一种花生四烯酸的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103451247 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451247 A *CN103451247A* (21)申请号 201310416765.9 (22)申请日 2013.09.13 C12P 7/64(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明南路 422 号 (72)发明人 卢英华 曾思钰 凌雪萍 敬科举 吴意珣 陈翠雪 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人 马应森 (54) 发明名称 一种花生四烯酸的制备方法 (5。

2、7) 摘要 一种花生四烯酸的制备方法， 涉及花生四烯 酸。 对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化， 在 基础培养基分批发酵， 在优化培养基中以酵母粉 和玉米浆为氮源分批发酵， 再以酵母粉为氮源进 行的发酵罐放大实验， 对高山被孢霉在优化培养 基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养， 将 优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉， 得 混合氮源优化培养基 ； 对高山被孢霉在混合氮源 优化培养基中分批发酵 ； 对高山被孢霉高糖驯化 及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中分批 发酵， 在当葡萄糖浓度降至10g/L时， 流加600g/L 葡萄糖， 使残糖控制在10g/L左右， 培养168h后开 始收获。

3、干菌体、 油脂和 ARA。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103451247 A CN 103451247 A *CN103451247A* 1/2 页 2 1. 一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1）通过摇瓶实验对高山被孢霉产 ARA 的培养条件进行优化， 所述优化的方法为取 4mL 种子液接入装有 50mL 基础培养基 （葡萄糖 40g/L ； 酵母粉 5g/L ； MgSO4-7H2O0.1g/L ；。

4、 KH2PO40.5g/L ； CaCO30.05g/L ； ZnSO4-7H2O0.1g/L ； pH6.0）的 250mL 三 角 瓶， 28 、 150rpm 培养 5 6d， 得到优化培养基 ： 葡萄糖 60g/L ； 酵母粉或玉米浆 10g/L ； 谷氨酸 1.0g/L ； MgSO4-7H2O0.1g/L ； KH2PO42.0g/L ； CaCO30.05g/L ； ZnSO4-7H2O0.1g/L ； 混合微量元素 1mL/L ； 混合维生素 1mL/L ； pH 调至 6.0 ； 2） 对高山被孢霉在基础培养基中进行了 2L 分批发酵， 培养至第 168h， 开始收获菌体， 。

5、获得干菌体、 油脂和 ARA ； 3） 对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了 2L 分批发酵， 再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验， 菌体生长正常， 未发生自溶现象， 并获得干菌 体、 油脂和 ARA ； 4） 对高山被孢霉在优化培养基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养， 将步骤 1） 中 的优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉， 得混合氮源优化培养基 ； 5） 对高山被孢霉在混合氮源优化培养基中进行 2L 分批发酵， 在 2L 发酵罐中装入混合 氮源优化培养基， 培养 168h 后收获干菌体、 油脂和 ARA ； 6） 对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混。

6、合氮源优化培养基中进行 2L 分 批发酵， 在当葡萄糖浓度降至 10g/L 时， 流加 600g/L 葡萄糖， 使残糖控制在 10g/L 左右， 其 余操作过程与步骤 5） 相同， 培养 168h 后开始收获干菌体、 油脂和 ARA。 2. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 1） 中， 所述混合 微量元素包括 FeCl36H2O,、 H3BO3、 MnCl24H2O、 CoCl26H2O、 CuSO45H2O、 NiSO46H2O。 3. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 1） 中， 所述混合 维生素包括维生素 B12、 生物素、。

7、 维生素 B1、 泛酸钙。 4. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 2） 中， 所述发酵 的条件为 ： 将培养 3d 的液体种子， 按 10% 接种量接种于基础培养基中， 装液量 1.5L， 初始葡 萄糖浓度为 60g/L， 在 28， 搅拌转速 200rpm， 通气量 1vvm。 5. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 3） 中， 所述发酵 的条件与步骤 2） 的发酵条件相同。 6. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 4） 中， 所述培养 的方法与步骤 1） 中的培养方法相同。 7. 如权利要求 。

