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1、(10)申请公布号 CN 103436512 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436512 A *CN103436512A* (21)申请号 201310366716.9 (22)申请日 2013.08.21 C12N 9/66(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (71)申请人 山东省农业科学院生物技术研究中 心 地址 250100 山东省济南市历城区工业北路 202 号 (72)发明人 边斐 毕玉平 彭振英 马德源 杨连群 范仲学 陈高 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代。
2、理人 宋玉霞 (54) 发明名称 一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的 方法 (57) 摘要 本发明提供一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法。利用定点突变技术， 通过缺失 催化腔附近的单个盐键， 本发明提高了 PAE 的活 力， 本发明不但对揭示 M4 家族金属蛋白酶的结构 和功能关系具有重要意义， 同时， 由于很多 M4 家 族蛋白酶是重要的医学、 工业用酶， 因此本发明对 该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开 发也具有重要指导意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 12 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申。
3、请 权利要求书2页 说明书12页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103436512 A CN 103436512 A *CN103436512A* 1/2 页 2 1.一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特征在于， PAE中残基正负电荷 间距离小于 4 ?， 不考虑 His 形成的盐键之外含有 6 个盐键， 盐键 1-3 位于催化腔附近， 盐 键 4-6 位于 C 端结构域的 C 末端， 将形成盐键 2 的 Asp189-Arg179 中的 Asp189 进行定点突 变， 提高 PAE 比活力。 2. 根据权利要求1所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特。
4、征在 于， 将形成盐键 2 的 Asp189-Arg179 中的 Asp189 定点突变为 Ala， 构建突变体 D189A。 3. 根据权利要求2所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特征在 于， 突变体 D189A 的引物 ： 两端引物 ： 正向引物 ： GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC， 划横线部分表示 Nde I 酶切位 点 ； 反向引物 ： CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG， 划横线部分表示 Xho I 酶切位点 ； D189A 中间引物 ： 3 端引物 ： TTCCTGATCGGCTACGCGATC。
5、AAGAAGGGCAGCG 5 端引物 ： GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。 4. 根据权利要求 3 所述的一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法， 其特征在 于， 突变体的原核表达为 ： 以含 Nde I 酶切位点的正向引物和突变体中间引物的 3 引物为两端引物， 以lasB 质粒为模板， 扩增产物标为 ； 以含 Xho I 酶切位点的反向引物和突变体中间引物的 5 引 物为两端引物， 以lasB质粒为模板， 扩增产物标为 ； 回收和， 通过 PCR 反应程序， 将基因和 基因相互融合 ； 最后再加入两侧正、 反向引物通过 PCR 反应程。
