虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物、设计和扩增方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103074335 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074335 A *CN103074335A* (21)申请号 201210482530.5 (22)申请日 2012.11.22 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人浙江海洋学院地址 316000 浙江省舟山市定海区文化路 105 号海科学院 (72)发明人徐田军王日昕金逍逍孙悦娜 (74)专利代理机构杭州杭诚专利事务所有限公司 33109 代理人尉伟敏 (54) 发明名称虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩。

2、增引物、设计和扩增方法 (57) 摘要本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种 CO 及 ND3 基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；重链引物为 SEQIDNo.2 所示的核苷酸序列。本发明还提供了该扩增引物的设计和扩增方法。本发明可高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页序列表 1 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求。

3、书1页说明书5页序列表1页附图1页 (10)申请公布号 CN 103074335 A CN 103074335 A *CN103074335A* 1/1 页 2 1. 虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物，其特征是由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；重链引物为 SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列。 2. 如权利要求 1 所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物，其特征是所述的虾虎鱼类包括中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾。

4、虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。 3. 一种如权利要求 1 所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物的设计方法，其特征是登录 NCBI 网站中的 GenBank 数据库搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的 CO 基因和 tRNA-Arg 基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用 Premier Primer5.0 软件设计出虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物。 4.一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其特征。

5、是采用如权利要求 1所述的虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因扩增引物对待测样品的DNA模板溶液进行PCR扩增。 5. 如权利要求 4 所述的一种对虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因进行扩增的方法，其特征是 PCR 扩增的条件为： 95预变性 5min，然后 95变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min20s，共 35 个循环，最后 72延伸 5min。 6.如权利要求4所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其特征是 PCR 扩增的反应体系组成为： PCR 反应体系为 25L，内含 2.5mM 的 dNTP 2L、 10Taq DNA 聚合。

6、酶 Buffer 2.5L、 10M 的轻链引物和重链引物各 1L、 5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 0.2L、含 100ng 的 DNA 模板溶液 1L 及 ddH2O 17.3L。 7.如权利要求4所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其特征是所述的待测样品来自中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。权利要求书 CN 103。

7、074335 A 2 1/5 页 3 虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物、设计和扩增方法技术领域 0001 本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种高效扩增多种虾虎鱼类线粒体细胞色素 c(Cytc) 氧化酶亚基（cytochrome c oxidase subunit ； CO ）基因大部分序列及 NADH 还原酶复合体亚基 3（NADH dehydrogenase subunits 3 ； ND3）基因全序列的扩增引物及其设计和扩增方法。背景技术 0002 鱼类线粒体基因组由 13 个编码蛋白质基因、 22 个 tRNA 基因、 2 个 rRNA 基。

8、因（12S rRNA 及 16S rRNA）共 37 个编码基因及一段主要的非编码区（控制区）组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。 0003 虾虎鱼类隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目，是世界上种类最多，分布最广的鱼类之一。估计全世界的虾虎鱼种类有 2000 多种，它们形成一个庞大的生物类群，在水环境尤其是海洋生态环境中占有重要的地位。虾虎鱼多为肉食性的小型鱼类，遍布。

9、全世界，尤以热带为多，主要为海水鱼类，大部分营底栖生活，主要特征是其腹鳍愈合成一吸盘状。近年来，由于过度捕捞、气候环境变化等原因，许多传统的经济鱼种资源已经形不成渔讯，有些甚至枯竭，但虾虎鱼类因其适应能力强、生命周期短、繁殖力强等原因，资源量却逐年增加。大部分虾虎鱼类经济价值不高，国内外有关于虾虎鱼类的研究相对较少，因其种类繁多，外部形态特征极为相似，导致不易鉴别和认定。目前，虾虎鱼类的分类还不甚清晰，很多种类的分类地位还比较混乱。 0004 线粒体全基因组及线粒体基因组上的相关基因作为分子标记已被广泛地用于虾虎鱼群体遗传学、系统发生学及保。

