一种新型的细菌限制型培养基.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102952763 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952763 A *CN102952763A* (21)申请号 201110251924.5 (22)申请日 2011.08.30 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人张洪涛地址 266000 山东省青岛市市北区威海路 251 号 202 室申请人曲奕 (72)发明人张洪涛曲奕 (54) 发明名称一种新型的细菌限制型培养基 (57) 摘要本发明涉及一种新型的细菌限制型培养基。此培养基。

2、适合于培养大肠杆菌，志贺氏菌，耶尔森氏菌等多种兼性厌氧型革兰氏阴性细菌。本培养基各种营养成分根据细菌生长所需的最低营养进行调配，既可以使细菌得到充足的营养物质，又可以通过缺失一个或多个成分而设立细菌生长的营养压力条件；相比传统的天然培养基，本培养基具有重复性强，对细菌生长所需的所有微量元素都能严格控制等优点，可以应用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书。

3、5 页 1/1 页 2 1. 本发明涉及一种新型的细菌限制性培养基，其特征在于具有如下的配方： 10 盐溶液、 2 稳定氨基酸溶液、 10 维生素溶液、 100HEPES、 100 葡萄糖酸钾、 100L- 色氨酸、 50L- 天冬酰胺、 50L- 谷氨酰胺、 100CaCl2 溶液及 100FeSO4 溶液以一定比例进行混合。 2. 一种权利要求 1 所述细菌限制性培养基的制备方法，其特征在于具有如下步骤： (1) 按配比将所述组分： 10 盐溶液、 2 稳定氨基酸溶液、 10 维生素溶液、 100HEPES、 100 葡萄糖酸钾、 100L- 色氨酸、 50L- 天冬酰胺、。

4、 50L- 谷氨酰胺、 100CaCl2 溶液及 100FeSO4 溶液混合，并搅拌均匀； (2) 用 NaOH 或者盐酸调节溶液 pH 至 7.2 ； (3) 加入 Na2S2O3，补充去离子水至最终体积 100ml ； (4) 无菌滤器过滤除菌， 4储存。权利要求书 CN 102952763 A 2 1/5 页 3 一种新型的细菌限制型培养基 0001 技术领域本发明涉及一种新型的细菌限制型培养基，适合于培养大肠杆菌，志贺氏菌，耶尔森氏菌等多种兼性厌氧型革兰氏阴性细菌。本培养基各种营养成分根据细菌生长所需的最低营养进行调配，既可以使细菌得到充足的营养物质，又。

5、可以通过缺失一个或多个成分而设立细菌生长的营养压力条件，从而广泛适用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域。 0002 背景技术细菌的生长需要从外界获取营养物质，这些营养物质主要以有机和无机化合物的形式为微生物所利用，也有小部分以分子态的气体形式被利用。根据营养物质在机体中生理功能的不同，可以将他们分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。培养基是人工配置，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质，已有细菌培养基的种类繁多，对细菌的生长繁殖作用不一：常用的 LB、麦芽汁培养基等天然培养基虽然营。

6、养成分丰富，但重复性差，不适合实验室的定量分析；而常用的合成培养基又不能根据实际需要变换营养成分，或者变换成分后细菌就不在生长。因此，实验人员希望能有一种重复性强、每种成分都可以根据需要进行调节、细菌生长速度不会受到很大影响的培养基能够问世。本发明的目的在于提供一种能克服已有产品不足的细菌限制型培养基，具有稳定性好、便于重复、细菌生长速度快、所有成分可依照需要调节等特点。 0003 发明内容本发明的要点在于选择合适的组分进行合理混配，经 pH 调节、过滤除菌而成的一种新型的细菌限制型培养基。 0004 本发明所涉及的配方包含五大类基本营养要素：碳源。

7、、氮源、无机盐、生长因子和水。 0005 碳源是在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质，它们在细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质和代谢产物，并且通常碳源物质也是微生物的能源物质。细菌对碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质；此外，有机酸、醇、脂类、 CO2及碳酸盐等也可作为微生物利用的碳源物质。在本发明中，我们采取了微生物最易采用的葡萄糖酸钾作为主要的碳源物质，并配以柠檬酸以保障培养基中碳源的充足。 0006 为微生物提供氮素来源的是氮源物质，这类物质主要用来合成细胞中的含氮物质，一般不能作为能。

8、源。能被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的降解产物 ( 胨、肽、氨基酸等 )、铵盐、硝酸盐、嘌呤、嘧啶等。大分子的蛋白质通常要被进一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利用，以此在本发明中，我们采用了 20 种最易被细胞利用的左旋氨基酸直接作为氮源物质，并配以铵盐以使细菌可以用最快的速度开始生长繁殖。 0007 无机盐是为细菌的生命活动提供除碳、氮源之外的各种重要元素，是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原。