6、序， 得到突变体基因。 5. 根据权利要求4所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特征在 于， 有酶活突变体的筛选 ： 利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物， EB 染色， 切取目的片段大小的 DNA， 回收 DNA ； DNA 用限制性内切酶 Nde 和 Xho 酶切， 连接同样酶切过的 pET-22b 表达载体 ； 连接产物转化E. coli DH5； 从转化平板上挑取转化子至液体 LB 培养基中培养， 利用提质粒酶切验证的方法筛 选携带目的基因的转化子 ； 将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)； 从平板上挑取转化子单菌落到试管中， 37?C。
7、 过夜培养后按 1% 接种量转接到三角 瓶中， 37?C 培养至 OD600 1.0 左右加入终浓度 1 mM 的 IPTG 继续培养过夜 ； 发酵液离心收集菌体， 菌体用三蒸水洗涤 3 遍以上后用 50 mM,pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液重悬， 超声破碎至菌液澄清， 超声完毕后离心， 上清在 30?C 保温 2 h ； 用 Folin 酚法测粗酶液酶活。 6. 根据权利要求5所述的一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特征在 于， 步骤发酵液离心收集菌体， 超声破碎条件为 ： 功率300 w， 超声5 s， 间隔10 s， 超声10 次。 7. 根据权利要求6所述的。
8、一种通过缺失单个盐键来提高PAE比活力的方法， 其特征在 权 利 要 求 书 CN 103436512 A 2 2/2 页 3 于， 重组酶分离纯化 ： 按 1% 接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli BL21(DE3)， 当菌浓 OD600=1.0 时， 添加终浓度 1 mM IPTG， 在 37?C， 160-180 rpm 诱导 12 h ； 发酵液离心收集菌体， 用 50 mM,pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液重溶菌体， 超声破碎 ； 超 声完毕后离心， 上清在 30?C 保温 2 h 后用 60% 硫酸氨沉淀过夜 ； 沉淀的蛋白用 Tris-HCl 缓冲液重溶、 透。
9、析， 进行 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子 交换层析分离 ； 测各收集管中样品的酶活， 酶活高的组分进行 SDS-PAGE 分析， 收集电泳纯的酶组分 混合， 装在透析袋里用 pH 8.0, 50 mM 的 Tris-HCl 缓冲液透析后分装。 8. 根据权利要求 7 所述的一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法， 其特征在 于， 步骤发酵液离心收集菌体， 超声破碎条件为 ： 功率 300 w， 超声 5 s， 间隔 10 s， 每 100 ml 菌体超声 30 次。 9. 根据权利要求 7 所述的一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法， 其特征在 。
10、于， 步骤 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱层析分离前， 先用 50 mM,pH 9.5 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 ； 洗脱时仍采用相同的缓冲系统， 梯度洗脱时 NaCl 浓度范围为 0-0.5 M。 权 利 要 求 书 CN 103436512 A 3 1/12 页 4 一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程方法提高酶活力技术领域， 特别是涉及一种通过缺失单个盐 键来提高 PAE 比活力的方法。 背景技术 0002 蛋白酶 （peptidase, proteases, proteinases 或 pro。
11、teolytic enzymes） 是一类 可催化蛋白质或肽类肽键水解的酶类。 0003 弹性蛋白 （elastin） 在动物组织中广泛存在， 如富有弹性的组织、 肺、 大动脉、 某些 韧带、 皮肤及耳部软骨等。弹性蛋白由多条弹性蛋白原 （tropoelastin） 多肽链以共价交联 方式连接而成 （Yeo et al., 2011） ， 具有非常稳定的结构， 而且不含常见蛋白酶识别的氨 基酸和酶切位点， 使得弹性蛋白只能被弹性蛋白酶分解。能够水解弹性蛋白的蛋白酶称为 弹性蛋白酶 （elastase） 。 0004 按照来源分， 弹性蛋白酶可分为微生物弹性蛋白酶和动物弹性蛋白酶。其中， 哺 乳。
