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一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒.pdf

  • 上传人：v****
  • 文档编号：5323812
  • 上传时间：2019-01-05
  • 格式：PDF
  • 页数：13
  • 大小：740.82KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201310093594.0

    		 申请日：

    2013.03.22
    公开号：

    CN103146833A

    		 公开日：

    2013.06.12
    当前法律状态：

    撤回

    		 有效性：

    无权
    法律详情：

    发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20130612|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20130322|||公开
    IPC分类号：

    C12Q1/68; C12N15/11

    		 主分类号：

    C12Q1/68
    申请人：

    何蕾
    发明人：

    何蕾; 贾宁
    地址：

    100853 北京市复兴路28号解放军总医院
    优先权：

    专利代理机构：

    		代理人：

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    内容摘要

    本发明公开了一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分：特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。本发明还公开了一种检测小鼠SEPS1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测SEPS1基因的表达量，从而检测脓毒症的发生情况。

    权利要求书

    权利要求书一种SEPS1基因的特异性引物对及特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物对其核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。 
    一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物对和特异性探针，还包括标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。 
    根据权利要求1所述的一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒，还包括：标准DNA模板、阴性质控标准品、Hot‑start Taq DNA聚合酶，其浓度为2.5U/μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer，dNTP混合物，每种NTP浓度为10mmol/L。 
    一种小鼠SEPS1基因的检测方法，包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、SEPS1基因的扩增。 
    根据权利要求4中所述的检测方法，其中样品RNA的提取、样品cDNA的制备、SEPS1基因的扩增的具体步骤包括： 
    1)样品RNA的提取：按Trizol试剂盒说明书提取小鼠肝脏和肺脏的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。 
    2)样品cDNA的制备： 
    a)利用PCR管在冰上配制如下体系： 
    模板RNA 1‑5μg 
    Oligo(dT)18primer1μl(0.5μg/μl) 
    加DEPC水至12μl 
    轻轻混合，并短离心5s； 
    b)70℃温育5min，冰上冷却30s，之后短离心； 
    c)PCR管置于冰上，再向其中加入： 
    5×reaction buffer4μl 
    RNase inhibitor1μl(20U/μl) 
    dNTPMix2μl(10mmol/l) 
    M‑MuLV Reverse Transcriptase1μl(20U/μl) 
    加DEPC水至20μl，轻轻混合，之后短离心； 
    d)37℃温育60min； 
    e)70℃温育10min，4℃以结束反应。反转录得到的cDNA置于‑20℃保存。。 
    3)SEPS1基因的扩增： 
    以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增SEPS1基因。其中模板2μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer5μl，dNTP混合物1μl，特异性引物SEQ ID NO.1，特异性引物SEQ ID NO.2，特异性探针SEQ ID NO.3各1μl，去离子水补齐至50μl。荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。 
    权利要求1的引物和探针在制备检测小鼠SEPS1基因试剂盒中的应用。 
    小鼠SEPS1基因或SEPS1蛋白在制备检测小鼠脓毒症的试剂盒中的应用。

