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用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用.pdf

  • 上传人：v****
  • 文档编号：5327707
  • 上传时间：2019-01-05
  • 格式：PDF
  • 页数：12
  • 大小：935.42KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201210143004.6

    		 申请日：

    2012.05.10
    公开号：

    CN102952279A

    		 公开日：

    2013.03.06
    当前法律状态：

    撤回

    		 有效性：

    无权
    法律详情：

    发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C08J 3/24申请公布日:20130306|||实质审查的生效IPC(主分类):C08J 3/24申请日:20120510|||公开
    IPC分类号：

    C08J3/24; C08J3/075; C08L35/08; C08L71/00; C12N5/09(2010.01)I; C12Q1/02

    		 主分类号：

    C08J3/24
    申请人：

    东南大学
    发明人：

    窦骏; 陈峻崧; 张天柱; 朱长皓; 顾宁
    地址：

    210096 江苏省南京市四牌楼2号
    优先权：

    专利代理机构：

    南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204

    		 代理人：

    柏尚春
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    内容摘要

    本发明公开了一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用，进行有关肿瘤学的基础研究和抗肿瘤药物筛选的应用。应用聚甲基乙烯基醚马来酸酐水解产物甲基乙烯基醚马来酸共聚物和交联剂聚乙二醇进行交联反应，制得可适合用作多种肿瘤细胞三维培养基质的水凝胶。通过对比市售的商品化BME胶和CollagenI胶，研究在细胞粘附度、细胞生长曲线，对与肿瘤细胞的迁移和侵袭、抗肿瘤药物耐药实验等方面差异度，确定该种水凝胶可模拟体内环境，支持细胞在此培养基中三维生长，为肿瘤分子生物学特性和药物筛选等研究提供细胞三维培养模型。

    权利要求书

    权利要求书一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：采用甲基乙烯基醚/马来酸共聚物和交联剂进行交联反应，通过调整甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中羧基和交联剂中羟基的比例，获得不同交联密度的凝胶，交联后凝胶中多余的羧基再用聚乙二醇单甲醚进行酯化，最后将获得的凝胶配成0.1wt%‑10wt%之间的水凝胶分散体系。
     如权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的交联剂为聚乙二醇PEG，分子量范围1000~1000000。
    如权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的交联反应指甲基乙烯基醚/马来酸共聚物和交联剂之间的反应，也就是说甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中的羧基‑COOH和交联剂中的羟基‑OH之间的反应；甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中的羧基‑COOH和交联剂中的羟基‑OH的摩尔比为100:1～500:1。
     一种如权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在肿瘤细胞三维培养中的应用。
     一种如权利要求1所述的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在药物筛选中的应用。