12、动物弹性蛋白酶主要存在于动物的胰腺和吞噬细胞中 （Horwitz et al., 1999; Mason et al., 1986; Bode et al., 1989; Antonicelli et al., 2007） 。 研究比较多的细菌来 源的弹性蛋白酶有金属蛋白酶 M4 家族的 PAE/pseudolysin (Morihara and Homma,1985) 和 vibriolysin（Lutfullah et al., 2008） 、 M9 家族的 MAP1 peptidase(Dumont et al., 1994)、 M12家族的myroilysin(Chen et al.,。
13、 2009a)、 M23家族的staphylolysin （Kessler and Ohman, 2004b） 和丝氨酸蛋白酶 S8 家族的 A1p1（Behnsen et al., 2010） 等。 0005 弹性蛋白酶在医学、 食品学和日用化学上有着广泛应用。在医药方面主要作为治 疗药物 ：（1） 治疗高脂血症，（2） 防治动脉粥样硬化，（3） 抑制脂肪肝发展，（4） 治疗慢性气 管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病，（5） 外用于消除皮肤焦痂、 碎屑， 用于烧伤患者的治 疗以及皮肤溃疡、 口腔溃疡等症。 在食品工业方面常用于对动物难以处理和食用的韧带、 大 动脉血管、 筋腱等蛋白质废料进行加。
14、工。 日用化学工业方面， 弹性蛋白酶主要用于疗效化妆 品的生产。 0006 PAE （Pseudomonas aeruginosa Elastase, pseudolysin）是革兰氏阴性机会 致病菌铜绿假单孢菌 （Pseudomonas aeruginosa, PA）分泌的一种胞外弹性蛋白酶， 可 以降解酪蛋白、 血红蛋白、 卵清蛋白、 纤维蛋白等。在底物特异性方面， PAE 倾向降解 P1 位为疏水或芳香族氨基酸的肽键 （Morihara 1995; Morihara et al., 1965） 。目前， 已 经商品化的 PA 来源的 PAE 售价昂贵， EPC 公司 （Elastin P。
15、roducts Company Inc.）每 0.1 mg PAE 售价 183 美元 （PE961， https:/www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/ Metalloproteinases/CategoryID/19/Default.aspx） ， Merck 公司每 0.1mg PAE 售价 4500 元人民币 （324676-100UG， http:/www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug） 。 PAE 能够在原核细胞和真核细胞中异源表达并且重组酶有酶活 （Ogino,H. et al., 20。
16、00; Lin et al., 2009） 。 我们前期研究表明将构建好的含lasB基因的表达载体转化至E.coli BL21(DE3) 中， 1 L 培养物细胞经超声破碎和柱层析纯化后， 可获得纯酶 4.5 mg， 总酶活 说 明 书 CN 103436512 A 4 2/12 页 5 285984 个酶活单位 （酶活力定义为 60 ?C， 每分钟催化酪蛋白水解生成 1 g 酪氨酸的酶 量为 1 个单位 U） （Xie et al., 2009） 。 0007 作为 PA 分泌的主要胞外内切蛋白酶以及它本身的降解宿主蛋白的能力， PAE 可 以用作模式蛋白来生产特殊的蛋白酶抑制剂， 用于疾病。
17、治疗 (Jan Potempa and Robert N. Pike, 2009 ； Maciej Sataga et al., 2013)。PAE 具有在有机溶剂中仍能保持高活性和热 稳定性的特性使得其在工业催化方面具有巨大的应用潜力。Ogino 通过构建 Cys30-Cys58、 Cys270-Cys297 二硫键缺失的 PAE 突变体证实了 Cys30-Cys58 二硫键对维持 PAE 在有机溶 剂中的热稳定性有重要意义 （Ogino H. et al., 2001） ， Lousa,D. 利用分子动力学模拟验 证了上述结论 （Lousa,D. et al., 2012） 。将 PAE 。
18、的 114 位 Tyr 突变为 Phe 使得突变体在 有机溶剂环境中催化合成阿巴斯甜前体时具有与 thermolysin 相同的活力， 而将 Tyr 突变 为 Ser 和 Arg 后这种活力提高得更明显 （Ogino et al., 2010） 。利用定点突变技术研究 PAE 的活性和稳定性的研究主要集中在上述文献中。 0008 Thermolysin与PAE同为金属蛋白酶M4家族的蛋白酶， 两者不仅序列相似性很高， 而且具有几乎完全一致的三维结构 （Holmes and Matthews,1982; Thayer et al., 1991） ： N 端结构域主要由反向-片层构成， C 端结构。