9、电位和作为某些微生物生长的能源物质等。微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。根据细菌生长的基本所需，本发说明书 CN 102952763 A 3 2/5 页 4 明中采用的无机盐成分有 K2HPO4、 MnCl2、 Na2S2O3、葡萄糖酸钾、 CaCl2、 FeSO4、 MgCl2等，这些成分也可以根据人为需要进行调整，从而进行细菌的营养压力实验。 0008 生长因子通常指那些微生物生长所必须而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物，最早发现的生长因子在化学本。

10、质上都是维生素。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢。本发明采用了硫胺素 (VB1)、 DL- 泛酸钙 (VB5)、 D- 生物素 (VH) 这三种维生素作为培养基中的生长因子。 0009 除了选择适宜的营养物质，培养基的配置还需要考虑到 pH 条件的控制和营养物质浓度及合适的配比。每种微生物对最适 pH 的要求不同，以鼠疫耶尔森氏菌为例，最适 pH 为7.2，为了控制培养基的pH值，我们在配比各成分后用NaOH或者HCl进行条件，然后加入 pH 缓冲液 HEPES，以保证在细菌培养的过程中产酸产气不会过多的影响培养基的 pH 值。 0010 本发。

11、明产品的制备方法是： 0011 (1) 按配比将所述组分： 10 盐溶液、 2 稳定氨基酸溶液、 10 维生素溶液、 100HEPES、 100 葡萄糖酸钾、 100L- 色氨酸、 50L- 天冬酰胺、 50L- 谷氨酰胺、 100CaCl2溶液及 100FeSO4溶液混合，并搅拌均匀； 0012 (2) 用 NaOH 或者盐酸调节溶液 pH 至 7.2 ； 0013 (3) 加入 Na2S2O3，补充去离子水至最终体积 100ml ； 0014 (4) 无菌滤器过滤除菌， 4储存。 0015 本发明同已有的细菌培养基相比具有如下优点： (1) 根据细菌生长所需的基本营养物质进行。

12、调配，可以使细菌得到充足的营养物质从而快速生长； (2) 重复性强，可进行各种元素的准确定量； (3) 每种成分都可以根据需要进行调节，可以通过缺失一个或多个成分，方便快捷地设立细菌生长的营养压力条件； (4) 广泛适用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域； (5) 稳定性好，储存液可以保存半年以上； (6) 对人体无毒、无刺激，无腐蚀性、无不良气味。 0016 具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明： 0017 按照下表所列数据及其所属步骤进行配置： 0018 1. 盐溶液 (10。

13、储存液 )100ml ： 0019 0020 2.10 维生素储存液 (100ml) ：说明书 CN 102952763 A 4 3/5 页 5 0021 0022 注： 100ml 维生素溶液可供 1000ml 培养基使用。10D- 生物素难溶，加 5.5mol/L 的 NaOH 调节 pH 至 7.5 时溶解，溶液颜色微黄。 0023 3. 不稳定的氨基酸溶液 ( 现用现配 ) 0024 0025 注： L- 色氨酸：先配成 20ml 100 储存液，避光； 0026 L- 天冬酰胺：先配成 20ml 50 储存液； 0027 L- 谷氨酰胺：先配成 20。

14、ml 50 储存液。 0028 4.Na2S2O3.5H2O(248) ： 1000ml 需要的质量为 0.620425g，终浓度为 2.5mM。 0029 5. 其他储存液 0030 HEPES( 分子量 238.3) ：先配成 100 储存液 (50ml 29.7875g)，即 2.5M。 0031 1000ml 培养基用量 5.9575g， 500ml 用量为 2.9788g。用 5.5mol/L 的 NaOH 调节 pH 至 7.2。使用液浓度 25.0mmol/L。 0032 葡萄糖酸钾 ( 分子量 234.2) ：先配成 100 储存液 (100ml 23.42g)，即。

