用于诊断短暂性缺血发作的生物标志物.pdf

本发明提供了用于诊断和预测短暂性缺血发作(TIA)的风险和致因的方法和组合物。

权利要求书诊断短暂性缺血发作(TIA)或经历TIA的倾向的方法，所述方法包括：测定来自患者的生物样本中多种TIA相关生物标志物的表达水平，其中与对照相比，表达水平的升高或降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险，其中所述多种TIA相关生物标志物选自表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和9所示的生物标志物。
如权利要求1所述的方法，其还包括测定选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平：CNTN4、TLR5、GPR84、BCL6、NELL2、APBA2和MLL。
如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述测定步骤在疑似缺血事件之后3小时或更短时间进行。
如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述测定步骤在疑似缺血事件之后3小时或更长时间进行。
如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述测定步骤在疑似缺血事件之后至少24小时进行。
如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中选自以下的一种或多种TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：DKFZP434B061、FAM55D、FLJ30375、IGFBP5、LTBR和SCN2A。
如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中选自以下的一种或多种TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：GABRB2、ELAVL3、TWIST1、DPPA4、DKFZP434P211、DLX6、ZNF479、ASTN2、SNX31、ALS2CR11、LOC440345。
如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中选自以下的一种或多种TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：GABRB2、ELAVL3、COL1A1、SHOX2、GABRB2、TWIST1、DPPA4、DKFZP434P211、WIT1、SOX9、DLX6、ANXA3、EPHA3、SOX11、SLC26A8、CCRL1、FREM2、STOX2、ZNF479、LOC338862、ASTN2、FOLH1、SNX31、KREMEN1、ZNF479、ALS2CR11、FIGN、RORB、LOC732096、GYPA、ALPL、LHX2、GALNT5、SRD5A2L2、GALNT14、OVOL2、BMPR1B、UNC5B、ODZ2、ALPL、RASAL2、SHOX、C19orf59、ZNF114、SRGAP1、ELAVL2、NCRNA00032、LOC440345、FLJ30375、TFPI、PTGR1、ROBO1、NR2F2、GRM5、LUM、FLJ39051、COL1A2、CASP5、OPCML、TTC6、TFAP2B、CRISP2、SOX11、ANKRD30B、FLJ39051、SCN2A、MYNN、FOXA2、DKFZP434B061、LOC645323、SNIP、LOC645323、LOC374491、ADAM30、SIX3、FLJ36144、CARD8、KREMEN1、RP1‑127L4.6、FAM149A、B3GAT2、SPOCK3、G30、ITGBL1、IQGAP3、C7orf45、ZNF608、LOC375010、LRP2、TGFB2、SHOX2、HOXC4///HOXC6、ELTD1、FAM182B///RP13‑401N8.2、PRO0478、LIFR、FOLH1、EHF、NDST3、BRUNOL5、LOC728460、PDE1A、POU2AF1、FAT1、PCDH11X///PCDH11Y、FLJ37786、SLC22A4、DHRS13、EHF、MEG3、PIWIL1、LOC203274、LOC100133920///LOC286297、DMRT1、ADM、VWA3B、GAFA3、HESX1、ADAMDEC1、CAV1、LAMB4、TPTE、PPP1R1C、HPSE、AIM2、RUNDC3B、CARD16、FAM124A、MGC39584、OSM、RFX2、MYBPC1、LTBR、C18orf2、SNRPN、FLJ36031、IL1B、TRPM1、OSTCL、MAPK14、KCNJ15///LOC100131955、FIGN、HNT、S100A12、CHIT1、C7orf53、FAM13A1、GNAO1、MAPK14、FAM55D、PRKD2、LIMK2、C18orf54、IGFBP5、EVI1、PLSCR1、FOXC1、LOC646627、ZNF462、CNTLN、ZNF438、DEFB105A///DEFB105B、LOC340017、C1orf67、ACSL1、ADH1B、SLC2A14///SLC2A3、IL1B、ST3GAL4、UBE2J1、PNPLA3和PAPPA。
如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中选自以下的一种或多种TIA相关生物标志物表达水平的降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：ATG9B、DIP2C、EDAR、GSTM1、GUSBL2、SMURF2、ZNF512B。
如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中选自以下的一种或多种TIA相关生物标志物表达水平的降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：NBPF10///RP11‑94I2.2、SFXN1、SPIN3、UNC84A、OLFM2、PPM1K、P2RY10、ZNF512B、MORF4L2、GIGYF2、ERAP2、SLFN13、LOC401431、MED6、BAIAP2L1///LOC100128461、LNPEP、MBNL1、NOS3、MCF2L、KIAA1659、SCAMP5、LOC648921、ANAPC5、SPON1、FUS、GPR22、GAL3ST4、METTL3、LOC100131096、FAAH2、SMURF2、SNRPN、FBLN7、GLS、G3BP1、RCAN3、EPHX2、DIP2C、CCDC141、CLTC、FOSB、CACNA1I、UNQ6228、ATG9B、AK5、SPIN3、RBM14、SNRPN、MAN1C1、HELLS、EDAR、SLC3A1、ZNF519、LOC100130070///LOC100130775///LOC100131787///LOC100131905///LOC100132291///LOC100132488///RPS27、ZC3H12B、IQGAP2、SOX8、WHDC1L2、TNPO1、TNFRSF21、TSHZ2、DMRTC1///DMRTC1B、GSTM1、GSTM2、PNMA6A、CAND1、CCND3、GSTM1、GUSBL2。
如权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括确定卒中致因的步骤。
如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述患者患有神经学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADH1B、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CASP5、CAV1、CNTN4、DIP2C、ELAVL2、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FAM13A、FAM149A、FAT1、FOLH1、FOXC1、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、GRM5、GSTM1、HESX1、HOXC6、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LAMB4、LIFR、LTBR、MECOM、NBPF10、NDST3、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PDE1A、RFX2、ROBO1、S100A12、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SOX9、SPOCK3、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TRPM1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、UNC5B、UNC84A和ZNF608。
如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述患者患有骨骼或肌肉病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、ELAVL2、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、HOXC6、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LIFR、LTBR、LUM、MAPK14、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SOX9、SPOCK3、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述患者患有炎性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CAV1、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FBLN7、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LHX2、LNPEP、LRP2、LTBR、LUM、MAPK14、MECOM、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SMURF2、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述患者患有心血管病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ALPL、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、C18ORF54、CACNA1I、CARD16、CAV1、CNTN4、DMRT1、DNAH14、EDAR、EPHX2、ERAP2、FAM13A、FOLH1、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、GSTM1、IL1B、IQGAP2、LIFR、LTBR、MAN1C1、MAPK14、MBNL1、MCF2L、MECOM、MYBPC1、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RORB、S100A12、SMURF2、SNRPN、SOX9、SPOCK3、SPON1、TFPI、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述患者患有免疫学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FAT1、FOSB、GABRB2、GOLGA6L2、GSTM1、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述患者患有代谢病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、EPHX2、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述患者患有内分泌系统病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述患者患有自身免疫病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述患者患有糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述患者患有结缔组织病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述患者患有风湿性疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述患者患有关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B、ZNF438。
如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述患者患有动脉粥样硬化，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FOSB、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述患者患有炎症性肠病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、IL1B、LHX2、LNPEP、LTBR、MECOM、NOS3、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述患者患有非胰岛素依赖型糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、MBNL1、NOS3、NTM、ODZ2、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SPON1、SRGAP1、TLR5、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述患者患有类风湿性关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述患者患有冠状动脉疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述患者患有克罗恩病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、LHX2、LNPEP、MECOM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述患者患有神经退行性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述患者患有阿尔茨海默病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中与对照相比，选自以下的一个或多个基因的表达水平升高，并且所述患者被确定为患动脉粥样硬化：MMP16、MMP19、MMP26、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL10A1、COL11A1、COL25A1、COL27A1、FGF和EGFR。
如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在转录水平上测定所述生物标志物的表达水平。
如权利要求1‑33中任一项所述的方法，其中通过检测TIA相关基因的探针与所述生物样本中所述生物标志物的基因转录物的杂交来测定表达水平。
如权利要求34所述的方法，其中所述杂交步骤在核酸微阵列芯片上进行。
如权利要求34所述的方法，其中所述杂交步骤在微流体测定板中进行。
如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中通过扩增所述生物标志物的基因转录物来测定表达水平。