19、域由-螺旋组成， 两个结构域之间有一个 催化腔， 结合 Zn 的残基与结合底物的残基都位于催化腔内壁上 （图 1） 。利用定点突变技术 对 thermolysin 的活性和热稳定性进行研究的例子非常多。例如， thermolysin N 端结构 域 G8C/N60C/S65C 三个位点的同时突变使得突变体中结合 Ca 的残基与 Ca 的亲和力增强而 导致突变体的热稳定性增强 （Kawasaki Y. et al., 2013; Yasukawa K. and Inouye K., 2007） 。Thermolysin N 端结构域中连接 2 个反向 - 片层的 Asn116-Gly117 转角。
20、中的 Asn 残基对稳定thermolysin的发卡结构至关重要， Asn突变为Asp后导致thermolysin突变 体活性提高同时热稳定性降低 （Menach E. et al., 2012） 。在前期研究单点突变 （L144S， D150E， I168A） 提高 thermolysin 的活性和单点突变 （S53D， L155A） 提高 thermolysin 稳定 性的基础上， Kusano M （2010） 研究了双突和三突产生的突变体的活性和稳定性的变化， 发 现L144S/D150E突变体活性最高， S53D/L155A突变体热稳定性最好， L144S/D150E/ S53D突 。
21、变体的活性和热稳定性都提高了， 这些多突变体的效果是单突的叠加 （Kusano M. et al., 2010） 。通过对 thermolysin 活性中心附近的几个结构域， 包括 N 端 片层、 2 个 - 螺旋 和 C 端 2 个 loop 上氨基酸残基的单点突变， Kusano M. 等揭示了 N 端 片层和 2 个 - 螺 旋对thermolysin的催化至关重要， 而C端2个loop负责了酶对底物的识别 （Kusano M. et al., 2009） 。 通过将thermolysin中的Ser残基突变为Asp来向thermolysin引入负电荷， 研究发现在高盐条件下大多数突变体的。
22、催化效率kcat/km提高了， 在 10 mM CaCl2条件下两 个突变体S53D和S65D的热稳定性也有所提高 （Takita T. et al., 2008） 。 将thermolysin 的一个自溶位点 Gly154-Leu155 中的 Leu155 分别突变为 Ala/Ser/Phe/Gly 后， 各突变体的 热稳定性都有所提高， 但同时产生了新的自溶位点 （Matsumiya Y. et al., 2004） 。 0009 前期生化实验、 分子动力学模拟和计算分析表明， 盐键的差异很可能是 PAE 与同 源酶之间热稳定性差异的主要原因 （Xie et al., 2009） 。但结合。
23、文献发现， 目前对 PAE 的 活性和热稳定性的研究很少， 对M4家族中研究更深入的模式蛋白酶thermolysin的活性和 热稳定性的研究也并未把盐键的作用深入分析。 说 明 书 CN 103436512 A 5 3/12 页 6 发明内容 0010 针对上述 PAE 的研究现状， 本发明提供了一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比 活力的方法。利用定点突变技术， 通过缺失催化腔附近的单个盐键， 本发明提高了 PAE 的 活力， 对形成盐键 2（Asp189 Arg179） 的 Asp189 定点突变为 Ala， 构建突变体 D189A， 在 E.coli中异源表达并测得 D189A 仍具有。
24、蛋白酶活力。将 D189A 利用 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离纯化， 获得了电泳纯的重组酶。Folin- 酚法测定 D189A 和 PAE 水 解酪蛋白的酶活， 在 60 ?C 条件下 D189A 比 PAE 的比活力提高了 30%。本发明不但对揭示 M4 家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义， 同时， 由于很多 M4 家族蛋白酶是重要 的医学、 工业用酶， 因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具 有重要指导意义。 0011 本发明的一种通过缺失单个盐键来提高 PAE 比活力的方法技术方案为， 通过缺失 催化腔附近的单个盐键， 。