    说明书

    说明书一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒
    技术领域
    本发明涉及基因检测试剂盒的制备及使用方法。具体而言，本发明涉及以小鼠SEPS1基因的核苷酸序列为基础，设计特异性的寡聚核苷酸引物和荧光标记探针，采用实时荧光定量PCR技术组装脓毒症的检测试剂盒，本发明也涉及其检测方法。
    背景技术
    Selenoprotein S1(SEPS1)是一种新发现的对内质网的应激反应和炎症控制起作用的基因。近来的研究结果显示SEPS1与炎症细胞因子的产生存在直接的联系，可能在炎症介导的胰岛素依赖型糖尿病以及一些其他的免疫异常中起主要作用。
    许多常见疾病的发生机制都包含了免疫系统的激活，例如糖尿病，肿瘤和心血管疾病。最近的研究显示炎症反应持续作用的结果是导致这些疾病的发生。细胞暴露于应激条件下会激活免疫，由此导致循环中促炎症因子水平升高，这与SEPS1基因下调相关。
    SEPS1在保护内质网功能完整性以抵御潜在的代谢应激中也起重要作用。SEPS1被分类为一个新的内质网膜蛋白，参与将错误折叠蛋白质由内质网转运到溶酶体，在溶酶体中通过蛋白酶体进行泛蛋白化和降解。SEPS1同时也参与调节细胞氧化还原平衡并保护内质网免受氧化应激的有害作用。内质网功能受损时，损伤导致的不良反应是诱使一些基因表达，将导致转录因子NF‑KB的活化。活化的NF‑KB进入细胞核，激活包括编码促炎性细胞因子在内的基因转录。[Kryukov GV， et al.Characterization of mammalian selenoproteomes.Science，2003，(300)：1439‑1443]
    人类SEPS1基因位于染色体15q26.3，包含6个外显子，编码一个有189个氨基酸的蛋白质。15号染色体的这个区域以前被认为包含影响炎性疾病的数量性状遗传位点(quantitative trait loci QTLs)，这些炎性疾病包括胰岛素依赖型糖尿病，Alzheimer’s病和腹部疾病。这样SEPS1有可能是炎症相关疾病多样性的功能因素和位置因素。[Zamani，M.，Pociot，F.，Raeymaekers，P.，Nerup，J.& Cassiman，J.J.Linkage of type I diabetes to 15q26(IDDM3)in the Danish population.Hum.Genet.1996 98，491‑496；Field，L.L.，Tobias，R.& Magnus，T.A locus on chromosome 15q26(IDDM3)produces susceptibility to insulin‑dependent diabetes mellitus.Nat.Genet.19948，189‑194.]。
    脓毒症是最古老的疾病之一，近50年来发病率及病死率逐渐升高，有报道1979年‑1999年问患病率增加了300％，目前全世界每天约有1400人死于本症。革兰阴性菌(G‑)感染是引起脓毒症的重要原因之一，G‑菌外膜的活性成分内毒素(endotoxin)即脂多糖(lipop0lysaccharide，LPS)与巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传导系统，最终激活核转录因子‑κB(nuclear factorκB，NF‑κB)，引起多种细胞因子和炎症介质(TNF、IL‑Iβ、IL‑6等)的表达和释放，导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位。机体的这种防御反应有利于清除病原菌，但如反应过度，则会引发“炎症级联反应″或伴有免疫功能的严重抑制，即全身炎症反应综合症或代偿性抗炎反应综合症(compensatory anti‑inflammatory reaction syndrome，CARS)，表现为脓毒症，脓毒性休克甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种检测小鼠SEPS1基因表达水平的的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
    本发明的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对小鼠脓毒症进行快速的检测。
    为了实现上述目的，本发明根据GenBank提供的小鼠SEPS1基因保守序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。特异引物及探针名称及序列为：上游引物序列为SEQ ID NO.1 TGGAGACCGAGAGCCTGCGA，下游引物序列为SEQ ID NO.2 CGGCTTGGTCCAGCTGTCTCT，探针为：FAM‑GCGGGAAGCT CTTGCAGATT‑TAMRA。其中FAM为羧基荧光素，是标记在5’端荧光基因；TAMRA为荧光染料，是标记在3’端的荧光淬灭基团。
