一种罗丹明B人工抗原及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103145830 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145830 A *CN103145830A* (21)申请号 201310072715.3 (22)申请日 2013.03.07 C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 1/107(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 沈萍萍 徐加发 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 胡锡瑜 (54) 发明名。

2、称 一种罗丹明 B 人工抗原及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明属于免疫学检测技术领域， 具体涉及 一种罗丹明 B 人工抗原及其制备方法和应用。由 于罗丹明 B 分子结构本身含有羧基， 因此不需要 另行引入活性基团。本发明将罗丹明 B 分子直接 以碳二亚胺为偶联剂， 在 N- 羟基琥珀酰亚胺存在 的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明 B 的人 工抗原。由于在最大程度上保持了其结构的稳定 性， 因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。 整个方法简单易行， 操作简便， 人工抗原得率和纯 度高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国。

3、家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103145830 A CN 103145830 A *CN103145830A* 1/1 页 2 1. 一种罗丹明 B 的人工抗原， 其结构为 ： 其中， 载体蛋白直接与罗丹明 B 分子中的羧基通过脱水缩合形成酰胺键而共价偶联。 2. 根据权利要求 1 所述一种罗丹明 B 人工抗原的合成方法， 其特征在于合成步骤为 ： （1） 将罗丹明 B96mg、 N,N- 二环己基碳二亚胺 41.2mg、 N- 羟基琥珀酰亚胺 46mg 混合， 溶解于 400ul 无水 N,N- 二甲基甲酰胺中， 室温密。

4、封搅拌过夜 ； （2） 将混合液离心， 1000rpm， 5 分钟， 然后吸取上层反应液， 将其缓慢逐滴加入到冰浴的 10uM 的 BSA 溶液中， 4搅拌反应过夜 ； （3） 将反应液转移至透析袋中， 以PBS为透析液4透析7天， 每12小时换一次透析液， 以除去未反应的罗丹明 B 杂质 ； （4） 透析结束后， 将反应液离心， 7000rpm， 离心 5 分钟， 得罗丹明 B 的人工抗原。 3. 根据权利要求 2 所述一种罗丹明 B 人工抗原合成方法， 其特征是偶联剂为 N,N- 二 环己基碳二亚胺或 1- 乙基 -3-3（3- 二甲基氨基丙基） 碳二亚胺或 N,N- 二异丙基碳二亚胺 （。

5、DIC） 。 4. 根据权利要求 2 所述一种罗丹明 B 人工抗原合成方法， 其特征在于载体蛋白为牛血 清白蛋白 Bovine serum albumin， BSA 或卵清蛋白 Ovalbumin， OVA。 5. 权利要求 1 所述罗丹明 B 人工抗原在酶联免疫检测分析中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103145830 A 2 1/3 页 3 一种罗丹明 B 人工抗原及其制备方法和应用 0001 一、 技术领域 本发明属于免疫学检测技术领域， 具体涉及一种罗丹明 B 人工抗原及其制备方法和应 用。 0002 二、 背景技术 罗丹明 B（Rhodamine B） 俗称玫瑰红， 花粉红， 。

6、是一种邻苯二酚类的碱性荧光染料， 由 于其具有很好的荧光性质， 目前已广泛应用于环境监测、 有色玻璃、 特色烟花爆竹和生物学 染色等领域。罗丹明 B 的结构如图 1 所示。 0003 近些年来， 实验研究表明 ： 罗丹明 B 可以明显减少人纤维原细胞的数量， 抑制其增 殖 ； 同时， 它还可以抑制人血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。另外， 经动物试验发现 ： 罗 丹明 B 能引起皮下组织生肉瘤， 具有潜在的致癌和致突变能力。欧美等国家和地区从 1993 年起明令禁止其在食品加工中使用。我国卫生部也在 2008 年将其列入首批食品中可能违 法添加的非食用物质名单之中。 0004 但是由于其价廉易得。