25、提高 PAE 的比活力。 0012 如说明书附图图 1 所示， PAE 中含有 6 个盐键 （残基正负电荷间距离小于 4 ?， 不 考虑 His 形成的盐键） 。将 PAE 与同源蛋白进行序列比对分析表明， 盐键 1、 2 和 6 是保守存 在的， 说明这些盐键对维持 PAE 的活性起重要作用。PAE 中的 6 个盐键分属两个区域， 盐键 1-3 位于催化腔附近， 盐键 4-6 位于 C 端结构域的 C 末端。催化腔附近的 3 个盐键都位于稳 定性很差的 loop 区或相邻区域。 0013 形成盐键1-3的氨基酸在PAE一维序列中的位置 （盐键1 ： Asp168-Arg198 ； 盐键2 ：。
26、 Asp189-Arg179 ； 盐键 3 ： Asp201-Arg205） 如下 ： 将形成盐键 2 的 Asp189-Arg179 中的 Asp189 进行定点突变， 提高 PAE 比活力。 0014 将形成盐键 2 的 Asp189-Arg179 中的 Asp189 定点突变为 Ala， 构建突变体 D189A。 0015 突变体 D189A 的引物 ： 两端引物 ： 正向引物 ： GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC， 划横线部分表示 Nde I 酶切位 点 ； 反向引物 ： CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG， 划横线部分表。
27、示 Xho I 酶切位点 ； D189A 中间引物 ： 3 端引物 ： TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG 5 端引物 ： GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。 0016 突变体的原核表达为 ： 以含 Nde I 酶切位点的正向引物和突变体中间引物的 3 引物为两端引物， 以lasB 质粒为模板， 扩增产物标为 ； 以含 Xho I 酶切位点的反向引物和突变体中间引物的 5 引 说 明 书 CN 103436512 A 6 4/12 页 7 物为两端引物， 以lasB质粒为模板， 扩增产物标为 ； 回收和， 通过 PCR。
28、 反应程序， 将基因和 基因相互融合 ； 最后再加入两侧正、 反向引物通过 PCR 反应程序， 得到突变体基因。 0017 有酶活突变体的筛选 ： 利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物， EB 染色， 切取目的片段大小的 DNA， 回收 DNA ； DNA 用限制性内切酶 Nde 和 Xho 酶切， 连接同样酶切过的 pET-22b 表达载体 ； 连接产物转化E. coli DH5； 从转化平板上挑取转化子至液体 LB 培养基中培养， 利用提质粒酶切验证的方法筛 选携带目的基因的转化子 ； 将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)； 从平板上挑取转化子单菌落到试管中，。
29、 37?C 过夜培养后按 1% 接种量转接到三角 瓶中， 37?C 培养至 OD600 1.0 左右加入终浓度 1 mM 的 IPTG 继续培养过夜 ； 发酵液离心收集菌体， 菌体用三蒸水洗涤 3 遍以上后用 50 mM,pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液重悬， 超声破碎至菌液澄清， 超声完毕后离心， 上清在 30?C 保温 2 h ； 用 Folin 酚法测粗酶液酶活。 0018 步骤发酵液离心收集菌体， 超声破碎条件为 ： 功率 300 w， 超声 5 s， 间隔 10 s， 超声 10 次。 0019 重组酶分离纯化 ： 按 1% 接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli B。
30、L21(DE3)， 当菌浓 OD600=1.0 时， 添加终浓度 1 mM IPTG， 在 37?C， 160-180 rpm 诱导 12 h ； 发酵液离心收集菌体， 用 50 mM,pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液重溶菌体， 超声破碎 ； 超 声完毕后离心， 上清在 30?C 保温 2 h 后用 60% 硫酸氨沉淀过夜 ； 沉淀的蛋白用 Tris-HCl 缓冲液重溶、 透析， 进行 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子 交换层析分离 ； 测各收集管中样品的酶活， 酶活高的组分进行 SDS-PAGE 分析， 收集电泳纯的酶组分 混合， 装在透析袋里用 pH 8.0。
