2仲丁基5羟基4，8二甲基7，8二氢2H吡喃4，3，2IJ异色原烯39ΑH酮及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103145723 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145723 A *CN103145723A* (21)申请号 201110401691.2 (22)申请日 2011.12.07 CGMCC No.5416 2011.10.28 C07D 493/06(2006.01) C12P 17/18(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01)(71)申请人上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园区牛。

2、顿路 200 号 8 号楼 5 楼 (72)发明人罗敏玉杨志钧夏兴王天娇陈代杰 (74)专利代理机构上海华工专利事务所 31104 代理人应云平 (54) 发明名称 2- 仲丁基 -5- 羟基 -4， 8- 二甲基 -7， 8- 二氢 -2H- 吡喃 4， 3， 2-ij 异色原烯 -3(9H)- 酮及其制备方法和应用 (57) 摘要本发明公开了一种化合物，具有以下结构式：还提供了通过发酵培养拟茎点霉属 (Phomopsis sp.) 菌株 CGMCC No.5416 来制备该化合物的方法。该化合物对人非小细胞肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人转移胰。

3、腺腺癌细胞和人原位胰腺腺癌细胞等多种肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页 (10)申请公布号 CN 103145723 A CN 103145723 A *CN103145723A* 1/1 页 2 1. 一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如下： 2. 如权利要求 1 所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过发酵培养拟茎点霉属 (Phomopsis sp.) 菌株。

4、 CGMCC No.5416 而得到。 3. 如权利要求 2 所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件如下：发酵温度为 27 30，时间为 28 35 天。 4. 如权利要求 2 所述的方法，其特征在于，还包括对发酵产物进行分离纯化的步骤。 5. 如权利要求 4 所述的方法，其特征在于，所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提取的步骤。 6. 如权利要求 5 所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将乙酸乙酯提取样品经减压硅胶柱分离的步骤。 7. 如权利要求 6 所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样品经 Sephadex LH20 柱分离。

5、的步骤。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将Sephadex LH20柱分离样品经半制备液相色谱纯化的步骤。 9. 如权利要求 1 所述的化合物的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤药物。 10. 如权利要求 9 所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌和胰腺癌。权利要求书 CN 103145723 A 2 1/4 页 3 2- 仲丁基 -5- 羟基 -4， 8- 二甲基 -7， 8- 二氢 -2H- 吡喃 4， 3， 2-ij 异色原烯 -3(9H)- 酮及其制备方法和应用技术领域 0001 本发明涉及新化合物，具体地说，是关于一种。

6、新的化合物及其制备方法和应用。背景技术 0002 本申请的发明人通过自然筛选的方法获得了一株拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株，命名为 HCCB03519，该菌株的保藏号为 CGMCC No.5416。目前对于该菌株的代谢产物的研究很少。发明内容 0003 本申请的发明人在对拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416的代谢产物的研究过程中，分离得到了一种化合物，经结构鉴定为一种新的化合物。 0004 因此，本发明的首要目的在于提供一种新的化合物。 0005 本发明的第二个目的在于提供所述化合物的制备方法。 0006 本发明的第三个目的在。

7、于提供所述化合物的应用。 0007 本发明的化合物，化学中文名为 2- 仲丁基 -5- 羟基 -4， 8- 二甲基 -7， 8- 二氢 -2H- 吡喃 4， 3， 2-ij 异色原烯 -3(9H)- 酮，英文名为 2-sec-butyl-5-hydroxy-4， 8-dimethyl-7， 8-dihydro-2H-pyrano4， 3， 2-ijisochromen-3(9aH)-one，其结构式如下： 0008 0009 本发明的化合物制备方法是通过发酵培养拟茎点霉属 (Phomopsis sp.) 菌株 CGMCC No.5416 而获得。 0010 根据本发明，所述。

8、制备方法包括对拟茎点霉属 (Phomopsis sp.) 菌株 CGMCC No.5416 的代谢产物进行分离纯化的步骤。 0011 根据一个优选实施例，所述发酵培养的条件如下： 0012 发酵温度为 27 30，时间为 28 35 天。 0013 根据一个优选实施例，所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提取的步骤。 0014 根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将乙酸乙酯提取样品经减压硅胶柱分离的步骤。 0015 根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样品经 Sephadex 说明书 CN 103145723 A 3 2/4 页 4 LH20 柱分离的步骤。。