10、护生物学等研究领域。CO 及 ND3 作为脊椎动物线粒体蛋白质编码基因中 3 个编码细胞色素 c(Cytc) 氧化酶亚基及 7 个编码 NADH 还原酶复合体亚基的基因之一，其所含的系统发育信息位于 13 个编码蛋白基因中的中上等，可应用于脊椎动物的系统进化和分类研究。然而未曾有报道过扩增线粒体 CO 及 ND3 基因序列的通用引物，尤其是针对虾虎鱼类。因此设计特异性扩增虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因序列的通用引物，从而为高效获得虾虎鱼线粒体CO及ND3基因序列及线粒体基因组全序列奠定基础。发明内容 0005 针对上述现有技术存在的空缺，本发明旨在提供一对可高效。

11、特异扩增多种虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因序列的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒体 CO及ND3基因序列以进行系统进化和分类研究提供一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因扩增引物的设计方法，以及利用所述的虾虎鱼类说明书 CN 103074335 A 3 2/5 页 4 线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物对虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因进行扩增的方法。 0006 为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为 SEQ I。

12、D No.1 所示的核苷酸序列；重链引物为 SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列。 0007 本发明的轻链引物 Gobies-CO -ND3-F（SEQ ID No.1 所示）有 21 个碱基： ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于 CO 基因上；重链引物 Gobies-CO -ND3-R （SEQ ID No.2 所示）有 21 个碱基： GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于 tRNA-Arg 基因上。 0008 本发明所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物对在东海海域采集的 17 种虾虎鱼类，均能获得片段长度为1150 bp左右。

13、的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体 ND3 基因全序列、 tRNA-Gly 基因全序列、及长度为 720 bp 左右的 CO 基因绝大部分序列的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒CO及ND3基因序列以进行系统进化及分类研究提供一个有力工具。 0009 作为优选，根据本发明所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物，其中所述的虾虎鱼类包括但不限于下述：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、。

14、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。 0010 本发明还提供了上述虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因扩增引物的设计方法，即登录 NCBI 网站中的 GenBank 数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的CO基因和tRNA-Arg基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用 Premier Primer5.0 软件设计出虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物。所用的 Premier Pr。

15、imer5.0 软件在生物软件网 http:/www.bio-soft.net/ 下载。 0011 本发明还提供了一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其是采用上述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物对待测样品的 DNA 模板溶液进行 PCR 扩增。 0012 作为优选，根据本发明所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其中 PCR 扩增的条件为： 95预变性 5min，然后 95变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min20s，共 35 个循环，最后 72延伸 5min。 0013 作为优选，根据本发明所述的一种对。

16、虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因进行扩增的方法，其中 PCR 扩增的反应体系组成为： PCR 反应体系为 25L，内含 dNTP（2.5mM） 2L、 10Taq DNA 聚合酶 Buffer 2.5L、 10M 的轻链引物和重链引物各 1L、 Taq DNA 聚合酶 (5U/ul) 0.2L、含 100ng 的 DNA 模板溶液 1L 及 ddH2O 17.3L。 0014 作为优选，根据本发明所述的一种对虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因进行扩增的方法，其中所述的待测样品来自包括但不限于下述虾虎鱼类：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、。

17、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。 0015 与现有技术相比，本发明具有如下优点：说明书 CN 103074335 A 4 3/5 页 5 本发明提供的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物，可以高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体CO及ND3基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。同时本发明所述通用引物及其设计方法也可作为通用引物 PCR 扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本发明所涉。

18、及领域的前进发展，因而具备重要发明价值和理论意义。附图说明 0016 图 1 为本发明虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物用以扩增不同虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因序列的电泳图谱。 0017 其中 M ： DNA 分子量标准（DL2000）， 1-17 依次为：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。具体实施方式 0018 下面结合实施例。

19、和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和 / 或改变都将落入本发明保护范围。 0019 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。 0020 主要材料、试剂和仪器设备：软件及序列资源： Premier Primer5.0 引物设计软件（下载自生物软件网 http:/ www.bio-soft.net/），虾虎鱼类线粒体基因组序列资源（下载自 NCBI 中 Genbank 。