    本发明还制备了小鼠SEPS1基因的阳性对照重组质粒。制备步骤方法如下：使用TRNzol试剂抽提脓毒症小鼠肝组织的总RNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为：上游引物SEQ ID NO.1(2μmol/L)1μl，5×第一链缓冲液4μl，dNTP混合物(每种2.5mmol/L)4μl，0.1mol/L DTT2μl，SuperScript RNase H逆转录酶(200U/μl)2μl。反应条件为：37℃水浴60分钟，95℃水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM‑T克隆载体上，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND‑1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备。
    本发明还制备了一种检测小鼠SEPS1基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒，组分如下：特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1 TGGAGACCGAGAGCCTGCGA，下游引物序列为SEQ ID NO.2 CGGCTTGGTCCAGCTGTCTCT，扩增子大小为153bp。特异性探针为SEQ ID NO.3：5’FAM‑TGCTGGCCAGCTATGGCTGG‑TAMRA3’。荧光定量PCR反应液为Hot‑start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer和dNTP混合物(每种10mmol/L)。
    本发明还公开了一种检测小鼠SEPS1基因表达水平的的荧光定量PCR试剂盒的使用方法如下：荧光定量PCR体系：Hot‑start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer 5μl，dNTP混合物(每种10mmol/L)1μl，上游引物(10μmol/L)，下游引物(10μmol/L)，特异性探针(5μmol/L)各1μl，样品cDNA 5μl或标准质粒DNA 2μl或阴性质控标准品5μl加离子水至50μl。荧光定量PCR程序：5℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。
    本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107‑102copies/μl，最小检出浓度为102copies/μl。
    通过本发明的样品检测发现本试剂盒阴性检测准确率95％，阳性准确率为100％。连续3次重复实验，实验结果稳定，变异系数小于1.5％。
    附图说明
    图1为脓毒症小鼠肝组织SEPS1蛋白的变化。
    图2为脓毒症小鼠肝组织SEPS1组织化学检测。
    图3为脓毒症小鼠肺组织SEPS1组织化学检测。
    图4是利用阳性DNA片段梯度稀释后制备的荧光定量标准曲线：Y＝‑3.39X+42.7，R＝0.993。
    具体实施方式
    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。
    实施例1 SEPS1蛋白在脓毒症小鼠中过表达
    1、脓毒症小鼠动物模型的建立
    实验小鼠为巴比C小鼠(购自协和医科大学实验动物中心)，清洁级，体重17～20g。小鼠购进后在本单位动物实验室饲养3天，室温维持22～25℃。
    脓毒症小鼠动物模型的建立：实验前12h小鼠禁食，自由饮水，腹腔内注射内毒素10mg/kg，单笼饲养。60只小鼠随机选取对10只不注射内毒素，作为对照组，其余制作脓毒症模型。
    正常对照组麻醉后活杀，脓毒症组小鼠腹腔注射内毒素10mg/kg后，分别于6h、12h、24h、48h留取标本，每个时间点不少于10只动物。
    2、Western Blot免疫印迹检测小鼠肝组织SEPS1蛋白的表达
    1)组织裂解及蛋白定量：肝组织剪碎后置于预冷的玻璃匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液后研磨。100mg组织/ml裂解液，充分裂解，冰浴30min，12000g，4℃离心5min，吸取上清(内含胞浆蛋白)，分装，200‑300μl每管，立即置于‑20℃保存(短期保存可4℃)。留少许样品进行蛋白质浓度测定。采用Bradford考马斯亮蓝法，通过测量595nm处的吸光度值，进行蛋白质定量。
