菊花BHLH转录因子CMBHLH1基因及其植物表达载体和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103146712 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146712 A *CN103146712A* (21)申请号 201310096562.6 (22)申请日 2013.03.22 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 陈发棣 赵民 蒋甲福 陈素梅 李佩玲 宋爱萍 房伟民 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 。

2、32218 代理人 徐冬涛 傅婷婷 (54) 发明名称 菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因及其植物表 达载体和应用 (57) 摘要 本发明属于基因工程领域， 涉及菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因及其植物表达载体和 应用。本发明菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基 因 序 列 如 SEQ ID NO.1 所 示， 所 构 建 的 表 达 载体 pCAMBIA1301 （+/） CmbHLH1 是将 CmbHLH1 基因插入到克隆载体 pMD19T simple vector(Takara)，后 经 过 BamH I(Takara) 和 Sac I(Takara) 双 酶。

3、 切 后 连 接 到 表 达 载 体 pCAMBIA1301 的 BamH I 和 Sac I 位点得到的。 将该植物表达载体用于植物遗传转化， 正反义 CmbHLH1 基因在 CaMV35S 启动子的启动下过量表 达， 从而达到影响下游目的基因的表达效果， 提高 植物铁离子的吸收能力并进一步验证该基因的功 能。菊属中该基因是首次发现与铁离子吸收相关 的 bHLH 转录因子。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 。

4、CN 103146712 A CN 103146712 A *CN103146712A* 1/1 页 2 1. 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因， 其特征在于该基因的序列为 SEQ ID NO.1。 2.含菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因的植物表达载体， 其特征在于由权利要求1所述 的菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因与植物表达载体构成。 3.根据权利要求2所述的含菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因的植物表达载体， 其特征 在于所述的植物表达载体是将CmbHLH1基因插入pCAMBIA1301表达载体的BamH I和Sac I 酶切位点所得。 4.权利要求2。

5、或3所述的菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因植物表达载体的构建方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 1） 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因的克隆 设计引物以菊花 钟山紫桂 cDNA 为模板， 利用 PCR 反应扩增上、 下游分别含 BamH I 和 Sac I 酶 切 位 点 的 CmbHLH1 基 因 ； 其 中 使 用 的 引 物 序 列 为 ： CmbHLH1-Sense-F ： SEQ ID NO.4， CmbHLH1-Sense-R:SEQ ID NO.5， CmbHLH1-Antisense-F:SEQ ID NO.6， CmbHLH1-Antisense-R:SE。

6、Q ID NO.7 ； 2） 植物表达载体 pCAMBIA1301-（+/-） -CmbHLH1 的构建 将 PCR 产物连接到 pMD19-T Simple 载体， 转化 DH5 感受态细胞， 提取阳性质粒， BamH I 和 Sac I 双酶切的 CmbHLH1 片段与 BamH I 和 Sac I 双酶切的 pCAMBIA1301 载 体片段连接， 转化， 提取阳性质粒， 电泳检测并测序验证为 SEQ ID NO.1， 植物表达载体 pCAMBIA1301-(+/-)-CmbHLH1 构建成功。 5. 权利要求 1 所述的菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因在菊花品种改良中的应。

7、用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于所述的菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因在 创制高铁离子吸收菊花新种质中的应用。 7. 权利要求 2 所述的含菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因的植物表达载体在菊花品种 改良中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于所述的含菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因 的植物表达载体在创制高铁离子吸收菊花新种质中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103146712 A 2 1/6 页 3 菊花bHLH转录因子CmbHLH1基因及其植物表达载体和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及菊花bHLH转录因子Cm。

8、bHLH1基因及其植物表达载 体和应用。 背景技术 0002 植物转录因子在植物的生长发育过程中起着重要作用， 转录调控过程的研究已成 为当今分子生物学的研究重点。bHLH 转录因子是植物中第二大类转录因子家族， 该家族成 员在调控一系列重要的生理过程中发挥着重要作用， 例如， 调节植物根毛的形成、 种子与芽 的形态发生、 光的形态建成以及植物对激素和外界环境因子响应的反应 1 5. 0003 菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一， 极 具观赏价值与经济价值。干旱、 盐碱、 冻害、 病害等胁迫以及栽培土壤中自身营养元素的缺 乏是导致菊花品。