8、1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 4） 中， 所述玉米 浆和酵母粉的质量比为 3 8。 8. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 5） 中， 所述混合 氮源优化培养基的加入量为 1.5L ； 所述混合氮源优化培养基中葡萄糖的初始浓度为 60g/ L， 接种量 10%， 初始 pH 用 25% 氨水控制在 6.0 6.5， 温度 28、 转速 250rpm。 9. 如权利要求 1 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于在步骤 6） 中， 所述 2L 分 批发酵的具体方法为 ： 首先采用固体培养基驯化， 将菌种逐级涂布于梯度高糖平板培养， 挑 。

9、选经固体驯化后能耐受 10% 高糖浓度平板的菌种转接到两种含不同氮源的梯度高糖液体 培养基中进行驯化， 接着对该驯化后的菌种， 使用步骤 4） 中所述的混合氮源优化培养基进 权 利 要 求 书 CN 103451247 A 2 2/2 页 3 行分批发酵。 10. 如权利要求 9 所述一种花生四烯酸的制备方法， 其特征在于所述梯度高糖平板的 含糖量分别为 2%、 5%、 7%、 10% 和 15% ； 所述两种含不同氮源的梯度高糖的含糖量分别为 3%、 4%、 5% 和 6%。 权 利 要 求 书 CN 103451247 A 3 1/7 页 4 一种花生四烯酸的制备方法 技术领域 0001 。

10、本发明涉及花生四烯酸， 尤其是涉及一种花生四烯酸的制备方法。 背景技术 0002 花生四烯酸 （Arachidonic Acid， 简称 ARA， 即 5， 8， 11， 14- 二十碳四烯酸）属于 -6 系列长链多不饱和脂肪酸， 由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双 键， 因此被认为是人体必需脂肪酸， 是许多二十碳衍生物如前列腺素 E2（PGE2） 、 前列环素 （PGI2） 、 血栓烷 A2(TXA2)、 白三烯 Leukotirene B4(LTB4) 和 C4(LTC4) 的直接前体。ARA 还具 有调节体内多种离子通道作用， 控制细胞膜的通透性， 维持机体保水性等许多重要。

11、的生理 功能。同时研究表明， 花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意 义， 花生四烯酸对高血压、 高血脂、 糖尿病、 病毒感染等疾病的预防与治疗也有显著的效果 （Roger et al.Biotechnology Bioengineering， 2010,9(20):245-257） 。 因此， 花生四烯酸 既是一种营养强化剂， 又是人类重要的保健品。 ARA作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的 作用， 应用前景广阔。 0003 ARA 主要来源有植物、 动物组织、 鱼油以及微生物和微藻类等， 但 ARA 在动物组织 中含量低， 来源也有限， 而微生物发酵法则为生产 ARA 。

12、开辟了新途径， 它具有不受原材料及 气候限制、 生长周期短、 培养工艺简单、 ARA 含量高等特点， 近年来已成为国内外研究的热 点。国际上开展产多不饱和脂肪酸 （PFUAs） 的微生物研究主要集中在以下几个方面 ：（1） 产 PFUAs 菌种的分离与选育 ；（2） 培养条件及发酵工艺的优化 ；（3） 培养方式的研究 （包括 批式、 补料、 连续培养工艺等） ；（4） PFUAs 的分离纯化及结构鉴定。目前， 人们仅发现接合菌 纲是比较具有研究价值的的一个纲， 而且普遍看好被孢霉， 认为它是生产 ARA、 EPA、 DHA 最 有潜力的菌种。目前， 日本、 美国等国家已经先后问世了 ARA 的。

13、发酵产品， 国内在这一领域 的研究起步晚， 虽对微生物发酵生产 ARA 方面作了一些研究， 但还存在着生物量偏低， 油脂 含量较低等问题， 离大规模的工业化生产仍有一定的距离。 0004 中国专利 CN101613724 公开一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法， 包括有下述步骤 ： 首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养 ； 再转接于装有发酵 培养基的器皿中， 培养后获得发酵醪液， 其中生长培养基或 / 和发酵培养基的氮源以高山 被孢霉菌粕代替部分常用氮源， 高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以质量百分比计为 10 90 ； 发酵醪液经过滤， 收集的霉菌生物体， 经洗涤、 干燥、 粉。