31、, 50 mM 的 Tris-HCl 缓冲液透析后分装。 0020 步骤发酵液离心收集菌体， 超声破碎条件为 ： 功率 300 w， 超声 5 s， 间隔 10 s， 每 100 ml 菌体超声 30 次。 0021 步骤 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析柱层析分离前， 先用 50 mM,pH 9.5 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 ； 洗脱时仍采用相同的缓冲系统， 梯度洗脱时 NaCl 浓度范围 为 0-0.5 M ； 本发明的有益效果为 ： 如说明书附图图 1 所示， 三维结构 （PDB ： 1EZM） 分析表明， PAE 中 含有 6 个盐键 （残基正负电。
32、荷间距离小于 4 ?， 不考虑 His 形成的盐键） 。将 PAE 与同源蛋 白进行序列比对分析表明， 盐键 1、 2 和 6 是保守存在的， 说明这些盐键对维持 PAE 的活性起 重要作用。PAE 中的 6 个盐键分属两个区域， 盐键 1-3 位于催化腔附近， 盐键 4-6 位于 C 端 结构域的 C 末端。催化腔附近的 3 个盐键都位于稳定性很差的 loop 区或相邻区域。盐键 1 的残基 Asp168 位于 3 上， 残基 Arg198 位于 loop 上， 盐键 1 把该 loop “锚定” 到稳定的 3 上， 因此， 对整个区域的稳定性具有很大的贡献。盐键 2 所在的 loop 弯成。
33、 “U” 型， Ca 2+ 离子同时与该 “U” 型 loop 底部的残基和 3 上的残基形成离子键， 把该 “U” 型 loop 锚定 说 明 书 CN 103436512 A 7 5/12 页 8 到 3 上从而对 PAE 三维结构起稳定作用， 而盐键 2 正处在 “U” 型 loop 的开口处稳定 “U” 型结构， 从而对整个 PAE 结构的稳定起作用。 0022 实验结果表明位于PAE催化腔附近的保守盐键1和2对维持PAE的活性非常重要。 Asp168-Arg198 形成盐键 1， 无论将盐键 1 的成键氨基酸中的任何一个氨基酸突变为 Ala 造 成该盐键的缺失， 突变体都没有活力。盐。
34、键 1 为维持 PAE 活力所必须。Asp189 Arg179 形成盐键 2， Asp189 位于 loop 上， Arg179 位于 3 上， 这两个氨基酸分别突变成 Ala 造成 盐键 2 的缺失， 对 PAE 的影响是不同的。位于 3 上的 Arg 突变成 Ala（R179A） ， 突变体失 活 ； 位于 loop 上的 Asp 突变成 Ala(D189A)， 突变体仍具有水解酪蛋白的活力， 且在 60 ?C 的比活力比 PAE 提高了 30%。盐键被认为是稳定 PAE 结构的重要因素， 盐键 2 缺失后， 突变 体 D189A 刚性结构减弱， 柔性增强， 表现为对底物的催化效率提高。 。
35、0023 综上， 盐键 1 为维持 PAE 活性所必须， 缺失该盐键后， 突变体失活 ； 盐键 2 虽是保守盐 键， 但并非维持 PAE 活性所必须。缺失盐键 2 后， 突变体 D189A 仍具有水解酪蛋白的活力， 并且， D189A 在最适酶活温度下的比活力比 PAE 提高 30%。 0024 本发明不但对揭示 M4 家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义， 同时， 由 于很多 M4 家族蛋白酶是重要的医学、 工业用酶， 因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研 究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。 0025 附图说明 ： 图 1 所示为 PAE 结构中的盐键 (PDB ： 1EZM) 。
36、； 图 2 所示为为缺失催化中心附近的保守盐键 1 和 2 的 4 个突变体的 PCR 结果， 1 为靠近 5 的 PCR 产物， 2 为靠近 3 的 PCR 产物， 3 为突变体 PCR 产物 ； 图 3 所示为双酶切筛选携带目的基因的转化子 ； 图 4 所示为 SDS-PAGE 分析盐键缺失突变体的发酵液超声破碎结果， 其中， 标注 + 的表 示有酶活的突变体 ； 图 5 所示为 SDS-PAGE 分析纯化后的 PAE 和突变体 D189A 的纯度 ( 蛋白浓度 0.18 mg/ ml) ； 图 6 所示为 PAE 与 D189A 酶活曲线比较。 0026 具体实施方式 ： 为了更好地理解。