如权利要求37所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。
如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在蛋白水平上测定所述生物标志物的表达水平。
如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中测定至少15种生物标志物的表达水平。
如权利要求1至40中任一项所述的方法，其还包括获得生物样本的步骤。
如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述生物样本是血液、血清或血浆。
如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述对照是多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平。
如权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种内源性参照生物标志物选自：USP7、MAPRE2、CSNK1G2、SAFB2、PRKAR2A、PI4KB、CRTC1、HADHA、MAP1LC3B、KAT5、CDC2L1///CDC2L2、GTSE1、CDC2L1///CDC2L2、TCF25、CHP、LRRC40、hCG_2003956///LYPLA2///LYPLA2P1、DAXX、UBE2NL、EIF1、KCMF1、PRKRIP1、CHMP4A、TMEM184C、TINF2、PODNL1、FBXO42、LOC441258、RRP1、C10orf104、ZDHHC5、C9orf23、LRRC45、NACC1、LOC100133445///LOC115110和PEX16。
如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述对照是健康个体中相同生物标志物的表达水平。
如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述对照是能代表健康个体群体的阈值表达水平。
如权利要求1至46中任一项所述的方法，其还包括为患者提供TIA的合适的治疗或预防方案的步骤。
固体支持物，其包含多种能够与表2中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表5A中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表5B中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表5C中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表5D中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表7中所示的多个基因杂交的核酸，多种能够与表8中所示的多个基因杂交的核酸，以及多种能够与表9中所示的多个基因杂交的核酸。
如权利要求48所述的固体支持物，其包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：GUSBL2、GSTM1、FLJ30375、SCN2A、DKFZP434B061、EDAR、ATG9B、DIP2C、LTBR、SMURF2、FAM55D、IGFBP5和ZNF512B。
如权利要求48至49中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：SNIP、BXDC5、FAT3、LECT2、THSD4、CCDC144C///LOC100134159、OVOL2、SPTLC3、CLEC4E、GLYATL1、RBMS3、SPIB、DKFZP434L187、GADL1、SHOX、TBX5、UNC5B、PGM5、TIMP2、ELL2、CXADR和RNF141。
如权利要求48至50中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：RPL22、SNIP、SH3GL3、MCTP1、FAT3、SPTLC3、RBMS3、SNRPN和TIMP2。
如权利要求48至51中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：FGD4、F5、ABCA1、LOC100290882、LTB4R、UBXN2B、CKLF、CLEC4E、PHTF1、ENTPD1、OSBPL1A、RRAGD、CPEB2、CKLF、BST1和CKLF。
如权利要求48至52中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：ZNF608、FCHO2、ST3GAL6、ABCA1、THBD、AMN1、QKI、KIAA0319、MCTP1、VNN3、UBR5、FAR2、RBM25、CHMP1B、LAMP2、VAPA、IFRD1、HNRNPH2、REM2和GAB1。
如权利要求48至53中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：THSD4、SNRPN、ASTN2、SNIP、FAT3、TIMM8A、CCDC144C///LOC100134159、ANKRD28、TBX5、PGM5、SCD5、FCRL4、SHOX、CCRL1、LECT2、PTPRD、CCDC144A、LDB3、LOC729222///PPFIBP1、RBMS3、P704P、GYPA、PRTG、GABRB2、HNRNPUL2、ELAVL2、SPTLC3、FOXA2、DLX6、ALDOAP2和FLJ35934。
如权利要求48至54中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：RPL22、LOC100129488、LOC283027、LOC344595、THSD4、FAT3和P704P。
如权利要求48至55中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：SNIP、BXDC5、FAT3、LECT2、THSD4、CCDC144C///LOC100134159、OVOL2、SPTLC3、CLEC4E、GLYATL1、RBMS3、SPIB、DKFZP434L187、GADL1、SHOX、TBX5、UNC5B、PGM5、TIMP2、ELL2、CXADR、RNF141、RPL22、SH3GL3、MCTP1、SNRPN、FGD4、F5、ABCA1、LOC100290882、LTB4R、UBXN2B、CKLF、PHTF1、ENTPD1、OSBPL1A、RRAGD、CPEB2、CKLF、BST1、ZNF608、FCHO2、ST3GAL6、THBD、AMN1、QKI、KIAA0319、MCTP1、VNN3、UBR5、FAR2、RBM25、CHMP1B、LAMP2、VAPA、IFRD1、HNRNPH2、REM2、GAB1、ASTN2、TIMM8A、CCDC144C///LOC100134159、ANKRD28、SCD5、FCRL4、CCRL1、LECT2、PTPRD、CCDC144A、LDB3、LOC729222///PPFIBP1、P704P、GYPA、PRTG、GABRB2、HNRNPUL2、ELAVL2、FOXA2、DLX6、ALDOAP2、FLJ35934、LOC100129488、LOC283027和LOC344595。
如权利要求48至56中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：EBF1、GRM5、TSKS、ENPP2、AP3S2、LRRC37A3、C16orf68、LOC284751、IRF6、LHFP、BANK1、ARHGEF5、ZNF254、TFDP1、COL13A1、GSTK1、ADAMTSL4、P2RX5、LHFP、PIK3C2B、CHURC1、EXT2、HLA‑DOA、OOEP、ZNF185、TMEM19、FCRL1、FLJ40125、ARHGEF12、CLEC18A、CD46、PTPN20A///PTPN20B和C19orf28。
如权利要求48至57中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：EBF1、FLJ31945、C16orf68、SLC20A1、DOPEY2、COL13A1、LHFP、LOC284751、GRM5、LOC100144603、MTBP、SHOX2、ARHGEF5、RNF7、CLASP2、GIPC2、RANBP10、CMBL、LOC100127980、CYTH3、PROCR、LOC146880、SLC6A19、ICAM4、C12orf42、ARHGEF12、PRSS35、NT5E、LOC100271832、LHFP、NT5E和AKR1C3。
如权利要求48至58中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：CMTM1、COL13A1、SDC4、C6orf164、GPR176、BRUNOL6、SNORA68、MIF///SLC2A11、DUSP16、HIPK2、TTC7A、PPIE、GRLF1、MAP3K7IP1、LOC100129034、PER3、SMC1A和LRRC43。
如权利要求48至59中任一项所述的固体支持物，其还包含多种能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：USP7、MAPRE2、CSNK1G2、SAFB2、PRKAR2A、PI4KB、CRTC1、HADHA、MAP1LC3B、KAT5、CDC2L1///CDC2L2、GTSE1、TCF25、CHP、LRRC40、hCG_2003956///LYPLA2///LYPLA2P1、DAXX、UBE2NL、EIF1、KCMF1、PRKRIP1、CHMP4A、TMEM184C、TINF2、PODNL1、FBXO42、LOC441258、RRP1、C10orf104、ZDHHC5、C9orf23、LRRC45、NACC1、LOC100133445///LOC115110、PEX16。
如权利要求48至60中任一项所述的固体支持物，其中所述固体支持物是微阵列。

说明书用于诊断短暂性缺血发作的生物标志物
相关申请的引用
本申请要求2010年7月14日提交的美国临时申请号61/364,334的优先权，通过引用将其全部公开内容并入本文用于所有目的。
关于在联邦政府资助的研究和开发下作出的发明的权利的声明
本发明是在国立卫生研究院资助的NS056302号基金下的政府支持中完成的。政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明提供了用于诊断和预测短暂性缺血发作(TIA)的风险和致因的方法和组合物。
发明背景
短暂性缺血发作(TIA)是常见的，仅在美国，每年就侵袭超过三十万人。尽管从定义来看，TIA症状会得到缓解，但TIA绝不是不严重的。多达25%的TIA患者在TIA后的数天至数周内发生复发性缺血性血管事件(1‑3)。虽然其具有高发病率和临床重要性，特异性靶向TIA的疗法的开发仍受到关于其内在生物学的知识匮乏的限制。此外，对TIA的临床诊断是不完善的，并且在错误地诊断为患TIA的个体中进行的大量评价是昂贵的(4)。
我们之前已经证实，大鼠中的血液基因表达谱在实验性缺血性卒中和TIA之后发生改变(5)。模拟人类TIA的大鼠中非常短暂的局部缺血，引发脑组织中特征为热激蛋白(HSP70)表达升高、小神经胶质细胞活化和巨噬细胞浸润的明显改变(6)。脑细胞功能和炎症中的这种变化改变了血液免疫细胞，利用全基因组表达分析能检测到这一过程(5)。此外，基因及相关功能通路在非常短暂的缺血和缺血性卒中之间明显不同(5)。
人类TIA还与系统性炎症中的改变相关。TIA患者倾向于具有升高的C反应蛋白(CRP)(7)、IL‑6、VCAM‑1和细胞因子水平，以及升高的白细胞计数(8‑10)。Lp‑PLA2是一种不稳定的动脉粥样硬化斑块的标志物，其同纤维蛋白原(13‑14)和D二聚物(15)一样，也与TIA相关(11‑12)。这些生物学差异能否代表TIA的致因或结果仍不清楚。然而，更好地理解由这些差异所代表的病理生理学将有助于开发针对TIA的疗法。
基因表达已被用于鉴定缺血性卒中患者和对照之间的差异(16‑18)，但是这类研究尚未应用于TIA。本发明在一定程度上依赖于提供对TIA患者中存在的免疫学差异的了解的基因表达谱。
发明概述
本发明提供了用于确定短暂性缺血发作的发生、预测发生的风险和预测短暂性缺血发作致因的组合物和方法。
因此，在一方面，本发明提供了诊断短暂性缺血发作(TIA)或经历TIA的倾向的方法，所述方法包括：测定来自患者的生物样本中多种TIA相关生物标志物的表达水平，其中与对照相比，表达水平的升高或降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险，其中所述多种TIA相关生物标志物选自表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和9所示的生物标志物。
在一些实施方案中，所述方法还包括从患者获得生物样本。在一些实施方案中，所述生物样本是血液、血清或血浆。
在一些实施方案中，在疑似缺血事件之后3小时或更短时间进行测定步骤。在一些实施方案中，在疑似缺血事件之后3小时或更长时间，例如在疑似缺血事件之后约6、12、24、36、48或更多小时，进行测定步骤。在一些实施方案中，在疑似缺血事件之后至少24小时进行测定步骤。
在一些实施方案中，选自以下的一种或多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：DKFZP434B061、FAM55D、FLJ30375、IGFBP5、LTBR和SCN2A。在一些实施方案中，选自以下的一种或多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：GABRB2、ELAVL3、TWIST1、DPPA4、DKFZP434P211、DLX6、ZNF479、ASTN2、SNX31、ALS2CR11、LOC440345。
在一些实施方案中，选自以下的一种或多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：GABRB2、ELAVL3、COL1A1、SHOX2、GABRB2、TWIST1、DPPA4、DKFZP434P211、WIT1、SOX9、DLX6、ANXA3、EPHA3、SOX11、SLC26A8、CCRL1、FREM2、STOX2、ZNF479、LOC338862、ASTN2、FOLH1、SNX31、KREMEN1、ZNF479、ALS2CR11、FIGN、RORB、LOC732096、GYPA、ALPL、LHX2、GALNT5、SRD5A2L2、GALNT14、OVOL2、BMPR1B、UNC5B、ODZ2、ALPL、RASAL2、SHOX、C19orf59、ZNF114、SRGAP1、ELAVL2、NCRNA00032、LOC440345、FLJ30375、TFPI、PTGR1、ROBO1、NR2F2、GRM5、LUM、FLJ39051、COL1A2、CASP5、OPCML、TTC6、TFAP2B、CRISP2、SOX11、ANKRD30B、FLJ39051、SCN2A、MYNN、FOXA2、DKFZP434B061、LOC645323、SNIP、LOC645323、LOC374491、ADAM30、SIX3、FLJ36144、CARD8、KREMEN1、RP1‑127L4.6、FAM149A、B3GAT2、SPOCK3、G30、ITGBL1、IQGAP3、C7orf45、ZNF608、LOC375010、LRP2、TGFB2、SHOX2、HOXC4///HOXC6、ELTD1、FAM182B///RP13‑401N8.2、PRO0478、LIFR、FOLH1、EHF、NDST3、BRUNOL5、LOC728460、PDE1A、POU2AF1、FAT1、PCDH11X///PCDH11Y、FLJ37786、SLC22A4、DHRS13、EHF、MEG3、PIWIL1、LOC203274、LOC100133920///LOC286297、DMRT1、ADM、VWA3B、GAFA3、HESX1、ADAMDEC1、CAV1、LAMB4、TPTE、PPP1R1C、HPSE、AIM2、RUNDC3B、CARD16、FAM124A、MGC39584、OSM、RFX2、MYBPC1、LTBR、C18orf2、SNRPN、FLJ36031、IL1B、TRPM1、OSTCL、MAPK14、KCNJ15///LOC100131955、FIGN、HNT、S100A12、CHIT1、C7orf53、FAM13A1、GNAO1、MAPK14、FAM55D、PRKD2、LIMK2、C18orf54、IGFBP5、EVI1、PLSCR1、FOXC1、LOC646627、ZNF462、CNTLN、ZNF438、DEFB105A///DEFB105B、LOC340017、C1orf67、ACSL1、ADH1B、SLC2A14///SLC2A3、IL1B、ST3GAL4、UBE2J1、PNPLA3和PAPPA。