14、碎， 采用非极性溶剂进行浸提 或压榨， 收获油脂， 收获的油脂经进一步处理获得目标产品， 霉菌生物体经非极性溶剂浸提 后剩余固体物质， 即为可循环使用的高山被孢霉菌粕， 该发明利用高山被孢霉发酵生产花 生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用， 避免了环境污染物的排放。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种花生四烯酸的制备方法。 0006 本发明包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103451247 A 4 2/7 页 5 0007 1） 通过摇瓶实验对高山被孢霉产 ARA 的培养条件进行优化， 所述优化的方法为 取 4mL 种子液接入装有 50mL 基础培养基 （葡萄糖 40g/L ；。

15、 酵母粉 5g/L ； MgSO4-7H2O0.1g/ L ； KH2PO40.5g/L ； CaCO30.05g/L ； ZnSO4-7H2O0.1g/L ； pH6.0）的 250mL 三角瓶， 28、 150rpm 培养 5 6d， 得到优化培养基 ： 葡萄糖 60g/L ； 酵母粉或玉米浆 10g/L ； 谷氨酸 1.0g/L ； MgSO4-7H2O0.1g/L ； KH2PO42.0g/L ； CaCO30.05g/L ； ZnSO4-7H2O0.1g/L ； 混合微量元素 1mL/L ； 混合维生素 1mL/L ； pH 调至 6.0 ； 0008 2） 对高山被孢霉在基础培养基。

16、中进行了 2L 分批发酵， 培养至第 168h， 开始收获菌 体， 获得干菌体、 油脂和 ARA ； 0009 3） 对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了 2L 分批发 酵， 再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验， 菌体生长正常， 未发生自溶现象， 并获得干 菌体、 油脂和 ARA ； 0010 4） 对高山被孢霉在优化培养基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养， 将步骤 1） 中的优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉， 得混合氮源优化培养基 ； 0011 5） 对高山被孢霉在混合氮源优化培养基中进行 2L 分批发酵， 在 2L 发酵罐中装入 混合氮源优化培养基， 培养。

17、 168h 后收获干菌体、 油脂和 ARA ； 0012 6） 对高山被孢霉进行高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中进行 2L 分批发酵， 在当葡萄糖浓度降至 10g/L 时， 流加 600g/L 葡萄糖， 使残糖控制在 10g/L 左 右， 其余操作过程与步骤 5） 相同， 培养 168h 后开始收获干菌体、 油脂和 ARA。 0013 在步骤 1）中， 所述混合微量元素可包括 FeCl36H2O,、 H3BO3、 MnCl24H2O、 CoCl26H2O、 CuSO45H2O、 NiSO46H2O 等 ； 所述混合维生素可包括维生素 B12、 生物素、 维生 素 B1、 泛酸钙等。

18、。 0014 在步骤 2） 中， 所述发酵的条件可为 ： 将培养 3d 的液体种子， 按 10% 接种量接种于 基础培养基中， 装液量 1.5L， 初始葡萄糖浓度为 60g/L， 在 28， 搅拌转速 200rpm， 通气量 1vvm ； 所述干菌体可得 18g/L， 油脂可得 7g/L， ARA 可得 2.7g/L。 0015 在步骤 3） 中， 所述发酵的条件可与步骤 2） 的发酵条件相同 ； 所述干菌体可得 21g/ L， 油脂可得 9g/L， ARA 可得 3.8g/L。 0016 在步骤 4） 中， 所述培养的方法可与步骤 1） 中的培养方法相同 ； 所述玉米浆和酵母 粉的质量比可为。

19、 3 8。 0017 在步骤 5） 中， 所述混合氮源优化培养基的加入量可为 1.5L ； 所述混合氮源优化培 养基中葡萄糖的初始浓度为60g/L， 接种量10%， 初始pH用25%氨水控制在6.06.5， 温度 28、 转速 250rpm ； 所述干菌体可得 36g/L， 油脂可得 16g/L， ARA 可得 6.5g/L。 0018 在步骤 6） 中， 所述 2L 分批发酵的具体方法可为 ： 首先采用固体培养基驯化， 将菌 种逐级涂布于梯度高糖平板 ( 含糖量分别为 2%、 5%、 7%、 10% 和 15%) 培养， 挑选经固体驯化 后能耐受 10% 高糖浓度平板的菌种转接到两种含不同氮。