    说明书

    说明书用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用
    技术领域
    本发明涉及医用材料制备领域，具体涉及可应用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在肿瘤细胞三维培养的应用和抗肿瘤药物的高通量筛选模型的建立。
    背景技术
    人体内组织为三维（Three‑ dimensional， 3D）结构，但是在人体组织结构、功能、病理研究时却往往依赖体外的二维（two‑dimensional， 2D）培养和动物模型。利用普通2D细胞培养来研究肿瘤发生发展机制与真实体内的环境有很大的不同，如细胞与细胞、细胞与基质间相互作用、细胞分化等（见Nelson C.M.， Mina J. Bissell. Of extracellular matrix， scaffolds，and signaling: tissue architecture regulates development， homeostasis，and cancer [J]. Annu. Rev. Cell Dev. Biol，2006，22：287–309.）。由于动物模型与人体存在种属差异，不能很好的重复人体特征，如人类肿瘤生长转移、药物治疗反应、免疫反应和肿瘤干细胞(TSCs)分化等。3D细胞培养技术简单易操作，能够模拟体内环境特征等优势。应用3D 培养技术，则可以形成肿瘤模型并观察药物作用，研究肿瘤对化疗或放疗等的耐受性，观察肿瘤生物学行为如转移和浸润等，观察细胞间相互作用和研究肿瘤血管生成和血管拟态。3D培养基因能模拟体内的肿瘤组织因缺乏氧和营养造成的组织中心坏死及与胞外基质的相互作用微环境，从而能客观地反映对肿瘤组织诱导血管增生和对化疗药物产生耐药的现象，而普通2D培养无法模拟（见 Kevin O. Hicks， Frederik B. Pruijn， Timothy W. Secomb et al. Use of three‑dimensional tissue cultures to model extravascular transport and predict in vivo activity of hypoxia‑targeted anticancer drugs [J]. J. Natl. Cancer Inst，2006，98：1118–1128.）。正因为如此，三维细胞培养将成为极具吸引力的抗肿瘤药物的评价方法。目前的三维培养技术包括自发性细胞聚集、基质覆盖培养、旋转烧瓶培养、微载体培养、预置支架培养和旋转细胞培养系统等。其中预置支架（或基质）培养操作相对简单，易于实现肿瘤细胞的三维生长，但关键技术在于选择合适的培养基质材料。目前所用于抗肿瘤药物的三维细胞培养基质主要来源于动物性凝胶， 如胶原蛋白I、明胶或提取细胞外基质(Extracellular matrix， ECM)。由于动物性凝胶内含有很多不确定组份及其批次间的组份差异，影响了药物评价结果的准确性和客观性；另外一方面，动物性凝胶价格昂贵，限制了其广泛的应用。
    聚甲基乙烯基醚 (poly methyl vinyl ether， PMVE) 是无毒安全的热敏性材料，其低临界共溶温度(LCST)在37℃左右，比常用的热敏性聚合物聚N‑异丙基丙烯酰胺(PINPAAM)的LCST (约32℃) 更接近人体温度(约37℃)。而甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物（PMVE‑alt‑MAH）是另一类对人体和动物无毒无害的高分子材料， 具有良好的化学稳定性和生物相容性优点，兼有亲水和疏水的独特性能，在现代工业中有着非常广泛的应用。甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物的水解产物，甲基乙烯基醚/马来酸共聚物（PMVE‑alt‑MA），经α‑甲氧基‑ω‑氨基‑聚乙二醇(MeO‑PEG‑NH2)修饰后，对细胞显示良好的活性。聚乳酸乙醇酸（PLGA），聚ε‑己内酯乳酸（PCLA），聚乙二醇（PEG）都是已经被证明具有良好生物相容性的合成聚合物，已经作为微纤维支架进行细胞的三维培养。右旋糖酐（Dextran）在化学结构上类似于细胞外基质（ECM）组份之一的糖胺聚糖，是具有高分子量和亲水性多糖，含有丰富的悬挂的羟基可供化学修饰。而RGD（Arg–Gly–Asp）多肽能够很好地促进肿瘤细胞的黏附和生长。
    发明内容
    技术问题：本发明的目的在于提供了一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及其应用，可应用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在肿瘤细胞三维培养的应用和抗肿瘤药物的高通量筛选模型的建立。
    技术方案：本发明的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶采用甲基乙烯基醚/马来酸共聚物和交联剂进行交联反应，通过调整甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中羧基和交联剂中羟基的比例，获得不同交联密度的凝胶，交联后凝胶中多余的羧基再用聚乙二醇单甲醚进行酯化，最后将获得的凝胶配成0.1wt%‑10wt%之间的水凝胶分散体系。