15、1mol/L，过滤除菌。 0033 1000ml 培养基用量 2.342g， 500ml 用量 1.171g。使用液浓度 10.0mmol/L。 0034 6.2 稳定氨基酸储存液 (250ml) 0035 说明书 CN 102952763 A 5 4/5 页 6 0036 0037 注：此溶液难溶， 100水浴助溶，冰箱中放置。 0038 7.100 可变组分储存液 0039 0040 注：配 CaCl2 溶液 10ml，高压灭菌，然后分装成 1ml/ 支，供 100ml 培养基使用；配 FeSO4 溶液 10ml，过滤除菌，然后分装成 1ml/ 支，供 100ml 培养基使用。 0041 8.TMH 培养基各成分的用量 /100ml 说明书 CN 102952763 A 6 5/5 页 7 0042 0043 配制时依次加入上述成份， NaOH调节pH至7.2，然后加入Na2S2O3，补充去离子水至最终体积 100ml。无菌滤器过滤除菌， 4储存。说明书 CN 102952763 A 7 。

摘要
申请专利号：	CN201110251924.5	申请日：	2011.08.30
公开号：	CN102952763A	公开日：	2013.03.06
当前法律状态：	公开	有效性：	审中
法律详情：	发明专利申请公开后的视为撤回IPC(主分类):C12N1/20申请公开日:20130306\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; C12R1/19(2006.01)N; C12R1/01(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	张洪涛; 曲奕
发明人：	张洪涛; 曲奕
地址：	266000 山东省青岛市市北区威海路251号202室
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内容摘要

本发明涉及一种新型的细菌限制型培养基。此培养基适合于培养大肠杆菌，志贺氏菌，耶尔森氏菌等多种兼性厌氧型革兰氏阴性细菌。本培养基各种营养成分根据细菌生长所需的最低营养进行调配，既可以使细菌得到充足的营养物质，又可以通过缺失一个或多个成分而设立细菌生长的营养压力条件；相比传统的天然培养基，本培养基具有重复性强，对细菌生长所需的所有微量元素都能严格控制等优点，可以应用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域。

权利要求书

权利要求书本发明涉及一种新型的细菌限制性培养基，其特征在于具有如下的配方：10×盐溶液、2×稳定氨基酸溶液、10×维生素溶液、100×HEPES、100×葡萄糖酸钾、100×L‑色氨酸、50×L‑天冬酰胺、50×L‑谷氨酰胺、100×CaCl2溶液及100×FeSO4溶液以一定比例进行混合。
一种权利要求1所述细菌限制性培养基的制备方法，其特征在于具有如下步骤：
(1)按配比将所述组分：10×盐溶液、2×稳定氨基酸溶液、10×维生素溶液、100×HEPES、100×葡萄糖酸钾、100×L‑色氨酸、50×L‑天冬酰胺、50×L‑谷氨酰胺、100×CaCl2溶液及100×FeSO4溶液混合，并搅拌均匀；
(2)用NaOH或者盐酸调节溶液pH至7.2；
(3)加入Na2S2O3，补充去离子水至最终体积100ml；
(4)无菌滤器过滤除菌，4℃储存。