20、源的梯度高糖 ( 含糖量分别为 3%、 4%、 5%和6%)液体培养基中进行驯化， 接着对该驯化后的菌种， 使用步骤4） 中所述的混合氮 源优化培养基进行分批发酵 ； 所述干菌体可得 58g/L， 油脂可得 28g/L， ARA 可得 16g/L。 0019 所述高山被孢霉可以接种适量的被孢霉至载有培养基的摇瓶中， 置于摇床上培 养， 转速为 100 300rpm， 较好的为 150 200rpm。 0020 本发明涉及的培养基的组成成分， 例如碳源、 氮源可以有所不同。碳源可以使用 说 明 书 CN 103451247 A 5 3/7 页 6 蔗糖、 麦芽糖、 糊精、 淀粉等， 葡萄糖是较适。

21、宜的碳源， 来源简单， 价格低廉， 使用量为 30 80g/L。对于摇瓶种子培养， 一般将使用量降低至 10 30g/L， 可根据培养的时间及所要求 的生物量密度来选择用量。具体合适的用量选择， 本领域的技术人员可以通过相关操作确 定碳源的种类及合适用量。 同时， 可视微生物的生长情况， 选择一次性加入全部碳源或者分 批补入。 氮源可以选择酵母粉、 玉米浆、 蛋白胨、 大豆粉等中的至少一种， 酵母粉或者玉米浆 被认为是比较好的氮源， 添加浓度在 5 15g/L， 本领域的技术人员可以通过相关实验操作 确定氮源的种类及用量。 0021 可选择使用单一氮源或混合氮源， 更好的结果是使用混合氮源 (。

22、 玉米浆、 酵母粉 ) 为发酵罐培养的适宜氮源， 且二者的质量比例对于油脂的积累影响较大， 可利用响应面分 析等统计方法进一步优化碳氮源的组合， 较好的两种氮源比例为 3:8（w/w） 。 0022 温度低于 20高山被孢霉将会开始大量产生 EPA， 而培养要求得到较高含量的 ARA， 同时尽量减低或避免产生 EPA， 培养温度通常保持在 25 30。微生物发酵生产 PUFAs， 其最高产量一般是在对数期后期或稳定期前期， 因此要在最短的时间内获得最大可 能的生物量及总脂肪酸的含量， 一般来说， 最适收获 ARA 的时间是在第 5 6 天。 0023 真菌生长的 pH 范围较广， 更偏好于在偏。

23、酸环境中生长， pH 在 4.0 至 8.0 之间均可 以正常生长， 本发明的实施过程中发现， 初始 pH6.0 6.5， 培养过程中 pH 在 7 8 之间有 利于 ARA 的积累 ； pH4 5 之间有利于生物量的积累， 在培养过程中可分阶段的调节 pH 水 平以适应所要求的生长环境。 0024 接种量可以在 2% 至 14% （V/V） ， 接种量低， 生物量达不到所要求的水平， 接种量高， 在生物量积累到一定程度将会抑制菌体的继续生长， 在摇瓶培养中， 接种控制在 3% 5% （V/V） ， 而在发酵罐培养中， 接种量控制在 8% 10%(V/V) 能得到较好的结果。 0025 培养基。

24、中碳氮比影响真菌油脂的积累， 碳氮比在 10 1 至 60 1 之间， 较好的是 40 1 至 50 1， 在培养过程中可以选择灭菌前一次性加入或培养开始后分批加入。 0026 微生物的生长需要维生素等生长因子， 当培养环境中缺乏维生素时， 细胞内 RNA、 DNA 以及蛋白质的含量会下降。添加维生素 B1、 维生素 B12、 生物素及泛酸钙最有利于 ARA 的 积累， 其用量分别在 50 150mg/L、 300 600g/L、 400 600g/L 及 80 150mg/L 之 间。谷氨酸可以提高细胞中 G6PDH 的活性， 为被孢霉细胞的生长提供核酸原料， 从而与花生 四烯酸的合成紧密相。