    所述的交联剂为聚乙二醇PEG，分子量范围1000~1000000。
    所述的交联反应指甲基乙烯基醚/马来酸共聚物和交联剂之间的反应，也就是说甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中的羧基‑COOH和交联剂中的羟基‑OH之间的反应；甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中的羧基‑COOH和交联剂中的羟基‑OH的摩尔比为100:1～500:1。
    本发明的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在肿瘤细胞三维培养中的应用。
    本发明的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在药物筛选中的应用。
    有益效果：
    1. 以聚甲基乙烯基醚马来酸共聚物和聚乙二醇，聚乳酸乙醇酸‑聚乙二醇‑聚乳酸乙醇酸、聚ε‑己内酯乳酸‑聚乙二醇‑聚ε‑己内酯乳酸，或右旋糖酐等与甲基乙烯基醚/马来酸共聚物进行交联获得水凝胶，用于细胞三维培养，增加了目前细胞三维培养材料的类型。
    2. 提供了一种新型的水凝胶材料，此种新型材料能够广泛的应用于细胞及生物工程，抗肿瘤药物筛选等领域。与现有的生物来源的细胞三维培养材料相比，本发明所述水凝胶成本更低、生产批次间质量差异小，具有明显的社会效益和经济效益。
    3. 提供一种全新肿瘤细胞三维培养体系的抗肿瘤药物筛选模型，由于成本较低，生产批次间质量差异小，可广泛应用于医药领域抗肿瘤药物的高通量筛选。
    附图说明
    图1是人卵巢癌细胞HO8910和SKOV3经过本发明所述的水凝胶材料培养形成三维细胞结构。图中A‑C为HO8910细胞在TZ029材料中经过5、10、15天培养后形成三维细胞结构的情况；图中D‑F为SKOV3细胞在TZ029材料中经过5、10、15天培养后形成三维细胞结构的情况（ 放大倍数：×100; 标尺长度: 100 μm）
    图 2是人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226‑JJN3在本发明所述的水凝胶材料中第1‑20天生长曲线图。
    图 3是人卵巢癌细胞SKOV3在本发明所述的水凝胶材料中第1‑20天生长曲线图。
    图 4是人卵巢癌细胞HO8910和SKOV3在本发明所述的水凝胶材料中的细胞粘附实验结果统计图。
    图 5是多种三维培养材料对人卵巢癌HO8910和SKOV3细胞迁移和侵袭能力的影响实验结果统计图。
    图6是人卵巢癌HO8910细胞在TZ029材料三维培养模型对顺铂、卡铂、5FU与二维培养模型耐药的对照试验。顺铂（IC50浓度329 μM/L）、5FU（IC50浓度为35.39 μM/L）和卡铂（IC50浓度为33.58 μM/L）。
    具体实施方式
    本发明的用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶命名为TZ028和TZ029，为聚甲基乙烯基醚马来酸酐水解产物甲基乙烯基醚马来酸共聚物和交联剂聚乙二醇进行交联反应，通过调整甲基乙烯基醚/马来酸共聚物中羧基和交联剂中羟基的比例，交联后凝胶中多余的羧基再用聚乙二醇单甲醚进行酯化，最后将获得的凝胶配成0.1wt%‑10wt%之间的水溶液。聚乙二醇分子量范围包括1000~1000000，如2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、40000、50000、60000等。
    实验表明，肿瘤细胞能够在本发明所述水凝胶上三维粘附、生长，因此该水凝胶可在肿瘤细胞三维培养中运用。
    实现表明，肿瘤细胞能够在本发明所述水凝胶形成三维结构，可作为药物研发的细胞培养基质高分子三维支架材料，通过模拟体内环境而应用于抗肿瘤药物的筛选。与传统的二维孔板培养细胞的药物筛选模型相比，可提高抗肿瘤新药研发的成功率。
    本发明是一种用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶在肿瘤细胞三维培养的应用和抗肿瘤药物的高通量筛选模型的建立，
    实施例1：TZ028材料的制备
    T028材料为聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液与交联剂聚乙二醇PEG20k按照羧基的量n‑COOH:羟基的量n‑OH = 128:1进行交联所获得的水凝胶。
    具体包括以下步骤：
    1. 首先将0.3903g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20 mL二次蒸馏水中，加热90℃水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液；