20、数据库 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/），序列分析软件MEGA5.0 （下载自生物软件网http:/www. bio-soft.net/）。 0021 PCR 扩增检测相关试剂仪器：海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN，北京），琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（TIANGEN，北京），常规台式离心机（Thermo）， Bio-Rad C1000TM Thermal Cycler 扩增仪器（Bio-Rad，美国），微量移液器（Enppdorf，德国）， 96 孔 PCR 板（Axygen）， dNTP （TIAN。

21、GEN，北京）， 10Taq DNA 聚合酶 Buffer （TIANGEN，北京）， Taq DNA 聚合酶（TIANGEN，北京），灭菌双蒸水， DL2000 DNA marker （TIANGEN，北京），琼脂糖（Biowest，香港），电泳仪（DYY-6C 型，北京六一），凝胶成像仪（Bio-Rad GD2000，美国）。 0022 克隆测序相关试剂仪器：高压蒸气灭菌锅（SANYO，日本），加氨苄（Amp）抗生素的灭菌 LB 培养基， LB 固体培养平皿（上海生工），超净工作台（SWCJ1G 型，名牌之星，中国）。

22、，恒温水浴锅（上海精宏）， DH5 感受态细胞（TIANGEN）， Amp 抗生素（上海生工）， 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 半乳糖苷（上海生工），异丙基硫代 -D- 半乳糖苷（上海生工）， pGEM-T载体（Promega，美国），恒温培养箱（PH070A型，上海一恒科学仪器有限公司），恒温振荡摇床（培英，太仓市实验设备厂）自动 DNA 测序仪（ABI 3730 型，美国）。 0023 实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如 Sambrook 等作者的分子克隆实验室手册（New York ： C。

23、old Spring Harbor Laboratory Press， 1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。说明书 CN 103074335 A 5 4/5 页 6 0024 实施例 1 1、虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物的设计和合成：登录 NCBI 网站中的 GenBank 数据库搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的 CO 基因和 tRNA-Arg 基因序列，将序列载入到分析软件 MEGA5.0 中，利用 ClustalW 算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将所找到的保守序列载入到 Premier P。

24、rimer5.0 软件在手动设计模式下（即在 manual 选项下选择 Low，具体参数为默认设置）设计出虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物 : 其中轻链引物 Gobies-CO -ND3-F（SEQ ID No.1 所示）有 21 个碱基： ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于 CO 基因上；重链引物 Gobies-CO -ND3-R （SEQ ID No.2 所示）有 21 个碱基： GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于 tRNA-Arg 基因上。 0025 由南京金斯瑞生物科技有限公司根据发明人的要求合成符合 SEQ ID N。

25、o.1 和 SEQ ID No.1 所示核苷酸序列的引物。 0026 2、对虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因进行扩增本发明中的 17 个待测样本均采集于我国的东海海域。其中扩增的虾虎鱼类为以下种类：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。 0027 利用海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒提取待测样本的基因组 DNA，方法按照试剂盒说明书进行，琼脂糖电泳。

26、检测提取的基因组 DNA。 0028 用于扩增多种虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因的 PCR 反应体系和反应条件如下： PCR 反应体系为 25L，内含 dNTP（TIANGEN）， 10TaqDNA 聚合酶 Buffer（TIANGEN）， 10M 的轻链引物 Gobies-CO -ND3-F 和 10M 的重链引物 Gobies- CO -ND3-R， Taq DNA 聚合酶（TIANGEN），含 100ng 的上述提取的基因组 DNA 模板溶液， ddH2O，其中： 10TaqDNA 聚合酶 Buffer 2.5L dNTP 2L Gobies- CO -ND3。