9、 0016 根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将 Sephadex LH20 柱分离样品经半制备液相色谱纯化的步骤。 0017 本发明的化合物具有抗肿瘤的效果，可用于制备抗肿瘤药物。 0018 根据本发明的优选实施例，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌。 0019 本发明不仅提供了一种新的化合物，而且该化合物可用于抗肿瘤，因而具有广泛的开发应用前景。附图说明 0020 图 1 为本发明获得的化合物的质谱图。 0021 图 2 为本发明获得的化合物的氢谱图。 0022 图 3 为本发明获得的化合物的碳谱图。具体实施方式 0023 以下通过具体实施例，对本发明做进一步详细说。

10、明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。 0024 本发明所用的菌种为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)HCCB03519，于2011 年10月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，保藏号 CGMCCNo.5416。 0025 以下实施例中所使用的大米培养基的配方为：大米 800g，纯净水 1000ml， pH 自然； 115灭菌 20min。 0026 实施例 1、化合物的制备 0027 1.1、发酵 0028 采用大米培养基固体发酵拟茎点霉属 (Ph。

11、omopsis sp.) 菌株 HCCB03519，发酵温度为 27 30，时间为 28 35 天。 0029 1.2、分离纯化 0030 将 1.1 获得的大米发酵物用乙酸乙酯提取后用减压硅胶进行柱分离，采用石油醚 /乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，其中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为7525，浓缩得粗样。 0031 然后，用 Sephadex LH20 柱 (3.452cm) 进行分离，采用二氯甲烷 / 甲醇混合溶剂进行洗脱，其中，二氯甲烷与甲醇的体积比为 20 1，得到粗样。 0032 对得到的粗样进一步用半制备液相色谱 ( 半制备柱为 Agilent ZORBAX S。

12、B-C18， 5m， 9.4mm250mm) 分离 (0 25min 用 58乙腈等度洗脱， 25 40min 用 58 100 乙腈梯度洗脱，流速 2ml/min)，截取保留时间为 25.6min 的物质，最终获得化合物纯品，用于以下结构鉴定。 0033 实施例 2、化合物的结构鉴定 0034 将实施例1中获得的化合物经正离子电喷雾质谱检测，图谱如图1所示，显示其准分子离子峰为：为m/z 291.1590M+H+，对应分子式为C17H23O4，采用Bruker Avance II-400 型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱 ( 图 2)、碳谱 ( 图 3) 和核磁。

13、(CDCl3， 400MHz)，核磁数据如表 1 所示。说明书 CN 103145723 A 4 3/4 页 5 0035 表 1、化合物的 NMR 数据 0036 0037 0038 通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了该化合物的结构如下： 0039 0040 该化合物分子式为 C17H22O4，分子量为 290，化学中文名为 2- 仲丁基 -5- 羟基 -4， 8- 二甲基 -7， 8- 二氢 -2H- 吡喃 4， 3， 2-ij 异色原烯 -3(9H)- 酮，英文名为 0041 2-sec-butyl-5-hydroxy-4， 8-dimet。

14、hyl-7， 8-dihydro-2H-pyrano4， 3， 2-ij isochromen-3(9aH)-one。 0042 经检索，现有技术中未见有报道过，是一种新的化合物。 0043 实施例 3、化合物的生物活性 0044 本实施例中使用的细胞 ( 均来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 ) 为： A549( 人非小细胞肺癌细胞 )， MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)， MCF-7(人乳腺癌细胞)， PANC-1(人胰腺癌细胞)， AsPC-1(人说明书 CN 103145723 A 5 4/4 页 6 转移胰腺腺癌。

15、细胞 )，和 BxPC-3( 人原位胰腺腺癌细胞 )。 0045 对实施例 1 中获得的化合物进行生物活性检测，具体方法如下： 0046 将对数生长期肿瘤细胞，用微量移液器吸取去除上清，用适量的 PBS 缓冲液清洗去除表层衰老的细胞，用胰蛋白酶消化细胞， 1000rpm 离心 5min，去除上清液。加入营养液 ( 含有 10小牛血清， 100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素 )，做成单细胞悬浮液，用血球计数板计数后，按照 50,000 个 /ml 接种，取 100l/ 孔于 96 孔板中，将 96 孔板置于 37的 5 CO2培养箱中培养24h。将DMS。