25、关， 在培养基中添加 0.5 2g/L 的谷氨酸有利于 ARA 的积累。 0027 为了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存过程中的稳定性， 可对菌种进行了高糖驯 化培养， 驯化后的结果发现， 菌种的耗糖能力及产油能力明显提升， ARA 的含量呈倍数增长。 0028 发酵培养过程可采用分批发酵或补料 - 分批发酵， 分批发酵要求营养物质一次性 加入， 营养物含量过高可能在培养前期抑制真菌的生长而延长延滞期， 发酵周期随之延长， 而营养物含量过低， 在培养后期无法满足真菌生长需要的营养补充。 本领域的技术人员， 可 以通过一系列实验操作确定适宜的碳氮营养物含量 ； 补料 - 分批发酵培养过程中， 必须。

26、对 培养液中的营养物质进行检测， 特别是当葡萄糖浓度小于 5g/L 时， 需要及时补充葡萄糖， 这是需要分别灭菌的。上述两种培养方式， 在实施过程中， 可能会出现起泡现象， 这是不希 望出现的， 可以选择在灭菌之间加入适量消泡剂或者在起泡现象出现时， 适时地加入消泡 剂防止产生过量泡沫。 0029 根据上述优化高山被孢霉的发酵条件， 能够获得较高的生物量及总油脂含量， 可 说 明 书 CN 103451247 A 6 4/7 页 7 以每 12h 或 24h 取样测定生物量、 油脂及 ARA 含量， 或者培养结束收获生物质测定。 0030 可以用多种方法对生物质体进行收获， 例如过滤、 真空抽。

27、滤、 离心、 膜分离、 絮凝沉 淀等， 一般的， 选择成本低且方便操作的过滤或真空抽滤收获生物质体。收获后， 可以选择 采用干菌体或湿菌体进行油脂的萃取， 本实施过程中， 对菌体进行干燥至含水量小于 4%， 此 时， 使用丙酮、 乙醇、 异丙醇等醇类、 烷烃如正己烷、 正庚烷等萃取油脂是较适宜的， 但正己 烷最佳。干燥后的菌体加入正己烷， 进行研磨、 匀浆或减法破壁萃取， 得到的萃取液进行离 心分离取上层， 蒸发除去其中的有机溶剂， 得到总油脂即粗油。 0031 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果 ： 原料易购、 价格适中、 培养基配制方 便、 发酵工艺简便、 花生四烯酸合成稳定、 油脂产。

28、量为 16 28g/L， 其中花生四烯酸产量在 6.5 16g/L， 解决了花生四烯酸的发酵生产效率和产量低的问题、 适合工业化生产。 附图说明 0032 图 1 为高山被孢霉在基础培养基中的发酵结果。 0033 图 2 高山被孢霉在添加了维生素、 氨基酸和微量元素的培养基中的发酵结果。 0034 图 3 高山被孢霉在实施例 3 培养基中添加了混合氮源的发酵结果。 0035 图 4 驯化后的高山被孢霉在实施例 4 中的培养基中的发酵结果。 0036 图 1 4 分别为实施例 2 5 中不同培养基对高山被孢霉的生物量、 总油脂和 ARA 产量的影响结果。在图 1 4 中， 横坐标为培养时间 (h。

29、)， 左纵坐标为葡萄糖消耗情 况 Glucose( ,g/L)， 右纵坐标分别为生物量 Biomass( ,g/L)， 总油脂 Total fatty acid( ,g/L) 和 ARA 产量 ( ,g/L)。 具体实施方式 0037 以下实施例用于进一步说明本发明。 0038 实施例 1. 利用高山被孢霉生产 ARA 0039 在一个 250mL 摇瓶中培养高山被孢霉， 载液量为 50mL 的活化培养基， 150rpm， 28， 活化3天。 再将活化后的菌株接入基础培养基， 装液量250mL的摇瓶装入50mL的基础 培养基， 接种量10%(v/v),于28往复式摇床培养56d， 转速150r。