27、-F 1L Gobies- CO -ND3-R 1L Template DNA 1L ddH2O 17.3L Taq DNA 聚合酶 0.2L。 0029 扩增反应在Bio-Rad C1000TM Thermal Cycler仪器上进行，扩增条件为： 95预变性 5min，然后 95变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min20s，共 35 个循环，最后 72延伸 5min。扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测其大小和纯度。不同虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增产物的电泳图谱见图 1。 0030 运用设计的引物扩增多数虾虎鱼类线粒CO及ND3基因序列，均获得。

28、了单一的目的片段，产物大小约为 1150 bp，并对 PCR 扩增产物直接进行测序，其步骤为： PCR 扩增产物初步定量后，浓度达到约 100ng/l 的样品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其进行双向测序，测序引物为 Gobies-CO -ND3-F（10M）和 Gobies-CO -ND3-R（10M）。经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体ND3基因全序列、 tRNA-Gly基说明书 CN 103074335 A 6 5/5 页 7 因全序列、及长度为 720 bp 左右的 CO 基因绝大部分部分序列的扩增产物。 0031。

29、运用设计的引物扩增普氏细棘虾虎鱼和青弹涂鱼线粒体CO及ND3基因，均获得了单一的目的片段，产物大小约为 1150 bp，并使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（TIANGEN，上海）对 PCR 扩增产物进行胶回收纯化，纯化产物同 pGEM-T 载体（Promega 公司，美国）连接，转化，鉴定阳性克隆并测序。其步骤为：经胶回收纯化的 PCR 扩增产物在 T4 DNA 连接酶的作用下与 pGEM-T 载体进行连接反应。连接反应体系为载体 1l， T4 DNA 连接酶 1l，连接 Buffer 5ul， PCR 纯化产物 3l。连接反应于冰上操作，反应液置于。

30、4冰箱连接过夜（至少 12 小时）。取 DH5 感受态细胞（TIANGEN，北京），热激法进行转化，用含有氨苄抗生素（Amp） LB 平板（使用前预先均匀涂布 40ul 20mg/ml 的 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 半乳糖苷（X-Gal）和 30ul 0.2mol/L 的异丙基硫代 -D- 半乳糖苷（IPTG））进行蓝白筛选，并通过菌液 PCR 扩增确认挑取的阳性克隆子。阳性克隆子经扩大培养后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向直接测序。测序引物为 SP6/T7。序列分析仪为 ABI 3730 全自动 DNA 测序仪。经测序及与。

31、 GenBank 中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体 ND3 基因全序列、 tRNA-Gly 基因全序列、及长度为 720 bp 左右的 CO 基因绝大部分序列的扩增产物。 0032 实用性本发明所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物对在东海海域采集的 17 种海洋虾虎鱼类的 DNA 模板溶液进行 PCR 扩增，均能获得片段在 1150 bp 左右的特异性扩增产物，经测序及与 GenBank 中同源序列的比较，确认为包含线粒体 ND3 基因全序列、 tRNA-Gly 基因全序列、及长度为720 bp左右的CO基因绝大部分序列的扩增产物，体现出本发明较。

32、广的扩增范围与较强的扩增能力，因此，本发明所述的虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物在虾虎鱼类不同阶元系统进化及分类研究领域可予以应用。 0033 尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和 / 或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。说明书 CN 103074335 A 7 1/1 页 8 SEQUENCE LISTING 浙江海洋学院虾虎鱼类线粒体 CO 及 ND3 基因扩增引物、设计和扩增方法 Z122339 2 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 人工序列 1 ataccacata gtagacccca g 21 2 21 DNA 人工序列 2 gactttaacc acgagctttt g 21 序列表 CN 103074335 A 8 1/1 页 9 图 1 说明书附图 CN 103074335 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201210482530.5	申请日：	2012.11.22
公开号：	CN103074335A	公开日：	2013.05.01
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/11申请日:20121122\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/11; C12N15/10	主分类号：	C12N15/11
申请人：	浙江海洋学院
发明人：	徐田军; 王日昕; 金逍逍; 孙悦娜
地址：	316000 浙江省舟山市定海区文化路105号海科学院
优先权：
专利代理机构：	杭州杭诚专利事务所有限公司 33109	代理人：	尉伟敏
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内容摘要