在一些实施方案中，选自以下的一种或多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：ATG9B、DIP2C、EDAR、GSTM1、GUSBL2、SMURF2、ZNF512B。
在一些实施方案中，选自以下的一种或多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：NBPF10///RP11‑94I2.2、SFXN1、SPIN3、UNC84A、OLFM2、PPM1K、P2RY10、ZNF512B、MORF4L2、GIGYF2、ERAP2、SLFN13、LOC401431、MED6、BAIAP2L1///LOC100128461、LNPEP、MBNL1、NOS3、MCF2L、KIAA1659、SCAMP5、LOC648921、ANAPC5、SPON1、FUS、GPR22、GAL3ST4、METTL3、LOC100131096、FAAH2、SMURF2、SNRPN、FBLN7、GLS、G3BP1、RCAN3、EPHX2、DIP2C、CCDC141、CLTC、FOSB、CACNA1I、UNQ6228、ATG9B、AK5、SPIN3、RBM14、SNRPN、MAN1C1、HELLS、EDAR、SLC3A1、ZNF519、LOC100130070///LOC100130775///LOC100131787///LOC100131905///LOC100132291///LOC100132488///RPS27、ZC3H12B、IQGAP2、SOX8、WHDC1L2、TNPO1、TNFRSF21、TSHZ2、DMRTC1///DMRTC1B、GSTM1、GSTM2、PNMA6A、CAND1、CCND3、GSTM1、GUSBL2。
在一些实施方案中，选自FLJ30375、SCN2A、DKFZP434B061、LTBR、FAM55D和IGFBP5中的2、3、4、5、6、7或更多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的升高，以及选自GUSBL2、GSTM1、EDAR、ATG9B、DIP2C、SMURF2和ZNF512B中的2、3、4、5、6、7或更多种或全部TIA相关生物标志物表达水平的降低，指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险。
在一些实施方案中，所述方法还包括测定选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平：CNTN4、TLR5、GPR84、BCL6、NELL2、APBA2和MLL。在一些实施方案中，检测到选自以下的生物标志物表达水平的升高指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险：CNTN4、TLR5、GPR84和BCL6。在一些实施方案中，检测到选自NELL2、APBA2和MLL的生物标志物表达水平的降低指示所述患者罹患TIA或有经历TIA的风险。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定卒中致因的步骤。在一些实施方案中，患者过表达表7中所示的多个基因，其指示慢性炎症状态。在一些实施方案中，与对照相比，选自以下的一种或多种或全部基因的表达水平升高，并且患者被确定为患动脉粥样硬化：MMP16、MMP19、MMP26、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL10A1、COL11A1、COL25A1、COL27A1、FGF和EGFR。
在一些实施方案中，患者表现出TIA的症状。在一些实施方案中，患者没有症状。
在一些实施方案中，所述方法还包括为患者提供TIA的合适的治疗或预防方案的步骤。
在一些实施方案中，在转录水平上测定生物标志物的表达水平。例如，可以测定生物标志物的RNA水平。RNA可以是mRNA、rRNA、tRNA或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，利用微阵列测定RNA表达的水平。
在一些实施方案中，通过检测TIA相关基因的探针与生物样本中生物标志物的基因转录物的杂交来测定表达水平。
在一些实施方案中，杂交步骤在核酸微阵列芯片上进行。在一些实施方案中，杂交步骤在微流体测定板中进行。
在一些实施方案中，通过扩增生物标志物的基因转录物来测定表达水平。在一些实施方案中，扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。
在一些实施方案中，在蛋白水平上测定生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，测定至少15种生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，测定约15‑85、20‑70、30‑60或40‑50种生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，测定约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种或更多种生物标志物。能够同时或相继测定多种生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，对照是多种表达的内源性参照生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，一种或多种或全部内源性参照生物标志物列举在表3中。在一些实施方案中，与多种稳定表达的内源性参照生物标志物(例如，表3中所示的那些生物标志物)的表达水平相比，TIA相关生物标志物过表达或低表达至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1fold、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。在一些实施方案中，测定选自以下的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或全部内源性参照生物标志物的表达水平作为对照：USP7、MAPRE2、CSNK10、SAFB2、PRKAR2A、PI4KB、CRTC1、HADHA、MAP1LC3B、KAT5、CDC2L1///CDC2L2、GTSE1、CDC2L1///CDC2L2、TCF25、CHP、LRRC40、hCG_2003956///LYPLA2///LYPLA2P1、DAXX、UBE2NL、EIF1、KCMF1、PRKRIP1、CHMP4A、TMEM184C、TINF2、PODNL1、FBXO42、LOC441258、RRP1、C10orf104、ZDHHC5、C9orf23、LRRC45、NACC1、LOC100133445///LOC115110、PEX16。
在一些实施方案中，对照是健康个体中相同生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，对照是未经历血管事件(例如，TIA、缺血性卒中、心肌梗塞、周围血管性疾病或静脉血栓栓塞)的个体中相同生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，对照是能代表健康的个体群体的阈值表达水平，例如相同TIA相关生物标志物的阈值表达水平，所述阈值表达水平任选地相对于稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平进行标准化。
在相关方面，本发明提供了固体支持物，其包含多种能够与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因杂交的核酸，其中所述核酸与固体支持物连接。在一些实施方案中，固体支持物包含多种能够与表1和2中所示的多个基因杂交的核酸。固体支持物还可以包含多种能够与表3中所示的多个基因杂交的核酸。固体支持物可以与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8、9和/或3中所示的至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、85、90、95或100或更多个基因连接。固体支持物可以是微阵列。
在一实施方案中，固体支持物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多种或全部能够与选自以下的多个基因杂交的核酸：GUSBL2、GSTM1、FLJ30375、SCN2A、DKFZP434B061、EDAR、ATG9B、DIP2C、LTBR、SMURF2、FAM55D、IGFBP5和ZNF512B。
定义
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所述技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学与杂交中的实验方案是本领域内公知且常用的那些。核酸和肽合成中使用标准技术。通常，酶促反应以及纯化步骤按照厂商的说明书进行。技术和方案通常按照本领域内常规的方法和各种普通参考文献进行(通常参见，Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3rd ed.(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel,et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,1990‑2008,Wiley Interscience)，其提供在整篇文件中。本文使用的命名以及下文描述的分析化学和有机合成中的实验方案是本领域内公知且常用的那些。化学合成和化学分析中使用标准技术或其改进技术。
本文使用的“缺血”或“缺血事件”指特征为由于向局部区域的血管堵塞而造成对该区域的血液供给(即循环)不足的疾病和病症。缺血包括例如，卒中和短暂性缺血发作。卒中包括例如，缺血性卒中(包括但不限于，心源性卒中、动脉粥样硬化性栓塞性或动脉粥样硬化性血栓性卒中(即由颈动脉、主动脉、心脏和脑的动脉粥样硬化导致的卒中)、小血管性卒中(即腔隙性卒中)、由血管壁疾病(即血管炎)导致的卒中、由感染导致的卒中、由血液学病症导致的卒中、由偏头痛导致的卒中以及由药物(如激素疗法)导致的卒中)、出血性缺血性卒中、脑出血以及蛛网膜下出血。
术语“短暂性缺血发作”、“TIA”或“微卒中”可互换使用，指向脑的某部位的血液供应发生的改变，从而导致短暂的神经功能障碍，根据定义，持续时间少于24小时。根据定义，TIA在24小时内缓解，但是大多数TIA症状在数分钟内缓解。如果症状持续更久，则将其归为卒中。症状包括暂时性视觉失明(通常为一过性黑蒙)；言语困难(失语症)；一侧身体机能减弱(轻偏瘫)；麻木或发麻(感觉异常)，通常发生在身体的一侧，以及头晕眼花、协调性丧失或平衡性差。TIA的症状通常持续几秒至几分钟，并且大多数症状在60分钟内消失。
“TIA参照表达谱”指相对于对照中的表达(例如，没有缺血事件的个体中的表达水平或稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平)，罹患TIA或有经历TIA风险的个体中差异表达(即过表达或低表达)的一组基因(例如，表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因)的表达模式。来自表1、5B、5C、5D、7、8和/或9的至少以高于对照水平约1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍的水平表达的基因是TIA中过表达的基因，来自表2、5A、5C、5D、7、8和/或9的以低于对照水平至少约1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍的水平表达的基因是TIA中低表达的基因。可选地，以高于对照水平至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的水平表达的基因是TIA中过表达的基因，以低于对照水平至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的水平表达的基因是TIA中低表达的基因。
“多个”指两个或更多个，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多个(例如，基因)。在一些实施方案中，多个指约15‑85、20‑60或40‑50个基因，例如，约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个基因的同时测定。在一些实施方案中，“多个”指一个或多个或全部表格中所示的全部基因，例如，表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的全部基因。
术语“患者”、“个体(subject)”或“个体(individual)”可互换使用，指哺乳动物，例如人或非人哺乳动物，包括灵长类(例如，猕猴、黑猩猩、类人猿)、家养哺乳动物(例如，猫、犬)、农业哺乳动物(例如，牛、羊、猪、马)和实验哺乳动物或啮齿动物(例如，鼠属动物、鼠科动物、兔、仓鼠、豚鼠)。
“样本”或“生物样本”包括诸如活检和尸检样本的组织切片以及采集用于组织学目的的冷冻切片。这类样本包括血液、唾液、组织、裂解的细胞、脑活检物、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿液等。生物样本通常获自真核生物，最优选获自哺乳动物，如灵长类，例如，黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿类，例如，豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬行类动物；或鱼。
本文使用的“阵列”指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”或通俗来讲也称为“芯片”，通常描述于现有技术中，例如，美国专利号5,143,854、5,445,934、5,744,305、5,677,195、6,040,193、5,424,186和Fodor et al.、Science、251:767‑777(1991)。通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。利用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于例如，美国专利号5,384,261。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽，其它合适的基底描述于例如，美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵，其描述于例如美国专利号5,856,174和5,922,591。
术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA区段；其包括编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合特性，以及与参照核酸以相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺、甲基磷酸、手性甲基磷酸、2‑O‑甲基核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指出，具体的核酸序列还包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生下述序列来实现，该序列中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代(Batzer et al.、Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.、J.Biol.Chem.260:2605‑2608(1985)；Rossolini et al.、Mol.Cell.Probes8:91‑98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。
