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1、(10)申请公布号 CN 103074393 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074393 A *CN103074393A* (21)申请号 201210518271.7 (22)申请日 2012.12.05 C12P 13/02(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 广东省微生物研究所 地址 510070 广东省广州市先烈中路 100 号 (72)发明人 吴清平 刘盛荣 莫树平 柏建玲 王惠惠 丘明泉 张菊梅 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 一种增强细胞生长及生。
2、物过程效率的 - 聚 赖氨酸补料分批发酵方法 (57) 摘要 本发明公开了一种增强细胞生长及生物过程 效率的 - 聚赖氨酸补料分批发酵方法。它是 用 - 聚赖氨酸产生菌用其发酵培养基对其进 行发酵培养， 当培养体系的 pH 值下降至 3.64.1 之间时， 按照每小时每升发酵培养基中补加 0.025g0.5g 酵母粉或其他有机氮源至培养体系 中直至发酵结束， 同时自 pH 降至 3.64.1 之间 开始， 用氨水控制培养体系的 pH 维持在 3.64.1 之间直至发酵结束， 并补加灭过菌的含葡萄糖和 硫酸铵的补料培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 530g/L 直至发酵结束。本发明的细胞较快的进。
3、 入 - 聚赖氨酸合成阶段， 避免了细胞进入合成 阶段前细胞活性的损失， 延长了细胞合成 - 聚 赖氨酸的时间， 从而显著提高细胞 - 聚赖氨酸 合成能力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103074393 A CN 103074393 A *CN103074393A* 1/1 页 2 1. 一种增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分批发酵方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： - 聚赖氨酸产生菌用其发酵培养基对其进。
4、行发酵培养， 当培养体系的 pH 值下降至 3.64.1 之间时， 按照每小时每升发酵培养基中补加 0.025g0.5g 酵母粉或其 他有机氮源至培养体系中直至发酵结束， 同时自 pH 降至 3.64.1 之间开始， 用氨水控制培 养体系的pH维持在3.64.1之间直至发酵结束， 并补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料 培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 530g/L 直至发酵结束。 2.根据权利要求1所述的增强细胞生长及生物过程效率的-聚赖氨酸补料分批发酵 方法， 其特征在于， 所述的补料培养基每升含有 800g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的增。
5、强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分 批发酵方法， 其特征在于， 所述的当培养体系的 pH 值下降的 pH 值为 3.9， 所述的自 pH 值降 至是降至 3.9 开始， 用氨水控制培养体系的 pH 维持在 3.9 直至发酵结束， 所述的并补加灭 过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 530g/L 直至发酵结束 是自当培养体系的葡萄糖低于 10g/L 时， 自动补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养 基， 维持培养体系的葡萄糖为 10g/L 直至发酵结束。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料 分批发酵方法， 其。
6、特征在于， 所述的 - 聚赖氨酸产生菌为不吸水链霉菌 (Streptomyces ahygroscopicus)str-8。 5.根据权利要求1或2所述的增强细胞生长及生物过程效率的-聚赖氨酸补料分批 发酵方法， 其特征在于， 所述的其他氮源为豆饼粉或王米浆。 6.根据权利要求1或2所述的增强细胞生长及生物过程效率的-聚赖氨酸补料分批 发酵方法， 其特征在于， 所述的氨水为质量分数 10% 的氨水。 权 利 要 求 书 CN 103074393 A 2 1/5 页 3 一种增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分 批发酵方法 技术领域 0001 本发明属于微生物发酵领域， 具体涉及一种。
7、增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分批发酵方法。 背景技术 ： 0002 民以食为天， 食品安全已经成为国内外关注的热点之一。不可否认食品中添加的 各种防腐剂对食品防腐保鲜起了重要作用， 促进了食品工业的发展， 可以说现代食品工业 离不开防腐剂， 但传统使用的化学合成防腐剂对人体有一定潜在危害， 如硝酸盐及亚硝酸 盐具有致癌性， 常用的苯甲酸及其盐、 山梨酸及其盐也有一定毒性， 为提高食品的安生性， 使用天然、 安全、 绿色防腐剂代替传统化学合成防腐剂是今后发展的必然趋势， 是解决和提 高食品安全的必然选择。 0003 - 聚赖氨酸是链霉菌 (Streptomyces) 生物合成的。