本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种COⅢ及ND3基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了该扩增引物的设计和扩增方法。本发明可高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。

权利要求书

权利要求书虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，其特征是由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，其特征是所述的虾虎鱼类包括中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。
一种如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物的设计方法，其特征是登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的COⅢ基因和tRNA‑Arg基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物。
一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其特征是采用如权利要求1所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物对待测样品的DNA模板溶液进行PCR扩增。
如权利要求4所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其特征是PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共35个循环，最后72℃延伸5min。
如权利要求4所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其特征是PCR扩增的反应体系组成为：PCR反应体系为25µL，内含2.5mM的 dNTP 2µL、10×Taq DNA聚合酶 Buffer 2.5µL、10µM的轻链引物和重链引物各1µL、5U/ul的Taq DNA聚合酶0.2µL、含100ng的DNA模板溶液 1µL及ddH2O 17.3µL。
如权利要求4所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其特征是所述的待测样品来自中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。

说明书

说明书虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物、设计和扩增方法
技术领域
本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种高效扩增多种虾虎鱼类线粒体细胞色素c(Cytc)氧化酶亚基Ⅲ（cytochrome c oxidase subunit Ⅲ；COⅢ）基因大部分序列及NADH还原酶复合体亚基3（NADH dehydrogenase subunits 3；ND3）基因全序列的扩增引物及其设计和扩增方法。
背景技术
鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因（12S rRNA及16S rRNA）共37个编码基因及一段主要的非编码区（控制区）组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。
虾虎鱼类隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目，是世界上种类最多，分布最广的鱼类之一。估计全世界的虾虎鱼种类有2000多种，它们形成一个庞大的生物类群，在水环境尤其是海洋生态环境中占有重要的地位。虾虎鱼多为肉食性的小型鱼类，遍布全世界，尤以热带为多，主要为海水鱼类，大部分营底栖生活，主要特征是其腹鳍愈合成一吸盘状。近年来，由于过度捕捞、气候环境变化等原因，许多传统的经济鱼种资源已经形不成渔讯，有些甚至枯竭，但虾虎鱼类因其适应能力强、生命周期短、繁殖力强等原因，资源量却逐年增加。大部分虾虎鱼类经济价值不高，国内外有关于虾虎鱼类的研究相对较少，因其种类繁多，外部形态特征极为相似，导致不易鉴别和认定。目前，虾虎鱼类的分类还不甚清晰，很多种类的分类地位还比较混乱。
线粒体全基因组及线粒体基因组上的相关基因作为分子标记已被广泛地用于虾虎鱼群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域。COⅢ及ND3作为脊椎动物线粒体蛋白质编码基因中3个编码细胞色素c(Cytc)氧化酶亚基及7个编码NADH还原酶复合体亚基的基因之一，其所含的系统发育信息位于13个编码蛋白基因中的中上等，可应用于脊椎动物的系统进化和分类研究。然而未曾有报道过扩增线粒体COⅢ及ND3基因序列的通用引物，尤其是针对虾虎鱼类。因此设计特异性扩增虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列的通用引物，从而为高效获得虾虎鱼线粒体COⅢ及ND3基因序列及线粒体基因组全序列奠定基础。
发明内容
针对上述现有技术存在的空缺，本发明旨在提供一对可高效特异扩增多种虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列以进行系统进化和分类研究提供一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物的设计方法，以及利用所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法。
为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：
虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明的轻链引物Gobies‑COⅢ‑ND3‑F（SEQ ID No.1所示）有21个碱基：ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于COⅢ基因上；重链引物Gobies‑COⅢ‑ND3‑R （SEQ ID No.2所示）有21个碱基：GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于tRNA‑Arg基因上。