说明书

说明书一种新型的细菌限制型培养基
技术领域  本发明涉及一种新型的细菌限制型培养基，适合于培养大肠杆菌，志贺氏菌，耶尔森氏菌等多种兼性厌氧型革兰氏阴性细菌。本培养基各种营养成分根据细菌生长所需的最低营养进行调配，既可以使细菌得到充足的营养物质，又可以通过缺失一个或多个成分而设立细菌生长的营养压力条件，从而广泛适用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域。
背景技术  细菌的生长需要从外界获取营养物质，这些营养物质主要以有机和无机化合物的形式为微生物所利用，也有小部分以分子态的气体形式被利用。根据营养物质在机体中生理功能的不同，可以将他们分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。培养基是人工配置，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质，已有细菌培养基的种类繁多，对细菌的生长繁殖作用不一：常用的LB、麦芽汁培养基等天然培养基虽然营养成分丰富，但重复性差，不适合实验室的定量分析；而常用的合成培养基又不能根据实际需要变换营养成分，或者变换成分后细菌就不在生长。因此，实验人员希望能有一种重复性强、每种成分都可以根据需要进行调节、细菌生长速度不会受到很大影响的培养基能够问世。本发明的目的在于提供一种能克服已有产品不足的细菌限制型培养基，具有稳定性好、便于重复、细菌生长速度快、所有成分可依照需要调节等特点。
发明内容  本发明的要点在于选择合适的组分进行合理混配，经pH调节、过滤除菌而成的一种新型的细菌限制型培养基。
本发明所涉及的配方包含五大类基本营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。
碳源是在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质，它们在细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质和代谢产物，并且通常碳源物质也是微生物的能源物质。细菌对碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质；此外，有机酸、醇、脂类、CO2及碳酸盐等也可作为微生物利用的碳源物质。在本发明中，我们采取了微生物最易采用的葡萄糖酸钾作为主要的碳源物质，并配以柠檬酸以保障培养基中碳源的充足。
为微生物提供氮素来源的是氮源物质，这类物质主要用来合成细胞中的含氮物质，一般不能作为能源。能被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的降解产物(胨、肽、氨基酸等)、铵盐、硝酸盐、嘌呤、嘧啶等。大分子的蛋白质通常要被进一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利用，以此在本发明中，我们采用了20种最易被细胞利用的左旋氨基酸直接作为氮源物质，并配以铵盐以使细菌可以用最快的速度开始生长繁殖。
无机盐是为细菌的生命活动提供除碳、氮源之外的各种重要元素，是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。根据细菌生长的基本所需，本发明中采用的无机盐成分有K2HPO4、MnCl2、Na2S2O3、葡萄糖酸钾、CaCl2、FeSO4、MgCl2等，这些成分也可以根据人为需要进行调整，从而进行细菌的营养压力实验。
生长因子通常指那些微生物生长所必须而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物，最早发现的生长因子在化学本质上都是维生素。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢。本发明采用了硫胺素(VB1)、DL‑泛酸钙(VB5)、D‑生物素(VH)这三种维生素作为培养基中的生长因子。
除了选择适宜的营养物质，培养基的配置还需要考虑到pH条件的控制和营养物质浓度及合适的配比。每种微生物对最适pH的要求不同，以鼠疫耶尔森氏菌为例，最适pH为7.2，为了控制培养基的pH值，我们在配比各成分后用NaOH或者HCl进行条件，然后加入pH缓冲液HEPES，以保证在细菌培养的过程中产酸产气不会过多的影响培养基的pH值。
本发明产品的制备方法是：
(1)按配比将所述组分：10×盐溶液、2×稳定氨基酸溶液、10×维生素溶液、100×HEPES、100×葡萄糖酸钾、100×L‑色氨酸、50×L‑天冬酰胺、50×L‑谷氨酰胺、100×CaCl2溶液及100×FeSO4溶液混合，并搅拌均匀；
(2)用NaOH或者盐酸调节溶液pH至7.2；
(3)加入Na2S2O3，补充去离子水至最终体积100ml；
(4)无菌滤器过滤除菌，4℃储存。
本发明同已有的细菌培养基相比具有如下优点：(1)根据细菌生长所需的基本营养物质进行调配，可以使细菌得到充足的营养物质从而快速生长；(2)重复性强，可进行各种元素的准确定量；(3)每种成分都可以根据需要进行调节，可以通过缺失一个或多个成分，方便快捷地设立细菌生长的营养压力条件；(4)广泛适用于实验室中有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌中选育及遗传分析等多种领域；(5)稳定性好，储存液可以保存半年以上；(6)对人体无毒、无刺激，无腐蚀性、无不良气味。
具体实施方式  下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
按照下表所列数据及其所属步骤进行配置：
1.盐溶液(10×储存液)100ml：

2.10×维生素储存液(100ml)：

注：100ml维生素溶液可供1000ml培养基使用。10×D‑生物素难溶，加5.5mol/L的NaOH调节pH至7.5时溶解，溶液颜色微黄。
3.不稳定的氨基酸溶液(现用现配)

注：L‑色氨酸：先配成20ml 100×储存液，避光；
L‑天冬酰胺：先配成20ml 50×储存液；
L‑谷氨酰胺：先配成20ml 50×储存液。
4.Na2S2O3.5H2O(248)：1000ml需要的质量为0.620425g，终浓度为2.5mM。
5.其他储存液
HEPES(分子量238.3)：先配成100×储存液(50ml 29.7875g)，即2.5M。
1000ml培养基用量5.9575g，500ml用量为2.9788g。用5.5mol/L的NaOH调节pH至7.2。使用液浓度25.0mmol/L。
葡萄糖酸钾(分子量234.2)：先配成100×储存液(100ml 23.42g)，即1mol/L，过滤除菌。
1000ml培养基用量2.342g，500ml用量1.171g。使用液浓度10.0mmol/L。
6.2×稳定氨基酸储存液(250ml)

注：此溶液难溶，100℃水浴助溶，冰箱中放置。
7.100×可变组分储存液

注：配CaCl2溶液10ml，高压灭菌，然后分装成1ml/支，供100ml培养基使用；配FeSO4溶液10ml，过滤除菌，然后分装成1ml/支，供100ml培养基使用。
8.TMH培养基各成分的用量/100ml

配制时依次加入上述成份，NaOH调节pH至7.2，然后加入Na2S2O3，补充去离子水至最终体积100ml。无菌滤器过滤除菌，4℃储存。