8、胞外次级代谢产物， 通常由 25-35个L-赖氨酸残基组成的， 通过-酰胺键连接， 对革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌、 酵 母菌、 丝状真菌均具有一定抑制作用， 对病毒也有一定抑制作用。- 聚赖氨酸具有对人体 安全无毒、 可生物降解等优点， 因此， - 聚赖氨酸是替代传统化学合成防腐剂的理想选择， 引起了人们的高度重视。美国 FDA 批准了 - 聚赖氨酸的 GRAS（认为安全） 地位。目前， - 聚赖氨酸已经在日本、 韩国、 美国等国家作为食品防腐剂得到应用。 0004 - 聚赖氨酸作为食品防腐剂有诸多的优势， 因此在食品工业中有极大的潜在需 求。目前， 微生物发酵法是生产 - 聚赖氨酸的惟一方。
9、法， 但其发酵过程中存在一个显著制 约因素， 即液体深层发酵时 pH4.0 或以下是 - 聚赖氨酸生物合成所必须的条件， 但低 pH 不利于细胞生长， 因此， 通常培养条件下难以获得高细胞密度， 这不利于提高发酵产率， 针 对这些状况， 研究人员提出了两阶段 pH 控制发酵工艺， 即当发酵过程 pH 下降至 5.0 时， 将 pH 控制在 5.0 一段时间， 以利于细胞生长， 为阶段 1 ； 然后让其 pH 自然下降， 降至 4.0 时， 控 制 pH 在 4.0 以利 - 聚赖氨酸合成， 为阶段 2。两阶段 pH 控制 - 聚赖氨酸发酵可参见 附图 1， 该工艺已广泛应用于 - 聚赖氨酸的工。
10、业发酵。但该工艺在阶段 1 及先前生长细 胞由于 pH 过高细胞不能合成 - 聚赖氨酸， 而在人为延长的阶段 1 细胞活性可能损失， 这 会影响细胞-聚赖氨酸合成能力， 此外， 由于合成阶段pH较低， 细胞密度仍然难以根本提 高， 基于这些不足， 研发更有效的发酵工艺， 尤其是提高细胞生长和细胞活性的发酵工艺十 分必要。 发明内容 ： 0005 本发明的目的是提供一种增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分 批发酵方法。 0006 本发明的增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分批发酵方法， 其特 征在于， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103074393 A 3 2/5。
11、 页 4 0007 - 聚赖氨酸产生菌用其发酵培养基对其进行发酵培养， 当培养体系的 pH 值下降 至 3.64.1 之间时， 按照每小时每升发酵培养基中补加 0.025g0.5g 酵母粉或其他有机氮 源至培养体系中直至发酵结束， 同时自 pH 降至 3.64.1 之间开始， 用氨水控制培养体系的 pH 维持在 3.64.1 之间直至发酵结束， 并补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 530g/L 直至发酵结束。 0008 所述的补料培养基优选每升含有 800g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水。 0009 进一步优选， 所述的当培养体系的pH值下降的pH值。
12、为3.9， 所述的自pH值降至是 降至 3.9 开始， 用氨水控制培养体系的 pH 维持在 3.9 直至发酵结束， 所述的并补加灭过菌 的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 530g/L 直至发酵结束是自 当培养体系的葡萄糖低于 10g/L 时， 自动补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基， 维持培养体系的葡萄糖为 10g/L 直至发酵结束。 0010 所述的 - 聚赖氨酸产生菌指的是能够产生 - 聚赖氨酸的链霉菌， 使用的发酵 培养基是 - 聚赖氨酸产生菌的发酵培养基， 本领域技术人员可以根据本领域的常规知识 去选择 - 聚赖氨酸产生菌以及与其相配套的发酵培养基， 所述。
13、的 - 聚赖氨酸产生菌优 选为不吸水链霉菌 (Streptomyces ahygroscopicus)str-8。 0011 所述的其他氮源优选为豆饼粉或王米浆等。 0012 所述的氨水优选为 10%（w/w） 的氨水。 0013 本发明的增强细胞生长及生物过程效率的 - 聚赖氨酸补料分批发酵方法通过 补加酵母粉以提高细胞生长和活性， 使细胞持续生长、 显著提高细胞密度、 增强细胞活性， 由于发酵过程细胞生长及 - 聚赖氨酸生物合成利用大量葡萄糖， 因此在发酵过程中补加 葡萄糖和硫酸铵， 使 - 聚赖氨酸产生菌能持续的合成 - 聚赖氨酸。与现有技术的两阶 段 pH 控制发酵相比， 本发明的细胞。