37、本发明， 下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案， 但是本发明 并不局限于此。 0027 实施例 突变体原核表达及有酶活突变体的筛选 如说明书附图图 1 所示， PAE 中含有 6 个盐键 （残基正负电荷间距离小于 4 ?， 不考虑 His 形成的盐键） 。PAE 中的 6 个盐键分属两个区域， 盐键 1-3 位于催化腔附近， 盐键 4-6 位 于 C 端结构域的 C 末端。通过丙氨酸扫描定点突变 （Alanine scanning mutagenesis） 对催 化腔附近的 2 个保守盐键， 盐键 1 和 2 进行研究。将形成盐键 1 的 Asp168、 Arg198， 形成盐 键2 的A。
38、sp189、 Arg179分别突变为Ala， 构建4个单盐键缺失突变体 （D168A、 R198A、 D189A、 R179A） ， 并进行原核表达和重组蛋白酶活力的测定。 0028 (a) 突变体引物设计 ： 说 明 书 CN 103436512 A 8 6/12 页 9 引物设计利用 Primer Premier 5.0 软件完成。引物在华大基因 （BGI） 公司合成。 0029 两端引物 ： 正向引物 ： GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC， 划横线部分表示 Nde I 酶切位 点。 0030 反向引物 ： CGCGCTCGAGTTACAACGCGC。
39、TCGGGCAG， 划横线部分表示 Xho I 酶切位点。 0031 盐键 1 突变体引物设计 ： D168A 中间引物 ： 3 端引物 ： AACGAAGCGTTCTCCGCGATGGCCGGCGAGG 5 端引物 ： CTCGCCGGCCATCGCGGAGAACGCTTCGTTCATTCC R198A 中间引物 ： 3 端引物 ： GGCAGCGGTGCGCTGGCGTACATGGACCAGCCCAG 5 端引物 ： CTGGTCCATGTACGCCAGCGCACCGCTGCCC 盐键 2 突变体引物设计 ： D189A 中间引物 ： 3 端引物 ： TTCCTGATCGGCTACGCGA。
40、TCAAGAAGGGCAGCG 5 端引物 ： GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC R179A 中间引物 ： 3 端引物 ： GCCGAGTTCTACATGGCGGGCAAGAACGACTTCCTG 5 端引物 ： GTCGTTCTTGCCCGCCATGTAGAACTCGGCAGCCTC 实施例 2 上述突变体的原核表达为 ： 重叠延伸 PCR 技术 （gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR） 采用具有 互补末端的引物， 使 PCR 产物形成了重叠链， 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸 将不用。
41、来源的扩增片段重叠拼接起来。本发明所有突变体 DNA 片段的构建都采用此方法。 0032 以含 Nde I 酶切位点的正向引物和突变体中间引物的 3 引物为两端引物， 以 lasB质粒为模板， 扩增产物标为 ； 以含 Xho I 酶切位点的反向引物和突变体中间引物的 5 引物为两端引物， 以lasB质粒为模板， 扩增产物标为 ； 回收和， 通过PCR 反应程序 ： 98oC 变性30 sec ； 98oC 变性10 sec ； 60oC 退火30 sec ； 72oC 延伸 1 min， 7 个循环， 72oC 保温 7 min， 将基因和 基因相互融合 ； 最后再加入两侧正、 反向引物通过 。
42、PCR 反应程序 ： 98oC 变性 30 sec ； 98 oC 变性 10 sec， 60oC 退火30 sec， 72oC 延伸1 min， 30 个循环 ； 98oC 变性10 sec ； 72oC 延伸1 min ； 9 个循环， 72oC 保温 10 min， 得到突变体基因。 0033 实施例 3 有酶活突变体的筛选 ： 利用琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物， EB 染色， 在紫外灯下用刀片切取目的片段大小 的 DNA， 利用胶回收试剂盒回收 DNA ； DNA 用限制性内切酶 Nde 和 Xho 酶切， 连接同样酶切过的 pET-22b 表达载体 ； 连接产物转化E. coli。