30、pm,28， 培养5d后收 获， 抽滤收获生物质， 将其恒温干燥至恒重， 用正己烷研磨萃取油脂， 蒸发除去有机容剂后， 得到总油脂 5g/L。 0040 活化培养基组成 （g/L） ： 0041 0042 0043 基础培养基组成 （g/L） ： 0044 说 明 书 CN 103451247 A 7 5/7 页 8 0045 其余为水， pH6.0. 0046 实施例 2. 利用基础培养基在发酵罐培养高山被孢霉生产 ARA 0047 2L 发酵罐培养， 装液量 1.5L 基础培养基 （如实施例 1） ， 将初始葡萄糖浓度定为 60 65g/L， 单独灭菌， 发酵温度维持在 28， 初始搅拌转。

31、速 150 200rpm， 通气量 1vvm 的 条件下对高山被孢霉菌进行分批发酵培养， 灭菌前将 pH 调节至 6.5 7.0， 灭菌后的初始 pH在6.06.5， 培养12h后溶氧开始迅速下降， 生长进入对数期， 培养48h之后生长开始进 入稳定期， 在整个生长周期中， 初始 pH 值为 6.0 6.5， 过程中 pH 值先升高后降低再升高， 随着稳定期的到来， 最后pH值稳定在7.07.9之间 ； 溶氧随着生物量的增加迅速下降， 在 对数生长期维持溶氧在 0.5% 10%。 0048 培养期间每12h取样进行生物质及脂肪酸的分析。 培养至第168h， 开始收获菌体， 采用实施例 1 的方。

32、法， 获得干菌体 18g/L， 总油脂 7g/L， ARA2.7g/L， 发酵液中的葡萄糖浓度 从初始的 60g/L 降至 15g/L， 具体结果如图 1 所示。 0049 实施例3.氨基酸、 维生素和微量元素对高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影响 0050 在实施例2的基础培养基中添加了生长因子 （维生素、 氨基酸） ， 以及微量元素来提 高产量。 0051 加入的生长因子包括 ： 0052 0053 维生素配成 500 浓缩液， 使用 0.2m 无菌过滤膜过滤除菌， 并放置 4冰箱保 存， 待接种前直接加入基础培养基中， 添加量为 2mL/L。谷氨酸在灭菌前配制基础培养基时 加入， 随培。

33、养基一同灭菌。 0054 加入的微量元素包括 （g/L） ： 0055 说 明 书 CN 103451247 A 8 6/7 页 9 0056 微量元素配成 1000 浓缩液 （即 1L 培养基中加入 1mL 微量元素浓缩液） ， 调至 pH7。使用 0.2m 无菌过滤膜过滤除菌， 并放置 4冰箱保存， 待接种前直接加入基础培养 基中。 0057 为了制备接种菌体， 将使用的种子接种在 3 个含 50mL 活化培养基的摇瓶中， 在 28、 150rpm 培养 3 天后， 菌体在发酵液中呈现的形态为球状， 直径为 2 4mm， 或松散的菌 丝聚集体。接种至载液量为 1.5L 的 2L 发酵罐， 。

34、接种量 10%（V/V） ， 若种子在摇瓶中生长的 密度较低， 则在接种至发酵罐时适当的增加接种量。发酵罐中的培养基为添加了生长因子 （维生素、 氨基酸） 和微量元素的优化培养基， 进行分批发酵培养。其中初始葡萄糖浓度为 60 65g/L， 分开灭菌， 120灭菌 30min。 0058 发酵罐的参数如下 ： 温度 ： 28 ； 通气 ： 0.5 1vvm ； pH ： 用 25% 氨水维持在 6.0 左 右 ； 初始搅拌转速 ： 150rpm。 0059 第 12h， 溶氧开始迅速下降， pH 也开始下降， 菌体生长进入对数期， 将转速调至 200rpm， 此后 1 2h 内开始产生泡沫， 。