本发明所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物对在东海海域采集的17种虾虎鱼类，均能获得片段长度为1150 bp左右的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体ND3基因全序列、tRNA‑Gly基因全序列、及长度为720 bp左右的COⅢ基因绝大部分序列的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒COⅢ及ND3基因序列以进行系统进化及分类研究提供一个有力工具。
作为优选，根据本发明所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，其中所述的虾虎鱼类包括但不限于下述：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。
本发明还提供了上述虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物的设计方法，即登录NCBI网站中的GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的COⅢ基因和tRNA‑Arg基因序列，经同源性比较，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0软件设计出虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物。所用的Premier Primer5.0软件在生物软件网http://www.bio‑soft.net/下载。
本发明还提供了一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其是采用上述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物对待测样品的DNA模板溶液进行PCR扩增。
作为优选，根据本发明所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其中PCR扩增的条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共35个循环，最后72℃延伸5min。
作为优选，根据本发明所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其中PCR扩增的反应体系组成为：PCR反应体系为25µL，内含dNTP（2.5mM）2µL、10×Taq DNA聚合酶 Buffer 2.5µL、10µM的轻链引物和重链引物各1µL、Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2µL、含100ng的DNA模板溶液 1µL及ddH2O 17.3µL。
作为优选，根据本发明所述的一种对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增的方法，其中所述的待测样品来自包括但不限于下述虾虎鱼类：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物，可以高效特异性地扩增多种虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列，能应用于虾虎类不同分类阶元系统进化和分类研究。同时本发明所述通用引物及其设计方法也可作为通用引物PCR扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本发明所涉及领域的前进发展，因而具备重要发明价值和理论意义。
附图说明
图1为本发明虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物用以扩增不同虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因序列的电泳图谱。
其中M：DNA分子量标准（DL2000），1‑17依次为：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
主要材料、试剂和仪器设备：
软件及序列资源：Premier Primer5.0 引物设计软件（下载自生物软件网http://www.bio‑soft.net/），虾虎鱼类线粒体基因组序列资源（下载自NCBI中Genbank数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），序列分析软件MEGA5.0（下载自生物软件网http://www.bio‑soft.net/）。
PCR扩增检测相关试剂仪器：海洋动物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN，北京），常规台式离心机（Thermo），Bio‑Rad C1000TM Thermal Cycler扩增仪器（Bio‑Rad，美国），微量移液器（Enppdorf，德国），96孔PCR板（Axygen），dNTP（TIANGEN，北京），10×Taq DNA聚合酶 Buffer（TIANGEN，北京），Taq DNA聚合酶（TIANGEN，北京），灭菌双蒸水，DL2000 DNA marker（TIANGEN，北京），琼脂糖（Biowest，香港），电泳仪（DYY‑6C型，北京六一），凝胶成像仪（Bio‑Rad GD2000，美国）。
克隆测序相关试剂仪器：高压蒸气灭菌锅（SANYO，日本），加氨苄（Amp）抗生素的灭菌LB培养基，LB固体培养平皿（上海生工），超净工作台（SW—CJ—1G型，名牌之星，中国），恒温水浴锅（上海精宏），DH5α感受态细胞（TIANGEN），Amp抗生素（上海生工），5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷（上海生工），异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷（上海生工），pGEM‑T载体（Promega，美国），恒温培养箱（PH070A型，上海一恒科学仪器有限公司），恒温振荡摇床（培英，太仓市实验设备厂）自动DNA测序仪（ABI 3730型，美国）。
实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
1、虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物的设计和合成：