9、质下降、 生产产品不符合标准以及限制其园林应用的主要影响因子。 目前， 菊花抗逆性育种多依赖于传统的杂交育种， 其过程缓慢、 耗费人力并且具有不定向性， 杂交 后代往往不能够符合育种要求。 目前， 菊花转录因子的研究还仅限于DREB转录因子、 MYB转 录因子等少数类型的转录因子 6 8， 还有许多关键的调控转录因子没有被发掘和利用， 这严 重制约着菊花分子遗传改良及其新品种的选育。鉴于 bHLH 转录因子在植物生长发育过程 中发挥着重要调控作用， 控制着一系列重要的生理生化过程， 因而对该类转录因子的分子 机理研究具有十分重要的意义， 对于菊花新品种的选育也具有指导作用。 0004 在基因工。

10、程育种过程中， 通常选用农杆菌介导法将外源基因导入到植物细胞中， 其中最关键的就是植物表达载体的构建。将转录因子基因构建植物表达载体， 并用农杆菌 介导法进行植物遗传转化， 使转录因子在 CaMV35S 启动子的启动下超量表达， 达到调控下 游目的基因的目的， 对于充分发挥该基因的功能、 新品种的选育及在生产中的广泛应用都 具有深远意义。 0005 1Yi,K.,Menand,B.,Bell,E.,and Dolan,L.A basic helixloophelix transcription factor controls cell growth and size in root hairs。

11、.Nature genetics.2010,42:264267. 0006 2Sun,X.,Shantharaj,D.,Kang,X.,and Ni,M.Transcriptional and hormonal signaling control of Arabidopsis seed development.Current opinion in plant biology.2010,13:611620. 0007 3Nozue,K.,Covington,M.F.,Duek,P.D.,Lorrain,S.,Fankhauser,C.,Harmer, S.L.,and Maloof,J.N.Rh。

12、ythmic growth explained by coincidence between internal and external cues.Nature.2007,448:358361. 0008 4Yadav,V.,Mallappa,C.,Gangappa,S.N.,Bhatia,S.,and Chattopadhyay,S. A basic helixloophelix transcription factor in Arabidopsis,MYC2,acts as a repressor of blue lightmediated photomorphogenic growth.。

13、The Plant Cell Online.2005,17:19531966. 说 明 书 CN 103146712 A 3 2/6 页 4 0009 5Dombrecht,B.,Xue,G.P.,Sprague,S.J.,Kirkegaard,J.A.,Ross,J. J.,Reid,J.B.,Fitt,G.P.,Sewelam,N.,Schenk,P.M.,and Manners,J. MMYC2differentially modulates diverse jasmonatedependent functions in Arabidopsis.The Plant Cell Online。

14、.2007,19:22252245. 0010 6Yanfang Yang,Jian Wu,Kai Zhu,Liqing Liu,Fadi Chen,Deyue Yu.Identification and characterization of two chrysanthemum(Dendronthema moriforlium)DREB genes,belonging to the AP2/EREBP family.Molecular Biology Report.2009,36:7181. 0011 7Zheng Tong,Bo Hong,Yingjie Yang,Qiuhua Li,Na。

15、n Ma,Chao Ma and Junping Gao.Overexpression of two chrysanthemum DgDREB1group genes causing delayed flowering or dwarfism in Arabidopsis.Plant Molecular Biology.2009,71:115 129. 0012 8Shan Hong,Chen Sumei,Jiang Jiafu,Chen Fadi,Chen Yu,Gu Chunsun,Li Peiling,Song Aiping,Zhu Xirong,Gao Haishun,Zhou Guo。

16、qin,Li Ting,Yang Xue. Heterologous expression of the Chrysanthemum R2R3MYB transcription factor CmMYB2enhances drought and salinity tolerance,increases hypersensitivity to ABA and delays flowering in Arabidopsis thaliana.Molecular Biotechnology.2012,51(2):1 60173. 发明内容 0013 针对背景技术提出的解决提高菊花矿质元素吸收的问题，。