7、、 色泽鲜亮持久等特点， 仍然有一些不法食品生产、 加工商违 规、 违法使用罗丹明染料。这一方面给国家的食品安全带来了很大的隐患 ； 另一方面， 也给 消费者的身心健康带来严重威胁。 0005 目前， 国内外对食品中罗丹明 B 的常用检测方法是高效液相色谱法 (HPLC)、 高效 液相-质谱联用法 （HPLC-MS） 。 但是由于色谱法的样品前处理复杂繁琐， 需要精密昂贵的检 测器和质谱等仪器设备， 同时还要有专门的技术人员操作仪器， 很难达到快速、 便捷的现场 检测要求， 因此限制了其在许多检测机构尤其是基层检测部门的大规模推广使用。 0006 酶联免疫检测分析 （Enzyme-linked。

8、 immunosorbent assay， ELISA） 由于具有特异 性强、 灵敏度高、 简便、 快速等优点， 近些年来备受人们的关注。 免疫分析是以抗体作为生物 检测器的分析技术， 而罗丹明 B 作为小分子物质， 分子量为 479， 是半抗原， 本身不具有诱导 产生抗体的能力， 不能直接通过它免疫动物而得到检测所必须的抗体， 因此， 合成罗丹明 B 的人工抗原便成为建立其 ELISA 分析方法的首要步骤和关键所在。 0007 从罗丹明 B 分子结构中可以看出 ： 它本身含有羧基， 因此不需要另行引入活性基 团。本发明将罗丹明 B 分子直接以碳二亚胺为偶联剂， 在 N- 羟基琥珀酰亚胺 存在。

9、的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明 B 的人工抗原。 0008 三、 发明内容 本发明要解决的技术问题是 ： 本发明主要是利用罗丹明 B 分子结构本身含有的活性基团 - 羧基， 为罗丹明 B 提供 了一种人工抗原及其制备方法和应用。 0009 本发明的技术方案是 ： 本发明所述的罗丹明B人工抗原为载体蛋白直接与罗丹明B分子中的羧基通过脱水缩 合形成酰胺键而得， 其结构如图1。 将罗丹明B以碳二亚胺为偶联剂， 在N-羟基琥珀酰亚胺 存在的情况下与载体蛋白偶联从而得到罗丹明 B 的人工抗原， 其结构如图 2。 0010 罗丹明 B 人工抗原的合成 ： 说 明 书 CN 103145830 A 3。

10、 2/3 页 4 1、 将罗丹明 B 96mg、 N,N- 二环己基碳二亚胺 41.2mg、 N- 羟基琥珀酰亚胺 46mg 混合， 溶 解于 400ul 经无水处理的 N,N- 二甲基甲酰胺中， 室温密封搅拌过夜 ； 2、 将混合液 1000rpm， 离心 5 分钟， 后吸取上层反应液， 将其缓慢逐滴加入到冰浴的 10uM 的 BSA 溶液中， 4搅拌反应过夜 ； 3、 将反应液转移至透析袋中， 以 PBS 为透析液 4透析 7 天， 每 12 小时换一次透析液， 以除去未反应的罗丹明 B 等杂质 ； 4、 透析结束后， 将反应液离心， 7000rpm， 离心 5 分钟， 得罗丹明 B 的人。

11、工抗原。 0011 罗丹明 B 人工抗原的合成路线见图 3。 0012 本发明与已有技术相比其有益效果是 ： 目前所报道的罗丹明 B 人工抗原的制备方法中， 主要是通过对罗丹明 B 的类似 物 - 罗丹明 123 中的活性基团氨基进行修饰偶联而来。虽然罗丹明 123 与罗丹明 B 的结 构相似， 都具有苯环部分和羧基部分， 但是与罗丹明 B 相比， 罗丹明 123 结构中苯环上所连 接的是氨基， 而不是两个乙基， 这样就导致了其空间结构在这一区域有着很大的不同 ； 另一 方面， 由于罗丹明 123 结构中带有两个氨基而直接引起了两种物质带电情况具有很大的区 别， 这两方面的原因可能直接导致抗原。