登录NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的虾虎鱼类其他物种及近缘物种的线粒体基因组的COⅢ基因和tRNA‑Arg基因序列，将序列载入到分析软件MEGA5.0中，利用ClustalW算法进行多序列对位比对分析，找到保守序列，将所找到的保守序列载入到Premier Primer5.0软件在手动设计模式下（即在manual选项下选择Low，具体参数为默认设置）设计出虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物: 其中轻链引物Gobies‑COⅢ‑ND3‑F（SEQ ID No.1所示）有21个碱基：ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于COⅢ基因上；重链引物Gobies‑COⅢ‑ND3‑R （SEQ ID No.2所示）有21个碱基：GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于tRNA‑Arg基因上。
由南京金斯瑞生物科技有限公司根据发明人的要求合成符合SEQ ID No.1和SEQ ID No.1所示核苷酸序列的引物。
2、对虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因进行扩增
本发明中的17个待测样本均采集于我国的东海海域。其中扩增的虾虎鱼类为以下种类：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、矛尾虾虎鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼、台湾沟虾虎鱼、睛尾蝌蚪虾虎鱼。
利用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA，方法按照试剂盒说明书进行，琼脂糖电泳检测提取的基因组DNA。
用于扩增多种虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因的PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应体系为25µL，内含dNTP（TIANGEN），10×TaqDNA聚合酶 Buffer（TIANGEN），10µM的轻链引物Gobies‑COⅢ‑ND3‑F和10µM的重链引物Gobies‑ COⅢ‑ND3‑R，Taq DNA 聚合酶（TIANGEN），含100ng的上述提取的基因组DNA模板溶液，ddH2O，其中：
10×TaqDNA聚合酶 Buffer     2.5µL
dNTP                        2µL
Gobies‑ COⅢ‑ND3‑F            1µL
Gobies‑ COⅢ‑ND3‑R            1µL
Template DNA                 1µL
ddH2O                        17.3µL
Taq DNA 聚合酶               0.2µL。
扩增反应在Bio‑Rad C1000TM Thermal Cycler仪器上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小和纯度。不同虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增产物的电泳图谱见图1。
运用设计的引物扩增多数虾虎鱼类线粒COⅢ及ND3基因序列，均获得了单一的目的片段，产物大小约为1150 bp，并对PCR扩增产物直接进行测序，其步骤为：PCR扩增产物初步定量后，浓度达到约100ng/µl的样品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其进行双向测序，测序引物为Gobies‑COⅢ‑ND3‑F（10µM）和Gobies‑COⅢ‑ND3‑R（10µM）。经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体ND3基因全序列、tRNA‑Gly基因全序列、及长度为720 bp左右的COⅢ基因绝大部分部分序列的扩增产物。
运用设计的引物扩增普氏细棘虾虎鱼和青弹涂鱼线粒体COⅢ及ND3基因，均获得了单一的目的片段，产物大小约为1150 bp，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN，上海）对PCR扩增产物进行胶回收纯化，纯化产物同pGEM‑T载体（Promega公司，美国）连接，转化，鉴定阳性克隆并测序。其步骤为：经胶回收纯化的PCR扩增产物在T4 DNA连接酶的作用下与pGEM‑T载体进行连接反应。连接反应体系为载体1µl，T4 DNA连接酶1µl，连接Buffer 5ul，PCR纯化产物3µl。连接反应于冰上操作，反应液置于4℃冰箱连接过夜（至少12小时）。取DH5α感受态细胞（TIANGEN，北京），热激法进行转化，用含有氨苄抗生素（Amp）LB平板（使用前预先均匀涂布40ul 20mg/ml的5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷（X‑Gal）和30ul 0.2mol/L的异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷（IPTG））进行蓝白筛选，并通过菌液PCR扩增确认挑取的阳性克隆子。阳性克隆子经扩大培养后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向直接测序。测序引物为SP6/T7。序列分析仪为ABI 3730 全自动DNA测序仪。经测序及与GenBank中的同源序列进行比对，确认为包含线粒体ND3基因全序列、tRNA‑Gly基因全序列、及长度为720 bp左右的COⅢ基因绝大部分序列的扩增产物。
实用性
本发明所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物对在东海海域采集的17种海洋虾虎鱼类的DNA模板溶液进行PCR扩增，均能获得片段在1150 bp左右的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体ND3基因全序列、tRNA‑Gly基因全序列、及长度为720 bp左右的COⅢ基因绝大部分序列的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，因此，本发明所述的虾虎鱼类线粒体COⅢ及ND3基因扩增引物在虾虎鱼类不同阶元系统进化及分类研究领域可予以应用。
尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。