短语“严紧杂交条件”指这样的条件：在该条件下，探针与其靶序列(通常位于核酸的复杂混合物中)杂交，而不与其它序列杂交。严紧杂交条件是序列依赖性的，且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详细指导见于Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology‑‑Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，对于规定的离子强度、Ph下的具体序列，严紧杂交条件选择为低于其热熔点约5‑10°C。Tm是这样的温度(在规定的离子强度、Ph和核酸浓度下)：在该温度下，在平衡时，与靶标互补的探针中的50%与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，因此在Tm下，平衡时，50%的探针被占据)。严紧杂交条件是下述条件，其中盐浓度低于约1.0M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)、Ph7.0至8.3、温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30°C，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60°C。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来实现严紧杂交条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少2倍，任选地为背景杂交的10倍。示例性的严紧杂交条件可以如下：50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS，于42°C孵育，或者5×SSC、1%SDS，于65°C孵育，在65°C下、0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。
如果核酸编码的多肽基本上相同，则在严紧杂交条件不彼此杂交的这些核酸仍是基本上相同的。例如，当利用遗传密码允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，就会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严紧的杂交条件下杂交。示例性的“中等严紧的杂交条件”包括在37°C下在40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中杂交，以及在45°C下在1×SSC中洗涤。阳性杂交是背景的至少两倍。本领域技术人员容易意识到，可以利用其它杂交和洗涤条件来提供相似严紧度的条件。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指基本上或实质上不含在材料天然状态下通常伴随其的成分的材料。通常利用分析化学技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)来确定纯度和同质性。作为制剂中的主要种类存在的蛋白是基本上纯化的。术语“纯化的”表示在电泳凝胶中基本上产生一个条带的核酸或蛋白。具体来说，其表示核酸或蛋白是至少85%纯的、更优选至少95%纯的，最优选至少99%纯的。
当涉及核酸的部分时，术语“异源的”表示核酸包含两种或更多种在自然界中没有发现彼此有相同关系的子序列。例如，核酸通常是通过重组产生的，具有来自不相关的基因的两条或更多条序列，这些序列被排列从而产生新的功能性核酸，例如，来自一种来源的启动子和来自另一来源的编码区。相似地，异源蛋白表示蛋白包含两种或更多种在自然界中没有发现彼此有相同关系的子序列(例如，融合蛋白)。
“表达载体”是利用一系列允许具体核酸在宿主细胞中转录的指定核酸元件，通过重组或合成方式产生的核酸构建体。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括与启动子可操作地连接的待转录的核酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可交换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸以相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及随后经修饰的氨基酸(例如，羟脯氨酸、α‑羧基谷氨酸和O‑磷酸丝氨酸)。“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即，与氢相连的α碳、羧基、氨基和R基)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但与天然存在的氨基酸以相似的方式发挥作用的化合物。
在本文中，氨基酸可以通过其公知的三字母符号或IUPAC‑IUB生化命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母密码来表示。
“保守型修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，保守型修饰的变体指编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果核酸不编码氨基酸序列，保守型修饰的变体指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任一给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因而，在由密码子指定为丙氨酸的每一位置，密码子可以被改变成所述的任一对应密码子，而不会改变所编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，其是一类保守型修饰的变异。本文中，编码多肽的每一核酸序列还描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员应当意识到，核酸中的每一密码子(除了AUG以及TGG，其中AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)都能被修饰，而产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异都暗含在每一所描述的序列中。
就氨基酸序列而言，本领域技术人员应当意识到，对于改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或小比例氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的取代、缺失或添加，如果这些改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代，则认为是“保守型修饰的变体”。提供功能上相似的氨基酸的保守型取代表是本领域内公知的。这类保守型修饰的变体是除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因之外的，但并不排除它们。
以下八组每组均含有彼此为保守型取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(I)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(参见例如，Creighton、Proteins(1984))。
对于两条或更多条核酸或多肽序列，术语“一致的”或“一致性”百分比是指，当利用以下序列比较算法中的一种或通过手动比对和目测检查，在比较窗或指定区域时上进行最大对应的比较和比对的测量时，相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即在TIA相关基因(例如，表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的基因)的指定区域上具有60%一致性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性)的两条或更多条序列或子序列。这类序列被称为“基本上一致的”。该定义还指测试序列的互补体。优选地，一致性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选在长度为50‑100个氨基酸或核苷酸的区域上。
为了序列比较，通常将一条序列用作参照序列，将测试序列与其比较。当利用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如果需要的话，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。随后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。对于核酸和蛋白与缺血相关核酸和蛋白的序列比较，使用下文所述的BLAST和BLAST2.0算法以及默认参数。
本文使用的“比较窗”包括具有选自20至600，通常为约50至约200，更通常为约100至约150中任一连续位置数的区段，其中在两条序列进行最佳比对之后，序列可以与相同连续位置数的参照序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域内公知的。可以进行用于比较的最佳序列比对，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目测检查(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995增补))。
适于确定序列一致性和序列相似性百分比的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389‑3402(1977)和Altschulet al.,J.Mol.Biol.215:403‑410(1990)中。利用本文描述的参数，使用BLAST和BLAST2.0确定本发明的核酸和蛋白的序列一致性百分比。进行BLAST分析的软件可通过国家生物信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字符鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，所述高评分序列对匹配或满足一些正值的阈值评分T。T被称为邻字符评分阈值(Altschul et al.,同上)。这些初始的邻字符命中作为开始搜索以找到包含它们的更长HSP的种子。所述字符命中沿每条序列双向延长，只要累积比对评分能够增加。对于核苷酸序列，利用参数M(对一对匹配残基的奖励分；总是>0)和N(对错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分。当出现以下情况时，在每个方向的字符命中延伸停止：累积比对评分从其最大实现值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积使累积分达到零或以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=‑4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认值：字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))，比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=‑4和两条链的比较。
BLAST算法还进行两条序列间相似性的统计学分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873‑5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指征。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中、最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001，则认为核酸与参照序列相似。
两条核酸序列或多肽基本上一致的指征是由第一核酸编码的多肽能与针对第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫交叉反应，如下文描述。因而，例如，如果两条肽的区别仅在于保守型取代，则多肽通常与第二多肽基本上相同。两条核酸序列基本上一致的另一指征是两个分子或其互补物能够在严紧杂交条件下彼此杂交，如下文描述。两条核酸序列基本上一致的另一指征是能使用相同引物来扩增序列。
短语“与.....选择性(或特异性)杂交”指在严紧杂交条件下，分子仅与复杂混合物(例如，总细胞DNA或RNA，或文库DNA或RNA)中存在的特定核苷酸序列结合、形成双螺旋或杂交。
“宿主细胞”表示含有表达载体并支持该表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是例如，原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞或哺乳动物细胞，例如CHO细胞)。
表达或活性的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”分别用来指利用表达或活性的体外和体内测定鉴定出的抑制性分子、活化分子或调解分子，例如，配体、激动剂、拮抗剂及以上的同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是，例如，能抑制本发明多肽或多核苷酸的表达，或结合、部分地或全部地阻断刺激或酶活性，使本发明多肽或多核苷酸的活性降低、阻止、延迟活化、失活、去敏感化或下调的试剂，例如，拮抗剂。活化剂是，例如，能诱导或活化本发明多肽或多核苷酸的表达，或结合、刺激、增加、开放、活化、促进、增强活化或酶活性，敏感化或上调本发明多肽或多核苷酸的活性的试剂，例如激动剂。调节剂包括天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。鉴定抑制剂和活化剂的测定包括，例如，在存在或不存在本发明多肽或多核苷酸的情况下，向细胞施加推定的调节剂化合物，随后测定对本发明多肽或多核苷酸活性的功能影响。将用可能的活化剂、抑制剂或调节剂处理的含有本发明多肽或多核苷酸的样本或测定与没有所述抑制剂、活化剂或调节剂的对照样本进行比较，以检测影响的程度。将对照样本(未用调节剂处理)指定为100%的相对活性值。当本发明多肽或多核苷酸的活性值相对于对照为约80%，任选地为50%或25‑1%时，实现了抑制。当本发明多肽或多核苷酸的活性值相对于对照为约110%、任选地为150%、任选地为200‑500%或1000‑3000%或更高时，实现了活化。
本文使用的术语“测试化合物”或“候选药物”或“调节剂”或语法等同词描述任何分子，天然存在的或合成的，例如，蛋白、寡肽(例如，长度为约5至约25个氨基酸，优选长度为约10至20或12至18个氨基酸，优选长度为12、15或18个氨基酸)、小有机分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、RNAi、寡核苷酸等。测试化合物可以为测试化合物文库的形式，诸如提供了足够多样性范围的组合或随机文库。测试化合物任选地与融合伴侣连接，所述融合伴侣例如靶向化合物、救援化合物、二聚化合物、稳定化化合物、可寻址化合物(addressable compound)及其它功能性部分。通常，通过以下来产生具有有用特性的新化学实体：鉴定具有一些期望特性或活性(例如，抑制活性)的测试化合物(称为“先驱化合物”)，产生先驱化合物的变体，以及评价那些变体化合物的特性或活性。通常，对这类分析利用高通量筛选(HTS)方法。
“小有机分子”指天然存在的或合成的、具有大于约50道尔顿且小于约2500道尔顿，优选小于约2000道尔顿，优选约100至约1000道尔顿，更优选约200至约500道尔顿的分子量的有机分子。
附图的简要说明
图1A‑B.短暂性缺血发作(TIA)患者和对照血液之间差异表达的460个基因/探针的热图(FDR≤0.05，绝对倍数变化>1.5)。X轴上的每一个柱代表1名患者，有24名TIA患者(蓝色)和27名对照(粉色)。Y轴上的每一行代表各个基因。如绿色箭头(顶部)所示，TIA与对照分开聚集。在TIA个体中，如红色箭头所示，至少两个聚集是明显的。这两个TIA聚集被标记为TIA1和TIA2。两名TIA患者(ID:57和90)与对照聚集在一起。三名对照(ID:42、68和74)与TIA聚集在一起。红色=上调。绿色=下调。ID=个体ID。诊断=蓝色(TIA)和粉色(对照)。