16、O溶解的终浓度为50g/ml的化合物(DMSO的终浓度为1) 加入到培养好的 96 孔板细胞中，置于 37的 5 CO2培养箱中培养 48h。采用 MTT 染料对活细胞染色，次日用 Bio-Rad680 酶标仪在波长 570nm 下测定 OD 值，来研究化合物对肿瘤细胞抑制能力。阴性对照为 1的 DMSO，阳性对照为 5- 氟尿嘧啶 ( 终浓度为 50g/ml) ；每个实验重复 3 次，计算平均值。其中，肿瘤细胞生长的抑制率的计算公式如下： 0047 0048 化合物对肿瘤细胞的抑制率结果如表 2 所示。 0049 表 2、化合物对肿瘤细胞的抑制率 ( ) 0050 检。

17、测对象 A549 MDA-MB-231 MCF-7 PANC-1 AsPC-1 BxPC-3 本发明化合物 42.5 54.7 44.1 60.1 30.2 48.1 5- 氟尿嘧啶 44.1 57.2 44.6 42.9 44.9 70.6 0051 由表 2 的结果可知，本发明的化合物对人肺癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤细胞均具有良好的抗肿瘤活性，因而可以用于制备治疗肿瘤的药物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。说明书 CN 103145723 A 6 1/3 页 7 图 1 说明书附图 CN 103145723 A 7 2/3 页 8 图 2 说明书附图 CN 103145723 A 8 3/3 页 9 图 3 说明书附图 CN 103145723 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201110401691.2	申请日：	2011.12.07
公开号：	CN103145723A	公开日：	2013.06.12
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07D 493/06申请公布日:20130612\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D493/06; C12P17/18; A61K31/352; A61P35/00; C12R1/645(2006.01)N	主分类号：	C07D493/06
申请人：	上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
发明人：	罗敏玉; 杨志钧; 夏兴; 王天娇; 陈代杰
地址：	201203 上海市浦东新区张江高科技园区牛顿路200号8号楼5楼
优先权：
专利代理机构：	上海华工专利事务所 31104	代理人：	应云平
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内容摘要

本发明公开了一种化合物，具有以下结构式：还提供了通过发酵培养拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416来制备该化合物的方法。该化合物对人非小细胞肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人转移胰腺腺癌细胞和人原位胰腺腺癌细胞等多种肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。

权利要求书

权利要求书一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如下：

如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过发酵培养拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416而得到。
如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件如下：
发酵温度为27～30℃，时间为28～35天。
如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对发酵产物进行分离纯化的步骤。
如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提取的步骤。
如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将乙酸乙酯提取样品经减压硅胶柱分离的步骤。
如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样品经Sephadex LH20柱分离的步骤。
如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分离纯化还包括将Sephadex LH20柱分离样品经半制备液相色谱纯化的步骤。
如权利要求1所述的化合物的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤药物。
如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌和胰腺癌。

说明书

说明书2‑仲丁基‑5‑羟基‑4，8‑二甲基‑7，8‑二氢‑2H‑吡喃[4，3，2‑ij]异色原烯‑3(9αH)‑酮及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及新化合物，具体地说，是关于一种新的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
本申请的发明人通过自然筛选的方法获得了一株拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株，命名为HCCB03519，该菌株的保藏号为CGMCC No.5416。目前对于该菌株的代谢产物的研究很少。
发明内容
本申请的发明人在对拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416的代谢产物的研究过程中，分离得到了一种化合物，经结构鉴定为一种新的化合物。
因此，本发明的首要目的在于提供一种新的化合物。
本发明的第二个目的在于提供所述化合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述化合物的应用。
本发明的化合物，化学中文名为2‑仲丁基‑5‑羟基‑4，8‑二甲基‑7，8‑二氢‑2H‑吡喃[4，3，2‑ij]异色原烯‑3(9αH)‑酮，英文名为2‑sec‑butyl‑5‑hydroxy‑4，8‑dimethyl‑7，8‑dihydro‑2H‑pyrano[4，3，2‑ij]isochromen‑3(9aH)‑one，其结构式如下：