14、较快的进入 - 聚赖氨酸合成阶段， 避免了细胞进入合 成阶段前细胞活性的损失， 延长了细胞合成-聚赖氨酸的时间， 从而显著提高细胞-聚 赖氨酸合成能力， 克服了两阶段pH控制发酵的不足， 使得-聚赖氨酸产率显著提高， 该发 酵方法具有适用广泛， 易于操作的特征。 附图说明 ： 0014 图 1 是 - 聚赖氨酸补料分批发酵两阶段 pH 控制示意图 0015 表示 pH 控制阶段 1， pH 为 5.0 ； 表示 pH 控制阶段 2， pH 为 3.9。 0016 图2是本发明的增强细胞生长及生物过程效率的-聚赖氨酸补料分批发酵方法 的一阶段 pH 控制结合酵母粉补加的示意图 ； 0017 YE。
15、 表示酵母粉 ； 表示 pH 控制阶段， pH 为 3.9。 具体实施方式 ： 0018 实施例 1 ： 0019 1、 孢子制备 0020 将新鲜的 - 聚赖氨酸产生菌不吸水链霉菌 (Streptomyces ahygroscopicus) str-8( 该菌于 2011 年 6 月 2 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址 ： 中国武 汉武汉大学， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M2011191， 该菌种的保藏信息公开于专利号为 ： 说 明 书 CN 103074393 A 4 3/5 页 5 ZL201110152802.0， 发明名称为 ： 不吸水链霉菌Str-8及利用制。
16、备-聚赖氨酸及其盐的方 法的专利中 ) 斜面菌种多次划线接种于燕麦琼脂培养基 （ISP3） 中， 30 C、 倒置培养 7 天， 以无菌水洗涤收集成熟的孢子， 制备孢子悬浮液， 作为接种物， 通常情况下可获得孢子悬浮 液浓度约 5108CFU/mL。 0021 燕麦琼脂培养基 （ISP3） 的制备 ： 称取 40g 燕麦， 经去离子水洗涤后置于 1L 装有 800mL 去离子水的烧杯中， 加热煮沸 10min， 纱布过滤， 弃渣， 将 15-20g 琼脂置入过滤液中， 加热充分溶解后定容至 1L， 121 C 灭菌 30min。 0022 2、 种子培养 0023 将10mL孢子悬浮液(约为5。
17、108孢子/mL)接种于装有500mL M3G培养基(1000mL 摇瓶 ) 中， 温度 30 C， 转速 150r/min， 培养 20h 作为种子液。 0024 M3G 培 养 基 成 分 (g/L) ： 葡 萄 糖 30 ； 酵 母 粉 5 ； (NH4)2SO47 ； FeSO47H2O0.03 ； MgSO47H2O0.5 ； ZnSO47H2O0.04 ； K2HPO40.8 ； KH2PO41.36 ； pH7.2。1105Pa 灭菌 30min。 0025 3、 发酵罐的补料分批发酵工艺 0026 取 150mL 种子液接种于灭菌的 2.85L M3G 培养基中 (5L 发酵罐。
18、 )， 温度为 30 C， 转速为 300r/min， 通气为 1vvm， 当发酵过程出现泡沫时， 在线添加消泡剂自动消泡。 0027 发酵罐接种种子液后， 当培养体系中的发酵培养基 pH 下降至约为 3.9 时， 此时施 以质量分数 10% 氨水在线控制培养体系的 pH 维持在 3.9 的水平至发酵终点， 即一阶段 pH 控制 ； 并在pH降至3.9时始持续流加灭菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小时每升发酵培养 基中补加 0.042g 酵母粉的量添加 ) 至发酵结束， 以提高细胞生长和活性。发酵过程 pH 控 制及酵母粉补加参见附图 2。 0028 发酵过程细胞生长及 - 聚赖氨酸生物合。
19、成利用大量葡萄糖， 当培养体系的葡萄 糖浓度下降至约为 10g/L 时， 自动流加灭过菌的葡萄糖与硫酸铵的补料培养基 ( 每升含 800g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水 ) 使培养体系的葡萄糖维持约为 10g/L 直至发酵结 束。 0029 发酵 10d 结束时 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 5.23g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅 为 3.74g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 0030 实施例 2 ： 0031 1、 孢子制备和种子液培养同实施例 1， 由此得到种子液。 0032 2、 发酵罐的补料分批发酵工艺 0033 取 150mL 种子液接。
20、种于灭菌的 2.85L M3G 培养基中 (5L 发酵罐 )， 温度为 30 C， 转速为 300r/min， 通气为 1vvm， 当发酵过程出现泡沫时， 在线添加消泡剂自动消泡。 0034 发酵罐接种种子液后， 当培养体系中的发酵培养基 pH 下降至约为 3.6 时， 此时施 以质量分数 10% 氨水在线控制培养体系的 pH 维持在 3.64.1 之间的水平至发酵终点， 即一 阶段 pH 控制 ； 并在 pH 降至 3.6 时始持续流加灭菌的酵母粉溶液 (200g/L)( 按每小时每升 发酵培养基中补加 0.025g 酵母粉的量添加 ) 至发酵结束， 以提高细胞生长和活性。 0035 发酵过。