    2. 再将0.3906g交联剂聚乙二醇PEG20k溶于10 mL二次蒸馏水获得水溶液；
    3. 将上述交联剂的水溶液加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中(羧基的量n‑COOH:羟基的量n‑OH = 128:1)，在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水，然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时，获得交联的水凝胶固体；
    4. 将凝胶固体溶于二次蒸馏水，搅拌条件下，向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液，直到水凝胶溶液的pH值等于7.0‑7.4为止，最终获得的水凝胶溶液的浓度为1.7wt%。
    实施例2：TZ029材料的制备
    T029材料为聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液与交联剂聚乙二醇PEG20k按照羧基的量n‑COOH:羟基的量n‑OH = 256:1进行交联所获得的水凝胶。
    具体包括以下步骤：
    1. 首先将0.3903g聚甲基乙烯基醚马来酸酐放置于20 mL二次蒸馏水中，加热90℃水解两个小时获得聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液；
    2. 再将0.1966g交联剂聚乙二醇PEG20k溶于10 mL二次蒸馏水获得水溶液；
    3. 将上述交联剂的水溶液加入到聚甲基乙烯基醚马来酸水溶液中(羧基的量n‑COOH:羟基的量n‑OH = 256:1)，在加热条件下旋转蒸发除去大部分的水，然后置于烘箱中在80℃的条件下交联24小时，获得交联的水凝胶固体；
    4. 将凝胶固体溶于二次蒸馏水，搅拌条件下，向上述水凝胶溶液逐滴滴加饱和碳酸氢钠的水溶液，直到水凝胶溶液的pH值等于7.0‑7.4为止，最终获得的水凝胶溶液的浓度为1.7wt%。
    实施例3：用TZ028和TZ029材料对肿瘤细胞进行三维培养
    肿瘤细胞三维培养的准备过程与肿瘤细胞的二维培养相同，其操作如下：
    将人卵巢癌细胞株HO8910和SKOV3从液氮罐中取出，分别置于37℃水浴中迅速溶解，加入DMEM（Gibco公司）培养液，悬浮离心沉淀的细胞，然后接种于25cm2培养瓶中；再加入含10%（体积浓度）胎牛血清（FBS Gibco公司）和1%青链霉素溶液的DMEM（Gibco公司）培养液。把培养瓶置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，每2天换液一次。待细胞贴壁生长铺满培养瓶后即可将细胞分瓶传代。传代时在超净台内先将培养瓶中的培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25%的胰酶1ml使贴壁细胞游离，可以适当震荡。显微镜下观察见细胞不在贴壁已经悬浮，加入1‑2ml培养液为DMEM的完全培养基终止胰酶作用。将培养瓶中液体移入离心管中，300g/分，5分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用DMEM的完全培养基悬浮细胞，分瓶接种。当接种细胞生长状态良好后，备用。
    肿瘤细胞三维培养的具体步骤如下：
    1. 将实施1制备的TZ028和TZ029材料，取适量（10ml）移入离心管中备用，整个过程在冰上操作；
    2. 将（1）中制备的材料在冰上，用无菌滴管吸取50μl/孔加入96孔板中，放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中60min孵育形成凝胶状；
    3. 将上述准备过程培养好的HO8910和SKOV3细胞分别用0.25%胰酶消化，移入不同的离心管中，300g/分，5分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用DMEM的完全培养基悬浮细胞计数到1×105个/ml；按组别分别加入TZ028和TZ029材料使其体积分数分别达到5%；
    4. 快速取（3）中的混合液100μl（每孔）滴加入（2）中制备的含有TZ028和TZ029材料的96孔板中，分成HO8910和SKOV3细胞组，使得每孔细胞数达到1×105个；
    5. 放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中，倒置显微镜观察细胞培养情况；
    6. 换液，取出细胞培养孔板液体的1/2，然后加入1/2新鲜的DMEM的完全培养基，换液完成后，放在细胞培养箱中继续培养至所需天数（培养2‑3天后，观察培养基的颜色变化，若有变化则换液，换液时取孔板内完全培养基的1/2，然后加1/2 DMEM的完全培养基；通常2‑3天换液一次）。
    实验结果表明，细胞可以在本发明所述的TZ028和TZ029材料中粘附、生长、增殖，形成细胞团块结构。上述结果提示，本发明所述的TZ028和TZ029材料可以作为细胞三维培养的候选材料，应用于肿瘤细胞的三维培养。