43、 DH5，转化方法参照 分子克隆实验指南 （第三版） （上册） （萨姆布鲁克等， 2002） ； 说 明 书 CN 103436512 A 9 7/12 页 10 从转化平板上挑取转化子至液体 LB 培养基中培养， 利用提质粒酶切验证的方法筛 选携带目的基因的转化子 ； 将测序正确的含目的基因的质粒转化E. coli BL21(DE3)； 从平板上挑取转化子单菌落到 5 ml 液体 LB 试管中， 37?C 过夜培养后按 1% 接种 量转接到新鲜的30 ml 液体LB三角瓶中， 37?C 培养至OD600 1.0 左右加入终浓度1 mM 的 IPTG 继续培养过夜 ； 发酵液离心收集菌体， 菌。
44、体用三蒸水洗涤 3 遍后用 3 ml Tris-HCl 缓冲液 （50 mM， pH 8.0） 重悬， 超声破碎。超声破碎条件为 ： 功率 300 w， 超声 5 s， 间隔 10 s， 超声 10 次至 菌液澄清。超声完毕后离心， 上清在 30?C 保温 2 h ； 用 Folin 酚法测粗酶液酶活， 以 2% 酪蛋白为底物。用 50 mM Tris-HCl （pH 7.5） 将酶液稀释合适的倍数， 取 100 l 稀释好的酶液， 加入同样温度的底物 100 l， 特定温 度下反应10 min 后， 加入200 l 0.4 M 的三氯乙酸终止反应。 12,000 rpm 离心1 min， 取。
45、 100 l 上清液加入 500 l 0.4 M 的碳酸钠， 混匀后加入 100 l Folin 试剂， 混匀 后在40 ?C 保温20 min， 然后用分光光度计测定660 nm 处的吸光值。 标准曲线用不同浓 度的酪氨酸来制定。酶活力定义为在一定温度下， 每分钟催化酪蛋白水解生成 1 g 酪氨 酸的酶量为 1 个单位 （U） 。筛选出有酶活的突变体进行后续的酶学性质研究。 0034 实施例 2 和实施例 3 中使用载体和菌株 ： E. coli DH5： 基因型F- 80d lacZM15， (lacZYA-argF)U169， endA1， recA1， hsdR17 (rk-,mk+)。
46、， supE44， -， thi-1， gyrA96， relA1， phoA，购自 TransGen Biotech。 0035 E. coli BL21(DE3)： 基 因 型F- ompT hsdS (rB- mB-) gal dcm (DE3)，购 自 TransGen Biotech。 0036 LasB质粒 ： 本实验室保存。 0037 pET-22b （+） 载体 ： Ampr， T7 lac 启动子， 5.49 kb， 基因表达用载体， 购自Novagen。 0038 分子试剂及试剂盒 ： PCR用酶 ： Q5 High-Fidelity DNA Polymerases （Ne。
47、w England BioLabs Inc. #M0491） ， PCR 体系及 PCR 程序参照该产品说明书。 0039 限制性内切酶 ： Thermo Scientific FastDigest Nde I and Xho I。酶切体系 及酶切条件参照该产品说明书。 0040 DNA 电泳 ： DNA 琼脂糖凝胶电泳分子量 Marker、 10loading buffer(Takara) ； 琼脂糖 （上海生工） 。 0041 ampicillin(Amp)、 Isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ( 上海生 工 )。 0042 胶回收试剂盒 ：。
48、 Omega， D2500-01， 操作按照说明书进行。 0043 连接试剂盒 ： Takara DNA Ligation Kit Ver.2.1， 操作按照说明书进行。 0044 质粒提取试剂盒 ： 北京百泰克生物技术有限公司， 操作按照说明书进行。 0045 生化试剂 ： 均为国产分析纯。 0046 实施例 4 重组酶分离纯化 ： 按 1% 接种量扩大培养含各突变体质粒的E. coli BL21(DE3)， 当菌浓 OD600=1.0 时， 说 明 书 CN 103436512 A 10 8/12 页 11 添加终浓度 1 mM IPTG， 在 37?C， 160-180 rpm 诱导 1。
49、2 h ； 1 L 发酵液 12000rpm 离心 1 min 收集菌体， 用 100 ml Tris-HCl 缓冲液 (50 mM， pH 8.0)重溶菌体， 超声破碎。 超声破碎条件为 ： 功率300 w， 超声5 s， 间隔10 s， 每100 ml 菌 体超声 30 次。超声完毕后 12000rpm 离心 5 min， 上清在 30?C 保温 2 h 后用 60% 硫酸氨 沉淀过夜 ； 沉 淀 的 蛋 白 用 10 ml Tris-HCl 缓 冲 液 (50 mM， pH 9.5) 重 溶、 透 析， 进 行 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析分离。层析柱事先用 Tris-HCl 缓冲液 (50 mM， pH 9.5)。