图2.能将TIA患者与对照个体区分开的460个TIA调控的基因中的34个的交叉验证结果。预测诊断的概率显示在Y轴上，个体显示在X轴上。TIA患者显示在右侧，对照个体在左侧。TIA的预测概率以红色显示，对照的预测概率以蓝色显示。利用10倍交叉验证，以87.5%的灵敏性和96.3%的特异性区分TIA患者与对照。
图3.通过PAM鉴定的能区分TIA1组和TIA2组的26个上调基因的交叉验证结果。预测诊断的概率显示在Y轴上，个体显示在X轴上。TIA1个体显示在左侧，TIA2个体在右侧。TIA2的预测概率以红色显示，TIA1的预测概率以蓝色显示。能够以100%的灵敏性和100%的特异性区分TIA1患者和TIA2患者。
图4A‑B.TIA患者(蓝色)和对照个体(粉色)中的MMP16(A)和MMP26(B)的转录物表达。A.MMP16.在所有对照个体与所有TIA患者的比较中(A1)，MMP16表达没有差异。与对照(p=1.35×10‑7)和TIA2组(p=2.19×10‑7)相比，TIA1患者中的MMP16表达显著升高，对照个体和TIA2患者间(A2)的MMP16表达没有差异。B.MMP26.在所有对照个体与所有TIA患者的比较中(B1)，MMP26表达没有差异。与对照(p=6.67×10‑4)和TIA2组(p=8.55×10‑4)相比，TIA1组中的MMP26表达显著升高，对照个体和TIA2患者间(A2)的MMP26表达没有差异。X轴显示个体的类别。Y轴显示log2强度/RNA表达。粉色=对照。深蓝色=所有的TIA或TIA1。浅蓝色=TIA2。
发明的详细描述
1.引言
尽管短暂性缺血发作(TIA)很常见，但对生物学机制仍然了解很少。本发明在一定程度上基于TIA差异性地调控血液中基因表达这一发现。指示TIA发生或发生的风险的差异调控的基因能用于诊断、治疗和预防患者的TIA。利用血液基因表达谱，能够从以前没有血管事件的对照区别出最近发生TIA的患者。此外，病人在短暂性缺血发作之后似乎会发展出不同的免疫应答亚型。
2.能够从本方法受益的个体
会从本方法受益的个体可以表现出TIA或卒中的症状。可选地，个体可以疑似经历TIA。在一些实施方案中，个体没有经历脑出血和/或没有患脑出血的风险。在一些实施方案中，个体没有经历脑出血或出血性卒中和/或没有患脑出血或出血性卒中的风险。在一些实施方案中，个体已被诊断为没有经历脑出血或出血性卒中和/或没有患脑出血或出血性卒中的风险。
在一些实施方案中，在疑似缺血事件的3小时内测定生物标志物组的表达水平。在一些实施方案中，在疑似缺血事件之后3小时或更长时间测定生物标志物组的表达水平。在一些实施方案中，在疑似缺血事件的6、12、18、24、36、48小时内测定生物标志物组的表达水平。
在一些情况下，个体没有症状，但可以具有经历TIA的风险或倾向，例如，基于遗传学、相关疾病状态、环境或生活方式判断出。例如，在一些实施方案中，患者患慢性炎性疾病，例如自身免疫病(例如，类风湿性关节炎、克罗恩病、炎症性肠病)、动脉粥样硬化、高血压或糖尿病。在一些实施方案中，患者具有高LDL‑胆固醇水平或患心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、冠状动脉疾病)。在一些实施方案中，患者患内分泌系统病症、神经退行性病症、结缔组织病症或骨骼与肌肉病症。与TIA关联、相关或由TIA引起的示例性病症提供在表7中。
在一些实施方案中，患者可以患有神经学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADH1B、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CASP5、CAV1、CNTN4、DIP2C、ELAVL2、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FAM13A、FAM149A、FAT1、FOLH1、FOXC1、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、GRM5、GSTM1、HESX1、HOXC6、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LAMB4、LIFR、LTBR、MECOM、NBPF10、NDST3、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PDE1A、RFX2、ROBO1、S100A12、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SOX9、SPOCK3、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TRPM1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、UNC5B、UNC84A和ZNF608。
在一些实施方案中，患者可以患有骨骼或肌肉病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、ELAVL2、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、HOXC6、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LIFR、LTBR、LUM、MAPK14、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SOX9、SPOCK3、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有炎性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CAV1、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FBLN7、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LHX2、LNPEP、LRP2、LTBR、LUM、MAPK14、MECOM、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SMURF2、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有心血管病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ALPL、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、C18ORF54、CACNA1I、CARD16、CAV1、CNTN4、DMRT1、DNAH14、EDAR、EPHX2、ERAP2、FAM13A、FOLH1、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、GSTM1、IL1B、IQGAP2、LIFR、LTBR、MAN1C1、MAPK14、MBNL1、MCF2L、MECOM、MYBPC1、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RORB、S100A12、SMURF2、SNRPN、SOX9、SPOCK3、SPON1、TFPI、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有免疫学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FAT1、FOSB、GABRB2、GOLGA6L2、GSTM1、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有代谢病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、EPHX2、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有内分泌系统病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有自身免疫病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有结缔组织病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有风湿性疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B、ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有动脉粥样硬化，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FOSB、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有炎症性肠病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、IL1B、LHX2、LNPEP、LTBR、MECOM、NOS3、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有非胰岛素依赖型糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、MBNL1、NOS3、NTM、ODZ2、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SPON1、SRGAP1、TLR5、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有类风湿性关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有冠状动脉疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有克罗恩病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、LHX2、LNPEP、MECOM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有神经退行性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
在一些实施方案中，患者可以患有阿尔茨海默病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
3.指示TIA发生或风险的生物标志物
指示TIA发生或可用于预测经历TIA风险的过表达的生物标志物列举在表1中。在实施本申请的方法中，测定来自表1的多种生物标志物的表达水平，任选地联合测定本文描述的(例如表2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中)和本领域内已知的其它TIA相关生物标志物。
优选地，测定总共约15‑85种的多种生物标志物的表达水平，例如约20‑70、30‑60或40‑50种生物标志物。可以同时或相继测定生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，测定表1中所示的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多种生物标志物的表达水平，任选地联合测定本文描述的(例如表2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中)和本领域内已知的其它TIA相关生物标志物。
在已经历TIA或有发展为TIA风险的患者中，表1的生物标志物相对于对照表达水平是过表达的。对照表达水平可以指未经历血管事件且没有血管事件风险的个体中相同生物标志物的表达水平，或者指稳定表达的内源性对照基因的表达水平。在已经历TIA或有发展为TIA风险的患者中，表1的生物标志物相对于对照表达水平过表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。














指示TIA发生或可用于预测经历TIA风险的低表达的生物标志物列举在表2中。在实施本申请的方法的过程中，测定表2的多种生物标志物的表达水平，任选地联合测定本文描述的(例如表1、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中)和本领域内已知的其它TIA相关生物标志物。在一些实施方案中，测定表2中所示的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多种生物标志物的表达水平，任选地联合测定本文描述的(例如表1、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中)和本领域内已知的其它TIA相关生物标志物。
在已经历TIA或有发展为TIA风险的患者中，表2的生物标志物相对于对照表达水平是低表达的。对照表达水平可以指未发生血管事件且没有血管事件风险的个体中相同生物标志物的表达水平，或者指稳定表达的内源性对照基因的表达水平。在已经历TIA或有发展为TIA风险的患者中，表2的生物标志物相对于对照表达水平低表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。











4.与对照表达水平的比较
将TIA相关生物标志物的表达与对照TIA的表达水平进行比较。如果合适的话，对照表达水平可以是另外的健康个体(例如，未经历TIA和/或没有经历TIA风险的个体)中相同TIA相关生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，如本文所述或本领域内已知的，对照表达水平是多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，对照表达水平是，例如，基于另外的健康个体群体中生物标志物的表达水平，相同TIA相关生物标志物的预定阈值表达水平。在一些实施方案中，将TIA相关生物标志物和另外的健康个体中TIA相关生物标志物的表达水平相对于例如多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平进行标准化，即，除以多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，相对于另外的健康个体中相同TIA相关生物标志物的表达，确定TIA相关生物标志物的过表达或低表达。例如，健康或正常对照个体未经历TIA和/或没有经历TIA的风险。健康或正常对照个体通常未经历血管事件(例如，TIA、缺血性卒中、心肌梗塞、周围血管性疾病或静脉血栓栓塞)。健康或正常对照个体通常没有一种或多种血管风险因子(例如，高血压、糖尿病、高脂血症或吸烟)。如果合适的话，可以将健康或正常对照个体中目标TIA相关生物标志物的表达水平相对于多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平进行标准化，即，除以多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，相对于一种或多种稳定表达的内源性参照生物标志物，确定TIA相关生物标志物的过表达或低表达。与对照患者相比，卒中或TIA患者的血液中内部控制生物标志物或内源性参照生物标志物以相同或接近相同的表达水平表达。卒中或TIA患者的血液中目标生物标志物以较高或较低的水平表达。通过将目标生物标志物的表达水平除以多种内源性参照生物标志物的表达水平，使目标生物标志物的表达水平相对于参照生物标志物标准化。目标生物标志物的标准化的表达水平可以用于预测卒中或TIA的发生与否和/或卒中或TIA的致因。
在一些实施方案中，将来自疑似患有或经历TIA的患者和来自对照患者的TIA相关生物标志物的表达水平相对于多种稳定表达的内源性参照生物标志物的表达水平标准化。将TIA相关生物标志物的标准化表达的表达水平与对照患者中相同TIA相关生物标志物标准化表达的表达水平进行比较。测定的表达倍数变化=TIA患者中目标生物标志物的标准化表达/对照患者中目标生物标志物的标准化表达。与健康对照患者中标准化的TIA相关生物标志物的表达水平相比，TIA患者中标准化的TIA相关生物标志物过表达或低表达至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍指示所述TIA患者已经历TIA或有经历TIA的风险。