35、加入适量消泡剂。此后将转速调至 250rpm。 0060 接种时， 发酵罐中的菌体是直径为 1 2mm 的小球状， 外缘光滑， 培养至 12h 开始， 球体开始变大， 至 24h， 球体形状更清晰， 继续变大， 48h 开始罐内菌体密度增大， 至 72h， 球 体外缘显得蓬松， 且出现类似羽毛絮状的松散菌丝体， 这可能由于较大的球状菌体开始解 体， 至 120h， 球的直径在 2 4mm 之间， 同时形成了许多松散的菌丝聚集体。每隔 12h 对 发酵罐进行取样进行生物量及脂肪酸的分析， 168h 后发酵结束， 罐内发酵液的最终体积为 1.2L。获得干菌体 21g/L， 总油脂 9g/L， AR。

36、A3.8g/L， 发酵液中的葡萄糖浓度从初始的 65g/L 降至 13g/L， 具体结果如图 2 所示。 0061 实施例 4. 混合氮源对高山被孢霉高山被孢霉生物量及 ARA 油脂含量的影响 0062 这一组实验通过使用混合氮源来进一步提高产量， 过程与实施例 3 基本相同， 添 加的混合氮源的组成成分及比例通过一系列实验得到。 0063 添加的混合氮源包括 （g/L） ： 0064 玉米浆 3 0065 酵母粉 7 0066 发酵罐在第 11h， 溶氧开始迅速下降， 在约第 14h 开始产生少量泡沫， 通过人工加 入消泡剂控制。至 24h， 菌体为直径 1 2mm 的球状， 至 48h， 。

37、菌体为直径 2 3mm 的球状， 外缘光滑， 至 72h， 开始出现松散的羽毛絮状菌丝聚集体， 球体外缘松散。每隔 12h 对发酵 罐进行取样进行生物量及脂肪酸的分析， 168h 后收获， 获得干菌体 36g/L， 总油脂 16g/L， ARA6.5g/L， 发酵液中的葡萄糖浓度从初始的 60g/L 降至 5g/L， 具体结果如图 3 所示。 说 明 书 CN 103451247 A 9 7/7 页 10 0067 实施例 5. 利用驯化后的高山被孢霉生产 ARA 0068 为使高山被孢霉在发酵培养过程中， 对营养物质的吸收更为充分， 减少原料的浪 费， 提高菌种耗糖能力， 对菌种进行了驯化，。

38、 主要通过固体培养基及液体培养基的逐级高糖 驯化， 提高菌体的耗糖能力， 且驯化后的菌种均呈现为有利于油脂积累的外缘带刺状的松 散球体。利用该驯化后的菌种， 使用实施例 4 中所述的优化后培养基进行分批补料培养， 及 当葡萄糖浓度降至 10g/L 左右， 流加 600g/L 葡萄糖， 使残糖控制在 10g/L 左右， 其余操作过 程与实施 4 相同。 0069 发酵过程中用 25% 氨水调节控制 pH 在 6.0 6.5。 0070 第 12h， 菌体开始生长 , 菌体为外缘刺状的小球， 直径 1 2mm， 之后随着菌体大量 生长， 呈现为外缘刺状的松散的球状， 直径25mm， 此时pH开始下。

39、降， 这是糖代谢先产生酮 酸等有机酸， 而后被利用再逐渐上升， 此时， 允许 pH 降至 4.5， 至 72h， pH 会随着菌体进入稳 定期缓慢回升， 此时菌体主要为外缘刺状的松散的球状， 其次为羽毛絮状的菌丝聚集体， 至 98h， 将 pH 缓慢升至 6.5 7.5 之间， 但不高于 8.0。每隔 12h 对发酵罐进行取样进行生物 量及脂肪酸的分析， 0071 培养168h后开始收获， 获得干菌体58g/L， 总油脂28g/L， ARA16g/L， 发酵结束时发 酵液中的葡萄糖浓度趋于零。根据本实施例进行的分批发酵结果显示， ARA 产量较之前已 有大幅度提高， 具体结果如图 4 所示。 说 明 书 CN 103451247 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103451247 A 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103451247 A 12 。