17、 提供一种新的菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因。 0014 本发明的另一目的在于该转录因子 CmbHLH1 基因的植物表达载体。 0015 本发明的又一目的是提供该基因的应用。 0016 本发明的目的可以通过以下技术方案实现 ： 0017 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因， 该基因的序列为 SEQ ID NO.1。 0018 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因的植物表达载体， 由本发明所述的菊花 bHLH 转 录因子 CmbHLH1 基因 （序列为 SEQ ID NO.1） 与中间植物表达载体 pCAMBIA1301 构成。 0019 上述的菊花 bHL。

18、H 转录因子 CmbHLH1 基因的植物表达载体， 是由 BamH I 和 Sac I 双酶切 CmbHLH1 后插入到 pCAMBIA1301 表达载体质粒进行连接反应得到。 0020 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因植物表达载体， 其构建方法如下 ： 0021 1） 菊花 bHLH 转录因子 CmbHLH1 基因的克隆 0022 以提取的菊花 钟山紫桂 幼嫩叶片为材料， 提取总 RNA 并反转录为 cDNA， 设计引 物扩增 CmbHLH1 基因， 上游引物 CmbHLH1 F:5 GTCTTACGAGAACAACA 3（SEQ ID NO.2） 0023 下游引物 CmbH。

19、LH1R:5TTAAGTTCTAAGGAGACA3（SEQ ID NO.3） 0024 以反转录的 cDNA 为模板， 进行聚合酶链式 PCR 反应， 产物连接到 pMD19 T Simple 载体， 转化 DH5 感受态细胞， 测定的序列为 SEQ ID NO.1。 0025 2） 植物表达载体 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1 的构建 0026 设计引物以菊花 钟山紫桂 cDNA 为模板， 利用 PCR 反应在 CmbHLH1 基因的上游和 下游分别引入 BamH I 和 Sac I 酶切位点 ( 下划线所示 )， 反应要求高保真酶进行。 说 明 书 CN 103146712 。

20、A 4 3/6 页 5 0027 CmbHLH1SenseF:5GCGGATCCATGGTTTCACCGGAGA3（SEQ ID NO.4） 0028 BamH I 0029 CmbHLH1SenseR:5TCGAGCTCTTAGGCAACAGGAGG3（SEQ ID NO.5） 0030 Sac I 0031 CmbHLH1AntisenseF:5GCGGATCCAATCCGTTGTCCTCC3（SEQ ID NO.6） 0032 BamH I 0033 CmbHLH1AntisenseR:5TCGAGCTCTACCAAAGTGGCCTCT3（SEQ ID NO.7） 0034 Sac I 。

21、0035 将 PCR 产物连接到 pMD19T Simple 载体， 转化 DH5 感受态细胞， 提取阳性 质粒， 用 BamH I 和 Sac I 双酶切含有 CmbHLH1 的 T 载体与 pCAMBIA1301 载体， 选择所需 片段进行连接， 转化， 提取阳性质粒， 电泳检测并测序验证为 SEQ ID NO.1， 植物表达载体 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1 构建成功。 0036 3） CmbHLH1 的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化， 提高菊花品种 神 马 的离子吸收能力， 方法如下 ： 0037 农杆菌菌株 EHA105 感受态制备及冻融法转化 0038 菊。

22、花品种 神马 的转化与抗性苗的筛选 0039 RTPCR 鉴定及离子吸收能力评价 0040 本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化， 创制高铁 离子吸收新种质， 可用于植物品种改良。 0041 本发明的有益效果 ： 0042 1本发明提供的菊花 CmbHLH1 基因是一个新发现的 bHLH 转录因子基因， 该基因 可提高植物的离子吸收能力。 0043 2本发明构建的菊花 CmbHLH1 基因植物表达载体为首次离子吸收相关 bHLH 类转 录因子的报道， 可直接用于农杆菌介导的遗传转化， 创制抗贫瘠土壤新种质， 可进行菊花品 种改良。 附图说明 0044 图 1 为 Cmb。