在一些实施方案中，对照表达水平是预定的阈值水平。阈值水平可以对应于另外的健康个体或另外的健康个体群体中相同TIA相关生物标志物的表达水平，任选地，将其相对于多种内源性参照生物标志物的表达水平标准化。测定具有代表性数量的另外的健康个体和倾向于经历TIA的个体中的TIA相关生物标志物的表达水平和标准化表达水平之后，可以将TIA相关生物标志物的正常表达水平和TIA表达水平保持在数据库中，从而允许确定指示是否有经历TIA的风险或TIA发生的阈值表达水平。如果预定的阈值表达水平是相对于正常对照患者群体，则与阈值水平相比，TIA患者中TIA相关生物标志物过表达或低表达(通常是标准化的)至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍指示TIA患者已经历TIA或有经历TIA的风险。如果预定的阈值表达水平是相对于已知经历TIA或已知具有经历TIA风险的患者群体，则疑似经历TIA的患者中的表达水平大致等于阈值水平(或过表达或低表达的程度大于阈值表达水平)时，指示TIA患者已经历TIA或有经历TIA的风险。
关于用于比较的内源性参照生物标志物，优选地，内源性参照生物标志物是血液中稳定表达的。可用的示例性内源性参照生物标志物列举在下文的表3中。其它合适的内源性参照生物标志物公开于，例如，Stamova,et al.,BMC Medical Genomics(2009)2:49中。在一些实施方案中，测定多种内源性参照生物标志物的表达水平作为对照。在一些实施方案中，测定例如表3中所示的或本领域内已知的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或更多种或全部内源性参照生物标志物的表达水平作为对照。
在一些实施方案中，测定内源性参照生物标志物GAPDH、ACTB、B2M、HMBS和PPIB的表达水平作为对照。在一些实施方案中，测定选自以下的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多种或全部内源性参照生物标志物的表达水平作为对照：USP7、MAPRE2、CSNK1G2、SAFB2、PRKAR2A、PI4KB、CRTC1、HADHA、MAP1LC3B、KAT5、CDC2L1///CDC2L2、GTSE1、CDC2L1///CDC2L2、TCF25、CHP、LRRC40、hCG_2003956///LYPLA2///LYPLA2P1、DAXX、UBE2NL、EIF1、KCMF1、PRKRIP1、CHMP4A、TMEM184C、TINF2、PODNL1、FBXO42、LOC441258、RRP1、C10orf104、ZDHHC5、C9orf23、LRRC45、NACC1、LOC100133445///LOC115110、PEX16。
表3.可用于标准化及用作对照水平的血液中稳定表达的38种内源性参照生物标志物。




5.确定TIA致因的方法
本文描述的TIA相关生物标志物的子集还可用于预测或确定TIA的致因。
例如，过表达参与细胞外基质重塑的基因的患者可能患有动脉粥样硬化，所述基因包括选自以下的一种或多种或全部基因：MMP16、MMP19、MMP26、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL10A1、COL11A1、COL25A1、COL27A1、FGF和EGFR。
个体可以有经历TIA的风险或倾向，例如，基于遗传学、相关疾病状态、环境或生活方式来判断。例如，在一些实施方案中，患者患慢性炎症状态，例如患自身免疫病(例如，类风湿性关节炎、克罗恩病、炎症性肠病)、动脉粥样硬化、高血压或糖尿病。在一些实施方案中，患者具有高LDL‑胆固醇水平或患有心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、冠状动脉疾病)。在一些实施方案中，患者患有内分泌系统病症、神经退行性病症、结缔组织病症或骨骼和肌肉病症。与TIA关联、相关或由TIA引起的示例性病症提供在表7中。
在一些实施方案中，患者可以患有神经学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADH1B、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CASP5、CAV1、CNTN4、DIP2C、ELAVL2、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FAM13A、FAM149A、FAT1、FOLH1、FOXC1、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、GRM5、GSTM1、HESX1、HOXC6、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LAMB4、LIFR、LTBR、MECOM、NBPF10、NDST3、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PDE1A、RFX2、ROBO1、S100A12、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SOX9、SPOCK3、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TRPM1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、UNC5B、UNC84A和ZNF608。
在一些实施方案中，患者可以患有骨骼或肌肉病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、ELAVL2、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GIGYF2、GNAO1、HOXC6、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LIFR、LTBR、LUM、MAPK14、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SOX9、SPOCK3、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有炎性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CAV1、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、ERAP2、FAM124A、FBLN7、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LHX2、LNPEP、LRP2、LTBR、LUM、MAPK14、MECOM、MYBPC1、NOS3、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SCN2A、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SMURF2、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、TWIST1、UNC5B、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有心血管病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ALPL、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、BMPR1B、C18ORF54、CACNA1I、CARD16、CAV1、CNTN4、DMRT1、DNAH14、EDAR、EPHX2、ERAP2、FAM13A、FOLH1、FOSB、FREM2、GABRB2、GRM5、GSTM1、IL1B、IQGAP2、LIFR、LTBR、MAN1C1、MAPK14、MBNL1、MCF2L、MECOM、MYBPC1、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、OPCML、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RORB、S100A12、SMURF2、SNRPN、SOX9、SPOCK3、SPON1、TFPI、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有免疫学病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ANXA3、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CCRL1、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FAT1、FOSB、GABRB2、GOLGA6L2、GSTM1、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有代谢病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、EPHX2、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IGFBP5、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有内分泌系统病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LRP2、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有自身免疫病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、KCNJ15、LAMB4、LTBR、MAPK14、MYBPC1、NELL2、ODZ2、OPCML、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、SNRPN、SPON1、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TSHZ2、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、DNAH14、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、GUSBL2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、LTBR、MAPK14、MBNL1、NELL2、NOS3、NTM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SMURF2、SNRPN、SPON1、SRGAP1、TLR5、TSHZ2、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有结缔组织病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、COL1A1、COL1A2、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SHOX、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有风湿性疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TLR5、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CASP5、CCND3、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、LTBR、LUM、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B、ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有动脉粥样硬化，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FOSB、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有炎症性肠病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、IL1B、LHX2、LNPEP、LTBR、MECOM、NOS3、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有非胰岛素依赖型糖尿病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ADAM30、AK5、ALPL、ALS2CR11、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、CCRL1、CNTLN、CNTN4、COL1A2、DIP2C、DMRT1、EPHA3、FAT1、FOXA2、GABRB2、IL1B、IQGAP2、ITGBL1、MBNL1、NOS3、NTM、ODZ2、PLSCR1、ROBO1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SPON1、SRGAP1、TLR5、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有类风湿性关节炎，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、ADM、ASTN2(包括EG:23245)、BCL6、CARD8、CLTC、CNTN4、DIP2C、DNAH14、EDAR、EPHA3、EPHX2、FAM124A、FOSB、GABRB2、IL1B、KCNJ15、LAMB4、MAPK14、ODZ2、OSM、PAPPA、PDE1A、ROBO1、RUNDC3B、S100A12、SLC22A4(包括EG:6583)、TNFRSF21、TNPO1、TTC6(包括EG:115669)、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有冠状动脉疾病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、ASTN2(包括EG:23245)、BMPR1B、CARD16、CNTN4、DMRT1、DNAH14、ERAP2、FREM2、GRM5、IL1B、IQGAP2、LIFR、MAN1C1、MBNL1、MCF2L、MECOM、NOS3、NTM、ODZ2、OLFM2、PDE1A、ROBO1、RORB、SNRPN、SPOCK3、SPON1、TRPM1、UNC84A和VWA3B。
在一些实施方案中，患者可以患有克罗恩病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ACSL1、AK5、APBA2、ASTN2(包括EG:23245)、CARD8、DIP2C、DNAH14、ERAP2、FBLN7、FREM2、GRM5、LHX2、LNPEP、MECOM、ODZ2、OPCML、PAPPA、PDE1A、PPP1R1C、ROBO1、SFXN1、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC26A8、SNRPN、SPON1、TGFB2、TLR5、VWA3B和ZNF438。
在一些实施方案中，患者可以患有神经退行性病症，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SCN2A、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
在一些实施方案中，患者可以患有阿尔茨海默病，并且相对于选自以下的多种生物标志物的对照表达水平，所述患者具有所述生物标志物的升高或降低的表达：ASTN2(包括EG:23245)、CASP5、CNTN4、FAM124A、FOLH1、GABRB2、GRM5、IL1B、MECOM、NDST3、NOS3、OPCML、RFX2、SLC22A4(包括EG:6583)、SLC2A3、SLC3A1、SPON1、TSHZ2和ZNF608。