    2)凝胶配制：配方见分子克隆手册，分离胶迅速注入玻璃板间隙，并覆盖一层三蒸水，置于室温。待30min后，倒出覆盖层水，滤纸吸干。灌制积层胶。立即插入梳子。
    3)电泳：将蛋白样品(20μg)与等体积2×SDS凝胶上样缓冲液混匀，在100℃水浴煮沸3min以使蛋白质变性。待积层胶聚合完全后，拔掉梳子上样。电泳在Tris‑甘氨酸缓冲液中进行，所用电压为：积层胶120V，分离胶140V。待溴酚兰电泳至凝胶底部终止电泳，取下凝胶。
    4)转膜：备6张Whatman 3M滤纸和一张硝酸纤维素膜，大小与凝胶一致。将硝酸纤维素膜漂浮于转移缓冲液上，借毛细作用使之从下向上浸湿后，把6张滤纸与凝胶一起浸没于缓冲液中室温平衡30min。安装转移装置，平放下部电极(阳极)，石墨面朝上，逐张叠放精确对齐3张浸泡过缓冲液的滤纸，用玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡。然后将硝酸纤维素膜精确放在滤纸上，确保滤纸与膜之间没有气泡。再将凝胶精确放在膜上。凝胶左下角置于膜的标记角上，戴手套排出所有气泡。把另3张浸泡过缓冲液的滤纸放在凝胶上，同样确保各层对齐且不留气泡。放置上部电极(阴极)，石墨面朝下。连接电源，阳极(红色)导线连接底部石墨电极。根据凝胶面积按照0.65mA/cm2接通电流，电转移2h，完毕后用丽春红S染液证实已将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
    5)纤维素膜的封闭与杂交：封闭硝酸纤维膜的免疫球蛋白结合位点。封闭液为1×TBST配制的10％的脱脂奶粉溶液，把硝酸纤维素膜放入可以加热封接的塑料袋中，根据滤膜面积按0.1ml/cm2加入封闭液，尽可能排出里面的气泡，然后封闭袋口，平放在37℃摇床1h。取出后，加入一抗1∶300，4℃过夜。剪开塑料袋，倾去一抗，PBS漂洗滤膜3次，每次10min。加入二抗，工作液浓度1∶1000，尽可能排出里面的气泡，然后封闭袋口，平放在37℃摇床1h。剪开塑料袋，倾去封闭液和二抗，PBS漂洗滤膜3次，每次10min。发光试剂显色，X光片于其上曝光1min，冲洗，扫描成像。
    3、免疫组织化学法检测肝脏和肺脏中SEPS1蛋白表达
    免疫组化染色步骤：
    1)石蜡切片脱蜡至水。
    2)3％H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
    3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟
    4)5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。
    5)倾去血清，勿洗，滴加一抗(Anti‑SEPS1，Sigma公司)，4℃过夜。
    6)PBS冲洗，5分钟×3次。
    7)生物素标记二抗(1％BSA‑PBS稀释)，37℃孵育10～30分钟；
    8)PBS冲洗，5分钟×3次。
    9)滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
    10)PBS冲洗，5分钟×3次。
    11)显色剂显色(DAB或AEC)。
    12)自来水充分冲洗，复染，封片。
    4、Western Blot检测脓毒症小鼠肝组织SEPS1蛋白表达规律
    actin为内参照。正常对照动物肝组织中有少量SEPS1蛋白表达。内毒素攻击导致的脓毒症小鼠肝脏SEPS1蛋白表达显著升高，并于伤后第24h达峰值。(图1)。
    5、肝脏中SEPS1蛋白的表达情况
    石蜡切片免疫组化研究结果显示棕黄色为SEPS1蛋白表达阳性部位。正常对照动物肝组织中有少量SEPS1蛋白表达(0h)。内毒素攻击致脓毒症小鼠肝脏SEPS1蛋白表达逐渐增高，并于伤后第24h～48h达峰值(24h)，表现为棕黄色阳性部位增多(图2)。
    6、肺脏中SEPS1蛋白的表达情况
    石蜡切片免疫组化研究结果显示棕黄色为SEPS1蛋白表达阳性部位。正常对照动物肺组织中仅有极少量SEPS1蛋白表达(0h)。内毒素攻击致脓毒症小鼠肺脏SEPS1蛋白表达逐渐增高，并于伤后第24h～48h达峰值，表现为棕黄色阳性部位增多(图3)。
    通过上述研究结果显示，当小鼠患有脓毒症时，小鼠肝组织和肺组织的SEPS1蛋白表达量较正常小鼠肝组织和肺组织的SEPS1蛋白表达量显著升高。由于SEPS1蛋白的表达量是由SEPS1基因的表达水平控制的，因此我们可以通过检测SEPS1基因的表达量作为诊断脓毒症的一个指标。
    实施例2 一种检测小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒的制备
    1、小鼠SEPS1基因的荧光定量PCR试剂盒组成