23、HLH1 琼脂糖凝胶电泳分析 0045 M ： DNA Marker ； 1 ： CmbHLH1 0046 图 2 为 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1 表达载体 BamH I 和 Sac I 双酶切检测图 0047 M ： DNA Marker ； 1 ： 正义载体双酶切 ； 2 ： 反义载体双酶切 0048 图 3 为转基因菊花 神马 的获得 0049 图 4 为野生型与转基因菊花 神马 表达量分析鉴定 0050 WT: 野生型 ； 35S:(+)CmbHLH11: 转正义载体表达株系 1 ； 35S:(+)CmbHLH12: 转正义载体表达株系 2 ； 35S:()CmbHL。

24、H11: 转反义载体表达株系 1 ； 35S:() CmbHLH12: 转反义载体表达株系 2 0051 图 5 为野生型与转基因菊花 神马 的离子吸收能力评价 0052 WT: 野生型 ； 35S:(+)CmbHLH11: 转正义载体表达株系 1 ； 35S:(+)CmbHLH12: 转正义载体表达株系 2 ； 35S:()CmbHLH11: 转反义载体表达株系 1 ； 35S:() 说 明 书 CN 103146712 A 5 4/6 页 6 CmbHLH12: 转反义载体表达株系 2 0053 图 6 为植物表达载体 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1 的构建策略 具体实施方式。

25、 0054 实施例 1.CmbHLH1 基因的克隆 0055 选用菊花 钟山紫桂 作为材料， 取 0.1g 幼嫩叶片， 按照 Trizol RNA 提取试剂盒 （TaKaRa） 说明书方法， 提取叶片总 RNA， 参照 M MLV 反转录试剂盒 （TaKaRa） 取 1g 总 RNA 反转录成cDNA， 后用RNase消化cDNA产物， 参照菊花EST文库中一序列信息， 经primer5软 件分析设计引物扩增 CmbHLH1 ； 0056 上游引物 CmbHLH1F:5GTCTTACGAGAACAACA3（SEQ ID NO.2） ， 0057 下游引物 CmbHLH1R:5TTAAGTTCT。

26、AAGGAGACA3（SEQ ID NO.3） ， 0058 以叶片 cDNA 为模板， 进行 PCR 反应， 50l 反应体系 ： 10RCR Buffer5.0l， CmbHLH1F、 CmbHLH1R 引物各 1.0l（20mol/L） ， dNTP mix4.0l(2.5mmol/L)， Taq DNA Polymerase0.2l， cDNA 模板 1l， ddH2O37.8l ； 反应程序 ： 95预变性 5min， 然后 94解链 45sec， 55退火 30sec， 72延伸 1min， 反应 35 个循环， 72延伸 10min ； 用凝胶 回收试剂盒 （AXYGEN） 回收。

27、纯化PCR产物， 用T4DNA连接酶 （TaKaRa） 连接到pMD19 T Simple 载体 （TaKaRa） ， 转化 DH5 感受态细胞， 序列测定为 SEQ ID NO.1（图 1） ； 0059 实施例 2. 植物表达载体 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1 的构建 （图 6） 0060 设计引物进行 PCR 反应， 在目的基因 CmbHLH1 的上游和下游分别引入酶切位点 BamH I 和 Sac I（下划线所示） ， 将 PCR 产物连接到 pMD19T Simple 载体， 转化 DH5 感 受态细胞， 提取阳性质粒， BamH I 和 Sac I 双酶切的 Cmb。

28、HLH1 片段与 BamH I 和 Sac I 双酶 切的 pCAMBIA1301 载体质粒片段进行连接， 转化， 提取阳性质粒， 电泳检测并测序验证 , （图 2） 。 0061 CmbHLH1SenseF:5GCGGATCCATGGTTTCACCGGAGA3（SEQ ID NO.4） 0062 BamH I 0063 CmbHLH1SenseR:5TCGAGCTCTTAGGCAACAGGAGG3（SEQ ID NO.5） 0064 Sac I 0065 CmbHLH1AntisenseF:5GCGGATCCAATCCGTTGTCCTCC3（SEQ ID NO.6） 0066 BamH I 。