6.检测TIA相关生物标志物的方法
可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook,同上，和Ausubel,同上)，并且可以用于检测表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的基因的表达。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹、RNA酶保护测定)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA，包括例如，信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。
核酸杂交形式的选择不是关键的。多种核酸杂交形式是本领域技术人员已知的。例如，常见的形式包括夹心测定和竞争或替代测定。杂交技术通常描述于Hames and Higgins Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press(1985)；Gall and Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,63:378‑383(1969)；以及John et al.Nature,223:582‑587(1969)。
杂交复合物的检测可需要产信号复合物与靶标和探针多核苷酸或核酸的双螺旋的结合。通常，这种结合通过配体和抗配体相互作用而发生，例如配体偶联的探针和偶联有信号的抗配体之间的相互作用。通过暴露于超声能，信号生成复合物的结合也易于得到加速。
标记也可以允许间接检测杂交复合物。例如，如果标记是半抗原或抗原，可以通过使用抗体来检测样本。在这些系统中，通过将荧光或酶分子连接于抗体，或在一些情况下，通过连接于放射性标记而产生信号(参见例如，Tijssen,“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,”Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Burdon and van Knippenberg Eds.,Elsevier(1985),pp.9‑20)。
探针通常被直接标记，例如用同位素、发色团、发光团、色原体，或被间接标记，例如用生物素，链霉亲和素复合物随后可以与生物素结合。因此，本发明测定中所用的可检测的标记可以是一级标记(其中该标记包含可直接检测的元件或能产生直接可检测的元件的元件)或二级标记(其中可检测的标记与一级标记结合，例如，免疫标记中常用的)。通常，标记的信号核酸用于检测杂交。可以通过常用于检测杂交多核苷酸存在的数种方法中的任一种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用3H、125I、35S、14C或32P标记的探针等的放射自显影法。
其它标记包括，例如，能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。对标记、标记步骤和标记检测的介绍见于Polak and Van Noorden Introduction to Immunocytochemistry,第二版,Springer Verlag,NY(1997)；以及Haugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,由Molecular Probes,Inc.出版的联合手册和名录(1996)。
通常，监测具体探针或探针组合的检测器被用于检测检测试剂标记物。典型的检测器包括分光光度计、光电管和二极管、显微镜、闪烁计数器、照相机、胶片等，以及以上的组合。合适的检测器的实例可广泛地从本领域技术人员已知的多种商业途径获得。一般地，使包含结合的标记部分的底物的光学图像数字化，用于随后的计算机分析。
最通常地，通过检测试剂的结合、对固定于固体支持物的标记的量进行定量，来测量RNA的量。通常，相对于不含调节剂的对照孵育或者与为具体反应类型所建立的基线相比，孵育过程中调节剂的存在会增加或减少固定于固体支持物的标记的量。检测和定量标记的手段是本领域技术人员公知的。
在优选的实施方案中，将目标核酸或探针固定于固体支持物上。适用于本发明测定中的固体支持物是本领域技术人员已知的。本文使用的固体支持物是基本固定排列的材料基质。
例如，在本发明的一实施方案中，使用微阵列来检测基因表达模式。微阵列提供了一种同时测量大量基因表达水平的方法。每一阵列由连接于固体支持物的可复制模式的多种核酸(例如，能与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9所示的多个基因杂交的多种核酸)组成。标记的RNA或DNA与阵列上互补的探针杂交，然后通过激光扫描检测。测定阵列上每个探针的杂交强度，并将其转化成短暂性缺血发作中相对基因表达水平的定量读出。
在一些实施方案中，从个体获得样本，从该样本分离总mRNA，并将其转化成标记的cRNA，然后与阵列杂交。通过参照阵列上和样本中存在的合适对照来计算相对转录物水平。参见Mahadevappa and Warrington,Nat.Biotechnol.17,1134‑1136(1999)。
多种自动化固相测定技术也是合适的。例如，可从Affymetrix,Inc.(Santa Clara,CA)购得的大规模的固定化多聚物阵列(VLSIPSTM)能被用于同时检测参与同一调控通路的多个基因表达水平的变化。参见，Tijssen,同上,Fodor et al.(1991)Science,251:767‑777；Sheldon et al.(1993)Clinical Chemistry39(4):718‑719,以及Kozal et al.(1996)Nature Medicine2(7):753‑759。还可以使用本领域内可利用的集成微流体系统和其它医疗点(point‑of‑care)诊断装置。参见，例如，Liu and Mathies,Trends Biotechnol.(2009)27(10):572‑81和Tothill,Semin Cell Dev Biol(2009)20(1):55‑62。在检测多种核酸的表达水平中使用的微流体系统可获自，例如，NanoString Technologies,网址为nanostring.com。
例如，可以通过使用能特异性结合双螺旋核酸的标记的检测部分(例如，对RNA‑DNA双螺旋具有特异性的抗体)实现检测。一个优选的实例利用能识别DNA‑RNA异双螺旋的抗体，其中所述抗体与酶连接(通常通过重组或共价化学键)。当酶与其底物反应时，产生可检测的产物时，从而检测到抗体。Coutlee et al.(1989)Analytical Biochemistry181:153‑162；Bogulavski(1986)et al.J.Immunol.Methods 89:123‑130；Prooijen‑Knegt(1982)Exp.Cell Res.141:397‑407；Rudkin (1976)Nature265:472‑473,Stollar(1970)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 65:993‑1000；Ballard(1982)Mol.Immunol.19:793‑799；Pisetsky and Caster(1982)Mol.Immunol.19:645‑650；Viscidi et al.(1988)J.Clin.Microbial.41:199‑209；以及Kiney et al.(1989)J.Clin.Microbiol.27:6‑12描述了针对RNA双螺旋(包括同双螺旋和异双螺旋)的抗体。包含对DNA:RNA杂合体具有特异性的抗体的试剂盒可获自，例如，Digene Diagnostics,Inc.(Beltsville,MD)。
除了可购得的抗体之外，本领域技术人员利用已有的技术能够容易地制备对核酸双螺旋具有特异性的抗体，或能够修饰商购的或可公开获得的那些抗体。除了上文引用的技术之外，产生多克隆和单克隆抗体的一般方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Paul(第3版)Fundamental Immunology Raven Press,Ltd.,NY(1993)；Coligan,et al.,Current Protocols in Immunology,Wiley Interscience(1991‑2008)；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press,NY(1988)；Harlow and Lane,Using Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1999)；Stiteset al.(出版)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange Medical Publications,Los Altos,CA,以及其中引用的文献；Goding Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)Academic Press,New York,NY,(1986)；以及Kohler and Milstein Nature256:495‑497(1975))。其它适于抗体制备的技术包括选择噬菌体或相似载体中的重组抗体文库(参见，Huse et al.Science 246:1275‑1281(1989)；以及Ward et al.Nature341:544‑546(1989))。特异性的单克隆和多克隆抗体以及抗血清通常以至少约0.1μM，优选至少约0.01μM或更好，以及最通常和优选0.001μM或更好的KD来结合。
本发明中使用的核酸可以是阳性或阴性探针。阳性探针能与其靶标结合，双螺旋形成是靶标存在的证据。阴性探针不能与疑似靶标结合，未形成双螺旋是靶标存在的证据。例如，使用野生型特异性核酸探针或PCR引物可以充当测定样本中的阴性探针，在所述样本中，只存在感兴趣的核苷酸序列。
通过使用能增加待检测目标核酸的核酸扩增系统，可以增强杂交测定的灵敏性。这类系统的实例包括聚合酶链式反应(PCR)系统，尤其是RT‑PCR、多重PCR、定量PCR或实时PCR，以及连接酶链式反应(LCR)系统。本领域中近期描述的其它方法是基于核酸序列的扩增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)和Qβ复制酶系统。这些系统能用于直接鉴定突变体，其中，PCR或LCR引物被设计成仅在存在选定序列时才会被延伸或连接。可选择地，通常能够利用例如非特异性PCR引物扩增选定序列，并且随后探测扩增的靶区中指示突变的特定序列。还可利用高通量多元核酸测序或“深度测序”来检测捕获的表达的生物标志物基因。高通量测序技术是本领域内已知的(例如，在网址454.com上的454测序)。
测定本发明核酸的表达水平的可选方式是原位杂交。原位杂交测定是公知的，并且通常描述于Angerer et al.,Methods Enzymol.152:649‑660(1987)中。在原位杂交测定中，将细胞(优选人细胞，例如血细胞)固定于固体支持物(通常为玻璃载玻片)。如果欲探测DNA，则用加热或碱使细胞变性。然后，在中等温度下使细胞与杂交溶液接触，从而允许被标记的特异性探针退火。优选用放射性同位素或荧光报告子标记探针。
在其它实施方案中，用定量RT‑PCR来检测表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因的表达。适用技术的一般性综述可参见例如，A‑Z of Quantitative PCR,Bustin,ed.,2004,International University Line;Quantitative PCR Protocols,Kochanowski and Reischl,eds.,1999,Humana Press;Clinical Applications of PCR,Lo,ed.,2006,Humana Press;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis et al.eds.(1990))以及PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(Erlich,ed.(1992))。此外，扩增技术描述于美国专利号4,683,195和4,683,202中。本领域内已知的多重PCR方法适用于本发明。
因此，在本发明的一实施方案中，提供了包含多种多核苷酸的反应混合物，所述多核苷酸能够与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因的核酸序列特异性杂交(例如，引物)。在一些实施方案中，反应混合物是PCR混合物，例如，多重PCR混合物。
本发明依赖于重组遗传学领域的常规技术。通常，下文描述的重组DNA技术中的术语和实验方案是本领域内熟知的并且常用于本领域内。使用标准技术来进行克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应按照厂商的说明书进行。公开了本发明中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1994‑2008,Wiley Interscience))。
对于核酸，以千碱基(kb)或碱基对(bp)来给出大小。这些是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列得到的估计值。对于蛋白，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出大小。蛋白大小是从凝胶电泳、测序的蛋白、得到的氨基酸序列或公开的蛋白序列估算出的。
不可商购的寡核苷酸可以按照Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Letts.22:1859‑1862(1981)首次描述的固相亚磷酸酰胺三酯法，利用自动合成仪化学合成，如Van Devanter et.al.,Nucleic Acids Res.12:6159‑6168(1984)中所描述的。通过非变性丙烯酰胺凝胶电泳或通过Pearson&Reanier,J.Chrom.255:137‑149(1983)中所描述的阴离子交换HPLC进行寡核苷酸的纯化。
在一些实施方案中，在转录水平或蛋白水平上检测本文描述的生物标志物的表达水平。蛋白检测是本领域内公知的，并且可以使用本领域内已知的蛋白检测方法。示例性的测定多种蛋白表达水平的测定包括，例如，ELISA、流式细胞术、质谱分析(例如，MALDI或SELDI)、表面等离子共振(例如，BiaCore)、微流体技术和其它生物传感器技术。参见例如，Tothill,Semin Cell Dev Biol(2009)20(1):55‑62。
7.TIA参照谱
本发明还提供了缺血参照谱。TIA参照谱包括将多种TIA相关基因(即，表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因)的表达水平与TIA的发生或风险关联起来的信息。这种谱可以方便地用于诊断、监测和预测缺血。
可以将参照谱输入数据库，例如，包含符合预定种类的数据的关系数据库。每个表格或关系在纵行中含有一种或多种数据类别。每一横行含有纵行限定的类别的独有的数据实例。例如，本发明典型的数据库会包括这样的表格，在纵行描述样本的年龄、性别、生殖状况、表达谱等。另一表格描述疾病：症状、等级、样本鉴定、表达谱等。在一实施方案中，本发明将实验样本与参照样本的数据库匹配。数据库由多种不同的样本组合，以便用作参照样本。在一实施方案中，个体参照样本将获自就医过程中的患者。关于样本的生理状态、疾病状态和/或药理状态的信息也将通过任何可用的方法获得。这可以包括，但不限于，表达谱分析、临床分析、病史和/或患者面谈。例如，能够当面确定患者的年龄、性别、族源、症状或既往疾病诊断以及患者正进行的任何治疗的特征。采集多个这种参照样本。一个个体可以贡献一个参照样本或随时间可以贡献多个样本。本领域技术人员应当认识到，当数据库中参照样本的数量增加时，基于与数据库比较的预测的置信度也增加。
将数据库组织为参照样本组。每个参照样本含有关于生理状态、药理状态和/或疾病状态的信息。一方面，数据库是具有组织到三个数据表格中的数据的关系数据库，一个是主要通过生理状态将样本分组的表格、一个是主要通过疾病状态将样本分组的表格，一个是主要通过药理状态将样本分组的表格。在每个表格中，样本可以进一步按照两个余下的类别进行分组。例如，生理状态表可以按照疾病状态和药理状态被进一步分类。