    实施例4 肿瘤细胞三维培养生长曲线检测
    按照实施例2所述方法，分别于第1天、5天、10天、15天、20天进行肿瘤细胞三维培养生长曲线检测。在本实施例中可以较为准确的获得各种材料培养细胞的对比数据，同时也能够动态的数据化的观察细胞的生长速度和情况。
    具体步骤如下：
    1. 按照实施例2所述方法进行细胞三维培养，分别于第1天、5天、10天、15天、20天加入20μl/孔MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育4小时；
    2. 将（1）中待测样品中，加入50μl/孔SDS三联溶解液（10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解）。置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值；
    3. 同时设置对照孔（相同浓度的TZ028或TZ029材料、培养液、MTT、SDS三联溶解液，不含细胞）。
    4. 实验重复三次，统计学分析。
    实验结果表明，RPMI8226‑JJN3和SKOV3细胞能够在TZ028和TZ029材料中形成三维结构，并持续稳定生长。在10‑15天时达到平台生长期，15‑20天后出现凋亡。提示10‑15天三维细胞培养为最佳细胞模型期，可进行肿瘤细胞生物学、抗肿瘤药物筛选等多项研究。
    实施例5 细胞粘附实验分析
    按照实施例2所述方法，将商品化的BME培养基（3D Culture BME Cell Proliferation. Trevigen Inc. Catalog #: 3445‑096‑K）和Collagen I胶(3‑D Culture Matrix™ Rat Collagen I. Trevigen Inc. Catalog #: 3447‑020‑01)与TZ028和TZ029材料进行SKOV3和HO8910细胞的黏附试验对比。在本实施例中可检测TZ028和TZ029材料对比市场上销售的三维培养材料对于细胞的黏附生长的情况。具体步骤如下：
    1. 按照实施例2所述方法进行细胞三维培养，设立BME培养基和Collagen I胶对照组；
    2. 对照空白孔加入10mg/ml的BSA（牛血清白蛋白），37度细胞培养箱孵育30min，以封闭PVC材料（96孔板）表面，防止细胞粘附结合，影响对照组数据；
    3. 所有的孔无菌PBS冲洗两遍；
    4. 加入50μl/孔含有1×104个SKOV3或HO8910细胞的细胞悬液，放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育4小时；
    5. 去除细胞悬液，并用PBS冲洗2遍；
    6. 加入20μl/孔MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育4小时；
    7. 拍照。将（6）中待测样品中，加入50μl/孔SDS三联溶解液（10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解）。置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值；
    8. 实验重复三次，统计学分析。
    实验结果表明，HO8910细胞组中，TZ029材料表现出与BME培养基相似的细胞粘附度（无统计学差异），优于Collagen I胶和其他材料；在SKOV3细胞组中TZ029材料表现出与BME培养基和Collagen I胶相似的细胞粘附度（无统计学差异），优于其他材料(P＜0.05)。提示TZ028和TZ029材料与市售的BME培养基和Collagen I胶对于细胞粘附度的影响作用相比，前者优于或类似于后者，体现较好的生物相容性。
    实施例6 肿瘤细胞迁移和侵袭实验
    将商品化的BME培养基（3D Culture BME Cell Proliferation. Trevigen Inc. Catalog #: 3445‑096‑K）和Collagen I胶(3‑D Culture Matrix™ Rat Collagen I. Trevigen Inc. Catalog #: 3447‑020‑01)与TZ028和TZ029材料进行SKOV3和HO8910细胞的迁移和侵袭实验。在本实施例中可检测TZ028和TZ029材料对比市场上销售的3D培养材料对于肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。具体步骤如下：
    1. 建立Transwell小室  利用Millicell‑polycarbonate (PCF) insert (Millipore， Billerica， MA， USA) 建立Transwell小室；
    2. 包被基底膜：分别用35μl/孔BME培养基和Collagen I胶与TZ028和TZ029材料包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干；