    其中，Hot‑start Taq DNA聚合酶及10×buffer购自天时代公司，dNTP混合物购自Promega公司。
    2、引物设计与探针合成
    根据GenBank提供的小鼠SEPS1基因保守序列，采用ABI primer Express 2.0软件设计探针和引物。特异引物及探针名称及序列为：上游引物序列为SEQ ID NO.1TGGAGACCGAGAGCCTGCGA，下游引物序列为SEQ ID NO.2
    CTGGATGC ATGTATGATGTG，探针为：5’FAM‑
    TGCTGGCCAGCTATGGCTGG‑TAMRA3’。其中FAM为羧基荧光素，是标记在5’端荧光基因；TAMRA为荧光染料，标记在3’端，荧光淬灭报告基团的同时，TAMRA自身会在更高波长处发射荧光。上述序列和探针由Invitrogen公司合成。
    3、小鼠SEPS1基因的阳性对照重组质粒的制备
    按照说明书，使用TRNzol试剂(购自Invitrogen公司)抽提脓毒症小鼠肝组织的总RNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为：上游引物SEQ ID NO.1(2μmol/L)1μl，5×第一链缓冲液4μl，dNTP混合物(每种2.5mmol/L)4μl，0.1mol/L DTT2μl，SuperScript RNase H逆转录酶(200U/μl)2μl(购自Invitrogen公司)反应条件为：37℃水浴60分钟，95℃3分钟。
    将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR反应，反应体系和条件如下：10×Ex Taq buffer 10ul，dNTP Mixture(各2.4mM)4ul，Sequence NO.1(10pmol)4ul，Sequence NO.2(10pmol)4ul，cDNA(0.1‑2ug)5ul，Ex Taq DNA聚合酶0.5ul，双蒸水补齐至100ul。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，35cycles；最后72℃延伸10min。
    取样5μl，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化(回收使用试剂盒：EZ‑10Spin Column DNA Gel Extraction Kit)，将纯化产物连接到PGM‑T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND‑1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准质粒浓度范围在109‑101copies/μl)。
    4、定量标准曲线的建立
    将构建好的重组质粒测定稀释后，计算拷贝数/ml，10倍倍比稀释成109‑101拷贝/ml浓度梯度，每个浓度平行加入3个反应管同时进行荧光定量扩增，反应在BIO‑RAD CFX(Bio‑Rad Laboratories USA)实时荧光定量PCR仪上进行，50μl反应体系包括：Hot‑start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer7μl，dNTP混合物1μl，特异性引物SEQ ID NO.1，特异性引物SEQ ID NO.2，特异性探针各1μl，去离子水补齐至50μl。反应程序为：95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。无菌水用于阴性对照，重复3次，反应结束后计算机自动绘制标准曲线，检测结果由Bio‑Rad CFX Manager软件和Excel进行数据分析，得到标准曲线：Y＝‑3.39X+42.7，R＝0.993(图4)，起始模版在107‑103拷贝/ml时线性较好。
    5、阴性对照的制备
    使用RNA抽提试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)抽提正常对照组小鼠肝组织中的RNA，进行逆转录反应，得到cDNA，作为阴性对照。通过扩增管家基因GAPDH(引物购自TAKARA公司)检测该cDNA的完整性，PCR产物电泳结果明显，该cDNA完整，可用作阴性对照。
    6、敏感性实验
    取重组质粒按比例稀释为105、104、103、102、10、1个拷贝/ml，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为107‑102copies/μl，最小检出浓度为102copies/μl。
    实施例3 小鼠SEPS1基因的检测方法
    一种小鼠SEPS1基因的检测方法，包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、SEPS1基因的扩增，其具体步骤如下：
    1样品RNA的提取
    按Trizol试剂盒说明书提取小鼠肝脏和肺脏的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。采用上海华舜生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒子提取。主要操作步骤如下：
    (1)用细胞裂解液BL裂解组织细胞，离心取上层细胞。在上层细胞中加入1ml的Trizol，用带针头的一次性注射器抽打裂解物10次，室温5分钟。
    (2)静置5分钟后，加入200μl的氯仿，用力颠倒离心管混匀后，室温静置使之分层，12000g离心5分钟，小心移取水相至1.5ml的离心管中。
    (3)加入等体积的异丙醇，彻底混匀后，取出750μl移入吸附柱，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，将剩余的全部将入吸附柱中，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。