本发明的化合物制备方法是通过发酵培养拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416而获得。
根据本发明，所述制备方法包括对拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株CGMCC No.5416的代谢产物进行分离纯化的步骤。
根据一个优选实施例，所述发酵培养的条件如下：
发酵温度为27～30℃，时间为28～35天。
根据一个优选实施例，所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提取的步骤。
根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将乙酸乙酯提取样品经减压硅胶柱分离的步骤。
根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样品经Sephadex LH20柱分离的步骤。
根据一个优选实施例，所述分离纯化还包括将Sephadex LH20柱分离样品经半制备液相色谱纯化的步骤。
本发明的化合物具有抗肿瘤的效果，可用于制备抗肿瘤药物。
根据本发明的优选实施例，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌。
本发明不仅提供了一种新的化合物，而且该化合物可用于抗肿瘤，因而具有广泛的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明获得的化合物的质谱图。
图2为本发明获得的化合物的氢谱图。
图3为本发明获得的化合物的碳谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明所用的菌种为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)HCCB03519，于2011 年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNo.5416。
以下实施例中所使用的大米培养基的配方为：大米800g，纯净水1000ml，pH自然；115℃灭菌20min。
实施例1、化合物的制备
1.1、发酵
采用大米培养基固体发酵拟茎点霉属(Phomopsis sp.)菌株HCCB03519，发酵温度为27～30℃，时间为28～35天。
1.2、分离纯化
将1.1获得的大米发酵物用乙酸乙酯提取后用减压硅胶进行柱分离，采用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱，其中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为75∶25，浓缩得粗样。
然后，用Sephadex LH20柱(3.4×52cm)进行分离，采用二氯甲烷/甲醇混合溶剂进行洗脱，其中，二氯甲烷与甲醇的体积比为20∶1，得到粗样。
对得到的粗样进一步用半制备液相色谱(半制备柱为Agilent ZORBAX SB‑C18，5μm，9.4mm×250mm)分离(0～25min用58％乙腈等度洗脱，25～40min用58％～100％乙腈梯度洗脱，流速2ml/min)，截取保留时间为25.6min的物质，最终获得化合物纯品，用于以下结构鉴定。
实施例2、化合物的结构鉴定
将实施例1中获得的化合物经正离子电喷雾质谱检测，图谱如图1所示，显示其准分子离子峰为：为m/z 291.1590[M+H]+，对应分子式为C17H23O4，采用Bruker Avance II‑400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图2)、碳谱(图3)和核磁(CDCl3，400MHz)，核磁数据如表1所示。
表1、化合物的NMR数据

通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了该化合物的结构如下：

该化合物分子式为C17H22O4，分子量为290，化学中文名为2‑仲丁基‑5‑羟基‑4，8‑二甲基‑7，8‑二氢‑2H‑吡喃[4，3，2‑ij]异色原烯‑3(9αH)‑酮，英文名为
2‑sec‑butyl‑5‑hydroxy‑4，8‑dimethyl‑7，8‑dihydro‑2H‑pyrano[4，3，2‑ij]isochromen‑3(9aH)‑one。
经检索，现有技术中未见有报道过，是一种新的化合物。
实施例3、化合物的生物活性
本实施例中使用的细胞(均来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)为：A549(人非小细胞肺癌细胞)，MDA‑MB‑231(人乳腺癌细胞)，MCF‑7(人乳腺癌细胞)，PANC‑1(人胰腺癌细胞)，AsPC‑1(人转移胰腺腺癌细胞)，和BxPC‑3(人原位胰腺腺癌细胞)。
对实施例1中获得的化合物进行生物活性检测，具体方法如下：
将对数生长期肿瘤细胞，用微量移液器吸取去除上清，用适量的PBS缓冲液清洗去除表层衰老的细胞，用胰蛋白酶消化细胞，1000rpm离心5min，去除上清液。加入营养液(含有10％小牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)，做成单细胞悬浮液，用血球计数板计数后，按照50,000个/ml接种，取100μl/孔于96孔板中，将96孔板置于37℃的5％CO2培养箱中培养24h。将DMSO溶解的终浓度为50μg/ml的化合物(DMSO的终浓度为1％)加入到培养好的96孔板细胞中，置于37℃的5％CO2培养箱中培养48h。采用MTT染料对活细胞染色，次日用Bio‑Rad680酶标仪在波长570nm下测定OD值，来研究化合物对肿瘤细胞抑制能力。阴性对照为1％的DMSO，阳性对照为5‑氟尿嘧啶(终浓度为50μg/ml)；每个实验重复3次，计算平均值。其中，肿瘤细胞生长的抑制率的计算公式如下：

化合物对肿瘤细胞的抑制率结果如表2所示。
表2、化合物对肿瘤细胞的抑制率(％)
检测对象 A549 MDA‑MB‑231 MCF‑7 PANC‑1 AsPC‑1 BxPC‑3 本发明化合物 42.5 54.7 44.1 60.1 30.2 48.1 5‑氟尿嘧啶 44.1 57.2 44.6 42.9 44.9 70.6
由表2的结果可知，本发明的化合物对人肺癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤细胞均具有良好的抗肿瘤活性，因而可以用于制备治疗肿瘤的药物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。