    3. Transwell小室上室加入100μl的已经过三天无血清培养的SKOV3或HO8910细胞悬液（不含血清的DMEM培养基），每孔含有1×104个细胞。下室加入DMEM的完全培养基。放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育24小时；
    4. 孵育24小时后，用棉签拭去上室的细胞和凝胶，并用PBS冲洗2遍；
    5. 于4%甲醛固定，用0.4%的台酚蓝染色，显微镜下对穿透细胞进行计数。每孔采取上、中、下、左、右5位点细胞计数，取平均值的计数方式；
    6. 实验重复三次，统计学分析。
    实验结果表明，HO8910细胞组中，TZ028和TZ029材料表现出与Collagen I胶相似的细胞侵袭力，说明对细胞的迁移力的影响较为类似。BME培养基对细胞的侵袭力支持最佳。SKOV3细胞组中，TZ028和TZ029材料表现出与Collagen I胶相似的细胞侵袭力，说明对细胞的迁移力的影响较为类似，且优于BME培养基材料。提示TZ028和TZ029材料与市售的BME培养基和Collagen I胶对于细胞迁移和侵袭的影响作用相比，前者优于或类似于后者，体现较好的生物相容性和体内环境的模拟性，可为将来利用本发明所述材料进行有关肿瘤发生发展、转移、复发等机制的进行体外研究提供物质基础。
    实施例7 肿瘤细胞三维培养体系的抗肿瘤药物筛选模型
    本实施例中，肿瘤细胞三维培养同实施例2，从多种抗肿瘤化疗药物考察利用本发明所述材料构建的肿瘤细胞三维培养模型与二维细胞培养模型在耐药性上的不同，证明肿瘤细胞三维培养模型更接近于体内环境，对于药物研究和新药筛选具有更为准确的预测作用。肿瘤细胞三维培养模型所用抗肿瘤化疗药物为顺铂（浓度329μM/L）、5FU（浓度为35.39μM/L）和卡铂（浓度为33.58 μM/L）。
    具体步骤如下：
    1. 将实施1制备的TZ029材料，取适量（2 ml）移入离心管中备用，整个过程在冰上操作；
    2. 将（1）中制备的材料在冰上，用无菌滴管吸取50 μl/孔加入96孔板中，放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中60min孵育形成凝胶状；
    3. 将上述准备过程培养好的HO8910细胞分别用0.25%胰酶消化，移入不同的离心管中，300 g/分，5分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用DMEM的完全培养基悬浮细胞计数到3×104个/ml；加入TZ029材料使其体积分数分别达到5%；
    4. 快速取（3）中的混合液100 μl（每孔）滴加入（2）中制备的含有TZ029材料的96孔板中，使得每孔细胞数达到3×103个；
    5. 取100 μl的HO8910细胞悬液滴加入96孔板中，平铺生长；
    6. 将（4）（5）制备的96孔板放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中，倒置显微镜观察细胞培养情况；
    7. 换液，取出细胞培养孔板液体的1/2，然后加入1/2新鲜的DMEM的完全培养基，换液完成后，放在细胞培养箱中继续培养至所需天数；
    8. 将（4）（5）制备的96孔板中按照组别分别加入含卡铂、顺铂、5FU药物的DMEM的完全培养基100 μl/孔，使其终浓度分别达到顺铂（IC50浓度329 μM/L）、5FU（IC50浓度为35.39 μM/L）和卡铂（IC50浓度为33.58 μM/L）；
    9. 将（8）制备的96孔板放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养72小时；
    10. 72小时后，加入20 μl/孔MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育4小时；
    11. 将（10）中待测样品中，加入50 μl/孔SDS三联溶解液（10%SDS，5%异丁醇，0.012 mol/LHCL，蒸馏水溶解）。置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值；
    12. 同时设置空白对照孔（相同浓度的TZ029材料、培养液、MTT、SDS三联溶解液，不含细胞）和阴性对照孔（相同浓度的TZ029材料、相同数量的细胞、培养液、MTT、SDS三联溶解液，不含抗肿瘤药物）；
    13. 实验重复三次，统计学分析。
    实验结果表明，HO8910细胞在TZ029材料中形成三维结构对顺铂、卡铂和5FU的耐药性要高于二维细胞培养模型，更接近于体内环境，对于药物研究和新药筛选具有更为准确的预测作用。
    上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

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    用于 肿瘤 细胞 三维 培养 凝胶 应用
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