    (4)加入500μL RP液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。
    (5)将500μl的W3液，静置1分钟，离心15秒。
    (6)将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500μl W3液，离心15秒。
    (7)倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一收集管中，离心1分钟。
    (8)将吸附柱放入另一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50μl纯水，室温静置1分钟后，离心1分钟。将RNA贮存于‑70℃。
    (9)总RNA完整性鉴定：取2μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。
    (10)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度
    2样品cDNA的制备
    RNA的反转录使用试剂盒(MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit)，其中RNase Inhibitor及M‑MuLV Reverse Transcriptase需置于冰上，其他试剂(如5×Reaction Buffer，dNTP Mix，Oligo‑p(dT)18 Primer)室温融化。试验操作时必须戴一次性PE手套。RNA试验相关的器材必须防止RNase的污染。所有试剂融化后置于冰上，使用前进行短离心。具体步骤如下：
    1.利用PCR管在冰上配制如下体系：
    模板RNA 1‑5μg
    Oligo(dT)18primer 1μl(0.5μg/μl)
    加DEPC水至12μl
    轻轻混合，并短离心5s；
    2.70℃温育5min，冰上冷却30s，之后短离心；
    3.PCR管置于冰上，再向其中加入：
    5×reaction buffer 4μl
    RNase inhibitor 1μl(20U/μl)
    dNTPMix2μl(10mmol/l)
    M‑MuLV Reverse Transcriptase 1μl(20U/μl)
    加DEPC水至20μl，轻轻混合，之后短离心；
    4.37℃温育60min；
    5.70℃温育10min，4℃以结束反应。反转录得到的cDNA置于‑20℃保存。
    3SEPS1基因的扩增
    荧光定量PCR 50μl反应体系包括：cDNA模板2μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl，Hot‑start Taq DNA聚合酶的10×buffer7μl，dNTP混合物1μl，特异性引物SEQ ID NO.1，特异性引物SEQ ID NO.2，特异性探针各1μl，去离子水补齐至50μl。荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min，采用NanoDrop ND‑1000核酸定量仪扩增SEPS1基因(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)。
    实施例4 样本检测
    腹腔注射内毒素10mg/kg建立脓毒症模型的小鼠20只，分别于6h、12h、24h、48h留取小鼠的肝组织，同时取10只正常小鼠的肝组织，使用RNA抽提试剂盒提取小鼠肝脏RNA，进行逆转录反应，逆转录反应的体系和条件同上，进行荧光定量PCR反应(反应体系和反应条件同上)，设置6个时间，每个时间4个平行，以重组质粒为阳性对照，正常小鼠肝脏组织的cDNA为阴性对照，水为空白对照，结果显示脓毒症小鼠肝脏SEPS1基因在24h和48h表达量最大。其中，6h SEPS1基因的表达量是阴性对照的3倍，12h SEPS1基因的表达量是阴性对照的14倍，24h SEPS1基因的表达量骤增是阴性对照的86倍，48h SEPS1基因的表达量是阴性对照的102倍。
    腹腔注射内毒素10mg/kg建立脓毒症模型的小鼠20只，分别于6h、12h、24h、48h留取小鼠的肺组织，同时取10只正常小鼠的肺组织，使用RNA抽提试剂盒提取小鼠肺脏RNA，进行逆转录反应，逆转录反应的体系和条件同上，进行荧光定量PCR反应(反应体系和反应条件同上)，设置6个时间，每个时间4个平行，以重组质粒为阳性对照，正常小鼠肺组织的cDNA为阴性对照，水为空白对照，结果显示脓毒症小鼠肺脏SEPS1基因的表达量和肝脏的表达趋势一致，也是在24h和48h表达量最大。其中，6h SEPS1基因的表达量是阴性对照的4倍，12h SEPS1基因的表达量是阴性对照的19倍，24h SEPS1基因的表达量骤增是阴性对照的102倍，48h SEPS1基因的表达量是阴性对照的121倍。
    通过对上述10个正常小鼠的肝脏和肺组织共20份样品，和20个脓毒症小鼠的肝脏和肺组织共40个样品检测中，结果显示20个正常小鼠组织样品中有1个为假阳性，40个脓毒症小鼠样品全为阳性，所以本试剂盒阴性检测准确率达到95％，阳性准确率达到100％。连续3次重复实验，实验结果稳定，变异系数小于1.5％，表明该试剂盒检测方法稳定可行，重复性好。
    上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。

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    一种 检测 小鼠 SEPS1 基因 荧光 定量 PCR 试剂盒
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