29、0067 CmbHLH1AntisenseR:5TCGAGCTCTACCAAAGTGGCCTCT3（SEQ ID NO.7） 0068 Sac I 0069 以菊花 钟山紫桂叶片 cDNA 作为模板， 用高保真酶 （PrimeSTARTM HS DNA Polymerase， TaKaRa）进 行 PCR 反 应， 50l 反 应 体 系 ： 10HS RCR Buffer5.0l， CmbHLH1 Sense （Antisense） F 与 CmbHLH1 Sense （Antisense） R 引物各 1.0l(20mol/ l)， dNTP mix4.0l(2.5mmol/l)， Pri。

30、meSTARTM HS DNA Polymerase0.4l， cDNA 模 板 1l， ddH2O37.6l ； 反应程序 ： 95预变性 5min， 然后 94解链 45sec， 55退火 30sec， 72延伸 1min， 反应 35 个循环， 72延伸 10min ； 用凝胶回收试剂盒 （AXYGEN,USA）回收 PCR 产物， 连接到 pMD19T Simple 载体， 转化 DH5 感受态细胞， 提取阳性质粒 pMD19T SimpleCmbHLH1（正义或反义 pMD19T SimpleCmbHLH1） ； 说 明 书 CN 103146712 A 6 5/6 页 7 0070。

31、 取 pCAMBIA1301 载 体 和 pMD19T SimpleCmbHLH1 质 粒 用 BamH I 和 Sac I 双 酶 切， 双 酶 切 体 系 （50l） ： 10K Buffer2.5l， pCAMBIA1301 或 pMD19T SimpleCmbHLH110l， BamHI2l， Sac I2l， ddH2O33.5l ； 37反应 2.5h ； 双酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 用凝胶回收试剂盒 （AXYGEN） 回收质粒 pCAMBIA1301 大片 段和 pMD19T SimpleCmbHLH1 小片段。用 T4DNA 连接酶 （TaKaRa）连接两个回收的产 。

32、物， 连接反应体系 （10 l） ： 10T4 ligase Buffer 1l， pCAMBIA1301 大片段 2 l， pMD19T Simple CmbHLH1 小片段 6 l， T4 DNA 连接酶 1 l ； 16 过夜连接反应， 取 5 l 连接产物转化 DH5 感受态细胞。37 过夜培养， 挑取阳性单克隆扩大培养， 提取 质粒 pCAMBIA1301(+/) CmbHLH1， 电泳和测序验证含 SEQ ID NO.1。植物表达载体 pCAMBIA1301(+/) CmbHLH1 的构建成功 （图 2） 。 0071 实施例 3. 植物表达载体 pCAMBIA1301(+/)Cm。

33、bHLH1 遗传转化菊花 神马 及其离子吸收能力鉴定 0072 农杆菌菌株 EHA105 感受态制备及冻融法转化 0073 从 YEB（50 g/ml 利福平） 平板上挑取 EHA105 单菌落， 接种于 50ml 含 50g/ml 利福平的 YEB 液体培养基中， 200 rpm， 28培养至 OD 值 0.5， 而后冰浴菌液 30 min， 离心收 集菌体， 悬浮于 2 ml 预冷的的 100mM CaCl2（20% 甘油） 溶液中， 200l/ 管分装， 待用。 0074 取 10 l pCAMBIA1301(+/) CmbHLH1 载体质粒， 加入 200l 感受态细胞， 冰浴 30m。

34、in， 液氮冷冻 5min， 37 5min， 加入 800l YEB 液体培养基， 28 200rpm 预培养 4h， 菌液涂板于 YEB （50g/ml 利福平 +50g/ml 卡那霉素） 固体培养基上， 28暗培养 2d， 挑取单克隆检测， 选取阳性克隆摇菌， 培养到 OD 为 0.5 0.6 时， 用于叶盘法转化。 0075 叶盘法转化菊花 0076 取组培瓶中 神马 苗顶端叶盘 （0.5cm0.5cm） 作为转化受体， 在预培养培养基中 预培养 2 3d， 然后浸入备好的农杆菌菌液 （OD 为 0.5 0.6） 中感染 8min， 用滤纸吸干叶 盘表面的菌液后再接种到共培养基上黑暗中。