21、程细胞生长及 - 聚赖氨酸生物合成利用大量葡萄糖， 当培养体系的葡萄 糖浓度下降至约为5g/L时， 自动流加灭过菌的葡萄糖与硫酸铵的补料培养基(每升含800g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水 ) 使培养体系的葡萄糖维持约为 5g/L 直至发酵结束。 0036 发酵 10d 结束时 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 5.17g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅 说 明 书 CN 103074393 A 5 4/5 页 6 为 3.74g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 0037 实施例 3 ： 0038 1、 孢子制备和种子液培养同实施例 1， 由此得到种子液。。
22、 0039 2、 发酵罐的补料分批发酵工艺 0040 取 150mL 种子液接种于灭菌的 2.85L M3G 培养基中 (5L 发酵罐 )， 温度为 30 C， 转速为 300r/min， 通气为 1vvm， 当发酵过程出现泡沫时， 在线添加消泡剂自动消泡。 0041 发酵罐接种种子液后， 当培养体系中的发酵培养基 pH 下降至约为 4.1 时， 此时施 以质量分数 10% 氨水在线控制培养体系的 pH 维持在 4.1 的水平至发酵终点， 即一阶段 pH 控制 ； 并在pH降至4.1时始持续流加灭菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小时每升发酵培养 基中补加 0.5g 酵母粉的量添加 ) 至发。
23、酵结束， 以提高细胞生长和活性。 0042 发酵过程细胞生长及 - 聚赖氨酸生物合成利用大量葡萄糖， 当培养体系的葡萄 糖浓度下降至约为 30g/L 时， 自动流加灭过菌的葡萄糖与硫酸铵的补料培养基 ( 每升含 800g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水 ) 使培养体系的葡萄糖维持约为 30g/L 直至发酵结 束。 0043 发酵 10d 结束时 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 7.51g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅 为 3.74g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 0044 实施例 4 ： 0045 本实施例与实施例 1 基本相同， 只是在培养体系的 p。
24、H 降至 3.9 时始持续流加灭菌 的豆饼粉溶液 (200g/L)( 按每小时每升发酵培养基中补加 0.042g 豆饼粉的量添加 ) 至发 酵结束， 其他步骤相同。 0046 发酵 10d 结束时 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 5.07g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅 为 3.74g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 0047 实施例 5 ： 0048 1、 孢子制备和种子液培养同实施例 1， 由此得到种子液。 0049 2、 取 1L（5%， v/v） 种子液接种于灭菌的 19L M3G 培养基 (30L 发酵罐 )， 温度为 30 C， 转速为 300r/m。
25、in， 通气为 1vvm， 当发酵过程出现泡沫时， 在线添加消泡剂自动消泡。 0050 向发酵罐接种种子液后， 当培养体系中的发酵培养基 pH 下降至约为 3.9 时， 此时 施以 10%（w/w） 氨水在线控制培养体系的 pH 维持在 3.9 的水平至发酵终点， 并在 pH3.9 时 始持续流加灭菌的酵母粉溶液 (200g/L)( 按每小时每升发酵培养基中补加 0.025g 酵母粉 的量添加 ) 至发酵结束。 0051 发酵过程细胞生长及 - 聚赖氨酸生物合成利用大量葡萄糖， 当培养体系中的葡 萄糖下降至约为 10g/L 时， 自动流加灭过菌的含葡萄糖与硫酸铵的补料培养基 ( 每升含 800。
26、g 葡萄糖和 100g 硫酸铵， 余量为水 ) 使培养体系的葡萄糖维持约为 10g/L 至发酵结束。 0052 发酵 13day 结束时， 发酵液中 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 28.2g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅为 16.3g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 0053 实施例 6 ： 0054 本实施例与实施例 5 基本相同， 只是在培养体系中的发酵培养基 pH 下降至约为 3.9时， 持续流加灭菌酵母粉溶液(200g/L)(按每小时每升发酵培养基中补加0.21g酵母粉 的量添加 ) 至发酵结束， 其他步骤相同。 说 明 书 CN 103074393 A 6 5/5 页 7 0055 发酵 15d 结束时 - 聚赖氨酸发酵终浓度达 35.4g/L， 而对照 （常规 2 阶段法） 仅 为 16.3g/L， 因此， 本发明的方法显著提高了 - 聚赖氨酸的产率。 说 明 书 CN 103074393 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103074393 A 8 。