicilliumoxalicumJ. Bioresource Technology,2000,75(3):219222. 009。

38、5 表 1 所述微生物 Nocardiopsis spp. 请参考文献 3 ： Cavalcanti MTH,Martinez CR,Furtado VC,Neto BB,Teixeira MF,Lima Filho JL,Porto ALF.Milk-clotting protease production by Nocardiopsis sp.in an inexpensive mediumJ.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005,21(2):151-154. 0096 从上述实验结果中可以看出， 利用本发明所述交织顶孢霉制备的凝乳酶的活力比 其他微生物来源的凝乳酶的活力高出数十倍甚至数百倍之多， 填补了凝乳酶制备领域的巨 大空白。 0097 应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 103421696 A 9 1/2 页 10 0001 序 列 表 CN 103421696 A 10 2/2 页 11 0002 序 列 表 CN 103421696 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103421696 A 12 。