12、决定簇的改变和抗原递呈细胞对罗丹明 B 的识别和 递呈能力， 最终导致产生的抗体具有很大的差异。本发明的优势在于我们根据罗丹明 B 自 身带有活性基团这一特点， 不改变它的结构， 直接对其进行与载体的偶联反应， 从而最大程 度上保持了结构的稳定性， 因此将其免疫动物后有助于提高抗体的质量。本发明所述罗丹 明 B 人工抗原可用于酶联免疫检测分析。 0013 四、 附图说明 图 1 罗丹明 B 结构式 图 2 罗丹明 B 人工抗原结构式 图 3 罗丹明 B 人工抗原的合成路线图 图 4A 罗丹明 B 与载体蛋白 BSA 偶联物的紫外扫描图谱 图 4B 罗丹明 B 与载体蛋白 OVA 偶联物的紫外扫。

13、描图谱 五、 具体实施方式 实施例 1 罗丹明 B-BSA 偶联物 1、 将罗丹明 B 96mg、 N,N- 二环己基碳二亚胺 41.2mg、 N- 羟基琥珀酰亚胺 46mg 混合， 溶 解于 400ul 经无水处理的 N,N- 二甲基甲酰胺中， 室温密封搅拌过夜 ； 2、 将混合液 1000rpm， 离心 5 分钟， 后吸取上层反应液， 将其缓慢逐滴加入到冰浴的 10uM 的 BSA 溶液中， 4搅拌反应过夜 ； 3、 将反应液转移至透析袋中， 以 PBS 为透析液 4透析 7 天， 每 12 小时换一次透析液， 以除去未反应的罗丹明 B 等杂质 ； 4、 透析结束后， 将反应液离心， 70。

14、00rpm， 离心 5 分钟， 得罗丹明 B 的人工抗原。 0014 实施例 2 罗丹明 B-OVA 偶联物 1、 将罗丹明 B 96mg、 N,N- 二环己基碳二亚胺 41.2mg、 N- 羟基琥珀酰亚胺 46mg 混合， 溶 解于 400ul 经无水处理的 N,N- 二甲基甲酰胺中， 室温密封搅拌过夜 ； 2、 将混合液 1000rpm， 离心 5 分钟， 后吸取上层反应液， 将其缓慢逐滴加入到已经冰浴 的 10uM 的 OVA 溶液中， 4搅拌反应过夜 ； 说 明 书 CN 103145830 A 4 3/3 页 5 3、 将反应液转移至透析袋中， 以 PBS 为透析液 4透析 7 天，。

15、 每 12 小时换一次透析液， 以除去未反应的罗丹明 B 等杂质 ； 4、 透析结束后， 将反应液离心， 7000rpm， 离心 5 分钟， 得罗丹明 B 的人工抗原。 0015 实施例 3 罗丹明 B-BSA 和罗丹明 B-OVA 偶联物的鉴定 首先， 采用紫外分光光度扫描的方法分别对罗丹明 B-BSA（图 4A） 和罗丹明 B-OVA（图 4B） 偶联物进行鉴定， 根据其特征吸收峰的变化及其峰形鉴定是否偶联成功。罗丹明 B 标准 品在 560nm 处有一强的吸收峰， 而 BSA 和 OVA 的最大吸收峰在 280nm 左右， 但是偶联物在这 两个波长下均有吸收， 这是由于两种物质偶联后而引起的吸收峰叠加， 表明两者偶联成功， 计算得出偶联比约为 1 ： 6。 说 明 书 CN 103145830 A 5 1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103145830 A 6 2/3 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 103145830 A 7 3/3 页 8 图 4A 图 4B 说 明 书 附 图 CN 103145830 A 8 。