如本领域技术人员所理解的，本发明还可以体现为方法、数据处理系统或程序产品。因此，本发明可以采用数据分析系统、方法、分析软件等形式。按照本发明编写的软件被存储在一些形式的计算机可读介质中(诸如存储器、硬盘、DVD ROM或CD ROM)或通过网络传输，并通过处理器执行。本发明还提供了用于分析生理状态、疾病状态等级和/或治疗效力的计算机系统。该计算机系统包括处理器和存储器，该存储器与编码一个或多个程序的所述处理器连接。存储器中所编码的程序使处理器执行上述方法的步骤，其中表达谱以及关于生理状态、药理状态和疾病状态的信息由计算机系统接收作为输入。计算机系统可用于执行本发明实施方案的软件(参见例如，美国专利号5,733,729)。
8.为患者提供合适的治疗和预防方案
在一些实施方案中，所述方法还包括为诊断为患TIA或有TIA或卒中发生风险的患者制定和提供合适的治疗和/或预防方案的步骤。例如，可以推荐能使风险因子最小化的药物和生活方式调整(例如，饮食、运动、压力)，包括降低血压和胆固醇水平，以及控制糖尿病。
此外，几种药物能够降低短暂性缺血发作后卒中的可能性。如果TIA已经发生，则药物的选择将取决于TIA的位置、致因、严重程度和类型。
在一些实施方案中，可以为患者制定抗血小板药物方案。最常用的抗血小板药物是阿司匹林。阿司匹林的替代品是抗血小板药物氯吡格雷(Plavix)。一些研究表明，阿司匹林与另一种抗血小板药物联合使用是最有效的。在一些实施方案中，为患者制定低剂量阿司匹林和抗血小板药物潘生丁(Aggrenox)的组合，以降低血凝。噻氯匹啶(Ticlid)是另一种可以用于预防或降低经历TIA的患者的卒中风险的抗血小板药物。
在一些实施方案中，可以为患者制定抗凝血剂方案。示例性的抗凝血剂包括阿司匹林、肝素、华法令和达比加群。
患有中度或重度颈动脉(neck artery)(颈动脉(carotid))狭窄的患者可能需要或受益于颈动脉内膜切除术。在另一次TIA或卒中发生之前，这种预防性的手术清除了颈动脉的脂肪沉积(动脉粥样硬化斑块)。在一些实施方案中，患者可能需要或受益于颈动脉成形术或支架。颈动脉成形术涉及利用囊样装置来打开阻塞的动脉，并将小线管(支架)放置在动脉内以保持其畅通。
9.固体支持物和试剂盒
本发明还提供了包含多种核酸探针的固体支持物，所述核酸探针能够与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9以及任选的3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。例如，固体支持物可以是连接了多种核酸探针的微阵列，所述核酸探针能够与表1以及任选的表3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。在多个实施方案中，固体支持物可以是连接了多种核酸探针的微阵列，所述核酸探针能够与表5A、5B、5C和5D以及任选的表3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。在多个实施方案中，固体支持物可以是连接了多种核酸探针的微阵列，所述核酸探针能够与表7以及任选的表3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。在多个实施方案中，固体支持物可以是连接了多种核酸探针的微阵列，所述核酸探针能够与表8以及任选的表3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。在多个实施方案中，固体支持物可以是连接了多种核酸探针的微阵列，所述核酸探针能够与表9以及任选的表3中所示的多个(例如，两个或更多个或全部)基因杂交。
在多个实施方案中，固体支持物被设置为排除与卒中或卒中致因的诊断、预测或确认无关或无法用于卒中或卒中致因的诊断、预测或确认的基因。例如，与对照表达水平相比，患有TIA或疑似患有TIA的个体中过表达或低表达小于1.5倍的基因可以从本申请的固体支持物排除。在一些实施方案中，与对照表达水平相比，缺血性卒中(包括心源性卒中、动脉粥样硬化性血栓性卒中以及心房纤颤后的卒中)个体中过表达或低表达小于1.2倍的基因可以从本申请的固体支持物排除。固体支持物可以包含多种核酸探针，所述核酸探针能够与本文所述的可用于诊断缺血性卒中、心源性卒中、颈动脉狭窄和/或心房纤颤的多种(例如，两种或更多种或全部)基因杂交。如果合适的话，可以将能够与可用于诊断缺血性卒中、心源性卒中、颈动脉狭窄和/或心房纤颤的多种(例如，两种或更多种或全部)基因杂交的核酸探针以预定的阵列排列在固体支持物上。在多个实施方案中，鉴定的非特异性核酸和/或与TIA的诊断不相关和/或不关联的核酸不被连接于固体支持物。在多个实施方案中，鉴定的非特异性核酸和/或与缺血性卒中、心源性卒中、颈动脉狭窄和/或心房纤颤的诊断不相关和/或不关联的核酸不被连接于固体支持物。固体支持物可以是试剂盒中的组分。
本发明还提供了用于诊断TIA或发展为TIA的倾向的试剂盒。例如，本发明提供了包括一个或多个反应容器的试剂盒，所述反应容器中具有本发明的部分或全部反应组分的小份。小份可以为液态或干燥形式。反应容器可以包括允许在同一容器中容纳、处理和/或扩增样本的样本处理盒或其它容器。试剂盒可以包含多种能够与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个基因杂交的核酸探针。探针可以固定在本文所描述的微阵列上。
此外，试剂盒可以包含便于扩增和/或检测反应的合适的缓冲液、盐及其它试剂(例如，引物、标记)，用于测定表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多个生物标志物的表达水平。试剂盒还可以包含使用试剂盒的书面说明书。
在一实施方案中，试剂盒包含多种能够与表1、2、5A、5B、5C、5D、7、8和/或9中所示的多种生物标志物结合的抗体。所述抗体可以固定或可以不固定于固体支持物(例如，ELISA板)上。
实施例
提供以下实施例用于说明，而非限制请求保护的发明。
实施例1：
材料和方法
个体
从加州大学戴维斯医学中心、加州大学旧金山医学中心和维克森林大学医学部招募TIA和对照患者。每个机构的机构审查委员会都批准了本研究，并且从每位患者获得了知情同意书。
在症状开始3至69小时(平均=29.2小时)内，将总共27例对照患者与24例TIA患者进行比较。由能获知所有临床数据的两名独立的有资质的神经病学医师做出TIA的诊断。TIA被定义为局灶脑功能或视觉功能的急性丧失，持续小于12小时，推测为缺血致因。为了被招募入本研究，需要TIA患者具有≥4的ABCD2评分，从而进一步支持TIA的诊断。这确保了所研究的TIA患者处于较高的血管事件复发风险(4，19)。对照从TIA患者的配偶或家庭成员或来自社区的人员招募。他们是没有血管事件的个体，所述血管事件例如TIA、缺血性卒中、心肌梗塞、周围血管性疾病或静脉血栓栓塞。还排除患有高血压和/或糖尿病的对照个体，以便降低对照患有沉默性TIA或其它血管事件的可能性。高血压和糖尿病二者均增加TIA的概率，如如ABCD2评分所示(4，20)。
RNA分离
将静脉血样本收集入PAXgene采血管(PreAnalytiX,Hilden,Germany)中。按照生产商的方案分离总RNA。
微阵列杂交
利用Ovation Whole Blood Solution(Nugen)试剂盒，按照方案从50ng总RNA合成生物素标记的cDNA。如之前所描述的(18)，在Affymetrix Human Genome HG‑U133‑Plus‑2.0微阵列上处理每个RNA样本。
统计学分析
将微阵列探针组水平的数据进行log变换，并利用Robust Multichip Average(RMA)标准化。在Partek Genomics Suite6.5(Partek Inc.,St.Louis,MI,USA)进行协方差分析(ANCOVA)，以鉴定在TIA和对照个体间具有显著差异的基因/探针，其中对微阵列进行批次影响和年龄的调整。Benjamini–Hochberg多重比较校正后，p值≤0.05、绝对倍数变化>1.5的基因/探针被认为是显著的。为了排除与高血压相关的基因，进行33例高血压对照与非高血压对照的第二次比较。将鉴定出的与TIA基因列表重叠的“高血压”基因从进一步的分析排除。
将所有数据表示为平均值±标准误。视情况，利用卡方检验或t检验分析组间人口统计学数据的差异。利用Prediction Analysis of Microarrays(PAM)中的10倍留一交叉验证进行预测分析。利用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)进行功能和通路分析。
结果
个体
TIA和对照个体的人口统计学信息表明，年龄在TIA和对照之间具有显著差异(表4)。因此，在ANCOVA模型中调整年龄。
表4.短暂性缺血发作(TIA)患者与对照个体的人口统计学总结

TIA基因组谱型
共460个基因在TIA患者和对照间是差异表达的(FDR≤0.05；倍数变化≥1.5)(表5A‑D)。相对于对照，TIA中135个基因下调(表2和表5A)，325个上调(表1和表5B)。460个基因的分层聚类分析表明，它们能区分TIA与对照(图1)，除了两名TIA患者(ID号：57和90)聚集在对照组中，三名对照患者(ID号：42、68和74)聚集在TIA组(图1)中。分层聚类分析还提示，存在两个不同的TIA组。TIA1组中的大多数上调的基因能将其与TIA2组和对照组区分开(图1)。
预测分析
利用PAM和460个TIA相关基因中的34个(表5C)进行的交叉验证能以87.5%的灵敏性(24例TIA中的21例被正确分类)和96.3%的特异性(27名对照中的26名被正确分类)将TIA患者与对照区分开(图2)。
TIA特异性上调的基因
将能区分TIA1患者与TIA2患者的325个上调基因输入PAM，从而得到能区别这两组的最低数量(n=26)的基因。这26个基因(表5D)能以100%的灵敏性和特异性区分TIA1患者与TIA2患者(图3)。在TIA1和TIA2之间没有鉴定出具有显著差异的临床因子，包括年龄、TIA后的时间、高血压、糖尿病、ABCD2评分(表6)以及药物。值得注意的是，金属蛋白酶16和金属蛋白酶26在TIA1组中上调，而在TIA2组中则没有(图4)。
表6.TIA亚组的人口统计学总结

CVD:心血管病症；AF:心房纤颤；LVD:大血管病。
利用t‑检验或卡方检验分析，两组间没有任何显著差异。
造成TIA1和TIA2间RNA表达差异的因素仍不清楚。
TIA特异性基因的功能分析
利用IPA对TIA特异性基因(来源于TIA与对照比较的460个基因)的功能分析表明，它们与免疫功能显著相关。在TIA特异性基因中，很多与自身免疫病、糖尿病、关节炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病和克罗恩病相关(表7)。TIA1组与TIA2组比较中的显著受调节的基因(FDR≤0.05；倍数变化≥1.5)显示在表8中，连同最显著的通路(表9；参见以下的讨论)。
表7‑TIA特异性基因‑功能





讨论
TIA是卒中和其它血管事件的预兆。本发明的生物标志物组能用于TIA中干预，从而预防未来的血管事件。在本发明之前，关于人类TIA生物学的认识有限，并且特异性TIA疗法的开发也受到限制。本发明的生物标志物组提供了能更好地理解TIA患者中发生的血液免疫应答的信息。通过检测全基因组，鉴定出显示两种TIA亚型的独特的TIA基因表达谱。这些发现对TIA病理生理学提供了独特的见解，并且与以下结论相符：在人短暂性局灶性脑缺血之后，发生特异性免疫应答。它们还提示了诊断性检测，从而证实能够开发出TIA诊断。
系统性炎症和TIA
TIA患者似乎有与其血管事件相关的独特炎症模式。事实上，与对照相比，TIA患者趋向于具有升高的白细胞活化和系统性炎症应答(8‑9)。短暂性缺血发作与很多系统性炎症标志物(例如CRP(7))和炎性疾病状态(例如炎症性肠病的(21‑24))相关。TIA和系统性感染之间的关联以及TIA和牙周病(25‑29)进一步提示TIA中免疫功能的改变。在本研究中，相对于对照，参与炎症的63个基因在TIA中是差异表达的(表7)。这些基因证实与炎症性肠病(32个基因)、类风湿性关节炎(32个基因)和克罗恩病(29个基因)相似的炎症模式，这提示不同的、但相关的炎症模式与TIA关联。如果在TIA发生后，这些基因的表达以时间依赖的方式改变，则炎症有可能是TIA的结果。否则，可能之前就存在某些不会随时间改变的炎症，其有可能会促进TIA的发展。因此，在TIA急性期(在TIA发生的24h内抽血；n=11)和亚急性期(在TIA发生的24h至72h内抽血；n=13)内进行基因表达的时间依赖性分析。结果表明，大多数急性期内表达的基因与亚急性期内表达的基因相似(>90%相似)。因此，在TIA前可能存在慢性炎症状态，并且这可能会促进导致TIA。
抗氧化能力
GSTM1和GSTM2编码属于μ类的胞质谷胱甘肽S‑转移酶(GST)。GST酶通过与谷胱甘肽偶联在亲电子化合物(氧化应激的产物)的解毒过程中起作用(30)。GSTM1和GSTM2在TIA患者中均下调，这提示TIA患者中的抗氧化能力可能下降。导致的增强的氧化应激可以进而促进缺血性血管疾病，如TIA。该结果与我们之前的动物研究一致，其表明，模拟人TIA的短暂性局灶性缺血10分钟后，特定GST家族成员(GSTT1)受到调控(5)。
细胞外基质重塑
我们的数据表明存在两个TIA患者亚组。在每组间没有测量到显著差异的临床因子。TIA亚型的概念不是新的。例如，基于MRI DWI状态、ABCD2评分或大血管疾病或心房纤颤是否存在，可存在TIA亚型。在我们的研究中，基于基因表达谱证实了两个TIA分子学亚型。这两组的功能分析提示，与TIA2相比，TIA1中参与细胞外基质重塑的基因过度表现，包括：MMP16、MMP19、MMP26、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL10A1、COL11A1、COL25A1、COL27A1、FGFs和EGFR。TIA1患者可能更倾向于发生血脑屏障处和/或动脉粥样硬化斑块中的细胞外基质分解。
研究的局限性
样本量较小。选择了处于极低TIA和其它血管事件风险的对照组，使得对照具有沉默性血管事件(其会破坏与TIA的比较)的可能性非常小。通过这样做，不可避免地引入由于血管风险因子引起的差异。通过在ANCOVA模型中包括年龄并排除与高血压和糖尿病相关的基因来调整这些因子。因而，本研究中比较TIA与对照的优势在于，TIA与对照间的基因表达差异被最大化，并允许搜索TIA亚组。然而，未来的研究将需要比较TIA患者与其它对照，以鉴定“TIA特异性的基因标志物”。这些对照应当包括具有相似血管风险因子的患者和患有偏头痛或癫痫的“TIA模拟”患者。
组异质性是TIA研究中的另一局限性。尽管使用了严格的标准来确保TIA个体的确发生真正的短暂性缺血事件，但是事实上，有些TIA患者可能是TIA模拟患者。类似地，尽管利用处于低的具有沉默性缺血性血管事件风险的对照组，但是对照组中的一些患者可能具有沉默性血管事件。
这是一项发现型研究，因而没有之前的研究进行比较。尽管应用FDR校正，但是解释多重比较的唯一方式是进行未来的重复研究。未进行PCR验证，因为在之前的研究中，Affymetrix阵列上的多数变化已用PCR进行了极好校正。此外，当重复本研究时，将仅需要进行PCR，并且PCR验证的基因将用于开发临床试验。
总之，利用血液的基因表达谱能将近期TIA患者与之前没有血管事件的对照区分开。此外，在人短暂性缺血发作之后，可能会有不同的免疫应答亚型。
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应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，并且根据其做出的各种修改或变化对本领域技术人员是显而易见的，且应包括在本申请以及后附权利要求范围的精神和意图内。将本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请通过引用全部并入本文，用于所有目的。
表5.TIA相关基因列表(与对照相比，FDR≤0.05、绝对倍数变化≥1.5)。
表5A.135个下调的基因






表5B.325个上调的基因












表5C.能区分TIA与对照的34个基因

表5D.能区分TIA1与TIA2的26个上调基因


表8‑TIA1和TIA2之间重要的基因(TIA1相对于TIA2，FDR≤0.05，绝对倍数变化≥1.5)



































































































表9‑TIA亚型特异性基因：通路