35、培养 3d， 然后转入筛选培养基上继代培养 3 4 代， 两周继代一次， 逐渐降低筛选压， 等分化出的抗性芽长至 2 3cm 时， 将抗性芽转入生 根筛选培养基上进行筛选， 初步获得抗性植株， 抗性植株生根筛选后得到的抗性苗 （图 3） 。 0077 CmbHLH1 基因表达量鉴定及离子吸收能力评价 0078 待抗性芽成为幼苗后， 选取幼嫩叶片提取总 RNA 并反转录为 cDNA。根据 CmbHLH1 基因的 cDNA 全长序列设计引物实时定量分析引物 CmbHLH1RTF 和 CmbHLH1RTR。引 物序列分别如下 ： 0079 CmbHLH1RTF: 5 GCCAAACAATGGGCAA。

36、TA 3（SEQ ID NO.8） 0080 CmbHLH1RTR: 5 TACAGGAGGGCGAAGCA 3（SEQ ID NO.9） 0081 按照荧光定量试剂盒 （ Green Realtime PCR Master MixPlus(QPK 212)说明书建立25l反应体系 ： Green Realtime PCR Master Mix Plus 12.5l， Plus Solution 2.5l， CmbHLH1RTF(10M)1.0l， CmbHLH1RTR(10M)1.0l， cDNA1.0l， ddH2O7.0l。将 PCR 管置于 Rotor Gene3000PCR 仪的 3。

37、6 孔转轮中， 按照以下 反应程序进行 PCR 反应 ： 95 C1min ； 95 C15s， 55 C15s， 72 C40s， 40 个循环。每个样 品重复 3 次， 根据数据分析得到各个样品的 CT 值， 以 0h 时未处理的根中的表达为基准值， 通过公式相对表达量 =2 CT计算不同处理时间点的基因相对表达情况， 其中 ： 说 明 书 CN 103146712 A 7 6/6 页 8 0082 CT=(CT,TargetCT,GAPDH)Time x(CT,TargetCT,GAPDH)Time0。 0083 基因表达量分析鉴定表明转正义载体表达株系的表达量最高约为野生型的 2 倍，。

38、 转反义载体表达株系的表达量最低约为野生型的 1/3（图 4） 。 0084 以非转基因 神马 为对照， 对野生型 CmbHLH1 基因表达量差异较大的 4 个转基 因株系在 MS 培养基上扩繁。待生根后， 将小苗取出并水培一天以使幼苗适应。将每个株 系的小苗平均分为两组以进行缺铁离子胁迫。将小苗放入出去铁离子并加入铁离子螯合 剂菲洛嗪的 MS 培养液中经行水培并以 MS 完全培养液为对照。处理 3 天后， 分别对各组根 部取样， 经过硝解后用 Optimal2100DV 电感耦合等离子体发射光谱仪 （Perkin Elmer） 进行 金属离子的含量变化， 尤其是铁离子的含量变化， 发现转正义。

39、基因菊花 神马 (35S:(+) CmbHLH1 1， 35S:(+)CmbHLH1 2) 中根部铁离子的含量明显高于非转基因株系与低表达该 基因的株系 （图 5） 。 0085 综 上 所 述， 本 发 明 构 建 了 含 有 bHLH 转 录 因 子 CmbHLH1 的 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA1301(+/)CmbHLH1， 其中 CmbHLH1 为首次报道。所构建的载体可导入菊花中， 提高菊花对铁离子的吸收。 说 明 书 CN 103146712 A 8 1/4 页 9 0001 序 列 表 CN 103146712 A 9 2/4 页 10 0002 0003 序 列 表 CN 103146712 A 10 3/4 页 11 0004 序 列 表 CN 103146712 A 11 4/4 页 12 序 列 表 CN 103146712 A 12 1/3 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146712 A 13 2/3 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103146712 A 14 3/3 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 103146712 A 15 。