一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103159838 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103159838 A *CN103159838A* (21)申请号 201210537351.7 (22)申请日 2012.12.12 201110415270.5 2011.12.13 CN C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园。

2、西路 2 号 (72)发明人 左元梅 熊宏春 笕雄介 西泽直子 张福锁 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与 应用 (57) 摘要 本发明提供了一种花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 及其编码基因。该花生铁螯合物转运蛋白 基因序列如SEQ ID No.2所示， 其编码蛋白的氨基 酸序列如 SEQ ID No.1 所示。本发明还公开了编 码上述蛋白对不同铁螯合物的转运能力以及在转 录水平该基因表达对铁的响应， 同时， 本发明证明 了该蛋白定位在细胞质膜上， 为揭示铁在植物体 内转运提供。

3、重要的理论基础。运用本发明 AhYSL2 花生铁螯合物转运蛋白将为获得铁高效利用作物 提供必要的技术支撑。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103159838 A CN 103159838 A *CN103159838A* 1/1 页 2 1. 一种花生铁螯合物转运蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示， 或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功。

4、能的氨基酸序列。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的载体。 5. 含有权利要求 4 所述载体的宿主。 6. 权利要求 2 或 3 所述的基因在提高植物铁利用率中的应用。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其中所述的植物为豆科植物。 8. 如权利要求 7 所述的应用， 其中所述的植物为花生。 权 利 要 求 书 CN 103159838 A 2 1/8 页 3 一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学、 。

5、植物生理学以及基因工程等领域， 具体地说， 涉及一种花 生中铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。 背景技术 0002 铁是植物生长发育所必需的微量元素之一， 植物光合作用、 呼吸作用等重要的代 谢过程都离不开铁元素， 植物缺铁会严重抑制植物的生长发育， 导致产量和品质下降。 尽管 铁元素在土壤中的含量较高， 在有氧环境中铁的溶解性却很低 (Yi 等 ,1994)， 不易被植物 吸收利用， 在石灰性土壤上很多植物面临着缺铁胁迫。因此促进植物对铁的吸收转运效率 从而提高作物的耐低铁胁迫能力具有重要的实践意义。 0003 植物在长期进化过程中对于低铁胁迫形成了机理和机理 II 两种不同的适应性 反应。

6、机制 (Romheld 等 ,1986)。双子叶和非禾本科单子叶植物属于机理植物。此类植 物在缺铁时主要的生理反应表现为根系伸长受阻， 根尖部分直径增加， 并产生根毛， 根部形 态发生变化， Fe3+ 还原酶的活性增加， 受 ATP 酶控制的质子分泌增加， 使根际 pH 降低， 提 高铁的有效性。而禾本科单子叶植物为机理植物， 它们在缺铁时无机理植物的明显的 根形态上的变化， 而是根系中植物铁载体的合成和分泌量增加。随着分子生物学技术的飞 速发展， 植物吸收利用铁的关键基因也逐渐研究清楚。机理植物以模式植物拟南芥研 究得相对清楚， 缺铁时通过根表皮细胞质膜上铁还原酶基因 AtFRO2 将三价铁。

7、还原成二价 铁 （Yi 等 ,1996） ， 然后通过根细胞质膜上的二价铁转运蛋白 AtIRT1 将二价铁转运到根细 胞内供植物吸收利用 (Vert 等 ,2002)。而机理植物在缺铁条件下主要通过体内合成并 分泌麦根酸类植物铁载体， 到目前为止麦根酸合成途径中相关基因都已得到研究确定， 禾 本科植物根系分泌的麦根酸将根际中难溶性铁螯合， 再通过细胞质膜上的 YS1 转运蛋白将 麦根酸铁螯合物转运到根细胞内。YS1 转运蛋白首次在玉米中分离得到， 因该基因缺失后 玉米叶片表现为黄色条纹 (yellow stripe) 表型命名而来。研究者们通过酵母功能互补 试验确定了 ZmYS1 基因对麦根酸。

8、铁螯合物的转运能力 (Curie 等 ,2001)。此外研究发现 在大麦中 HvYS1(Murata 等 ,2006) 及水稻中 OsYSL15(Inoue 等 ,2009;Lee 等 ,2009) 也参 与从根际土壤中吸收转运麦根酸铁供植物吸收利用。尽管机理植物中不存在麦根酸， 同 样也存在 YSL(yellow stripe like) 同源基因。NA( 尼克烟酰胺 ) 为麦根酸类植物铁载 体合成的前体， 通常与二价金属离子结合形成稳定的复合物在植物体内转运。NA-Fe(II) 是铁在植物体内转运的主要方式之一。机理植物 YSL 基因主要负责 NA 与金属离子螯 合物的转运。目前已有的研究。

9、表明在模式植物拟南芥中存在 8 个 YSL 基因。AtYSL1 对于 Fe-NA 向籽粒中的运输起到了很重要的作用 （Jean 等 ,2005） 。通过对 AtYSL1AtYSL3 双突 变体的研究表明 AtYSL1AtYSL3 对于植物生长及发育过程中铁的平衡都起到了重要的作用 （Waters等,2006） 。 AtYSL2对Fe(II)-NA、 Fe(II)-PS及Cu(II)-NA具有转运作用 （DiDonato 等 ,2004） 。此外， Gendre 等人对于超累积植物天蓝遏蓝菜中存在的 YSL 同源基因进行了一 些研究。他们在天蓝遏蓝菜中找到了三个 YSL 同源基因， 根据分别与拟。

10、南芥中 YSL 基因的 说 明 书 CN 103159838 A 3 2/8 页 4 同源性高低而命名为 TcYSL3、 TcYSL5、 TcYSL7。研究表明 TcYSL7 主要在植物的花中表达， TcYSL5 主要在叶片中表达， 而 TcYSL3 在各器官中表达量都比较均一。进一步通过酵母功 能互补实验发现， 其中只有 TcYSL3 对于 Fe(II)-NA 以及 Ni(II)-NA 复合物具有运输作用 （Gendre 等 ,2007） 。 0004 YSL 基因家族在机理植物及机理植物中广泛存在， 这些基因不但对于铁在土 壤中的吸收运输起到很重要的作用， 而且有的也负责了铁向地上部及籽粒。

11、中的运输， 对于 植物体内铁营养平衡起到了至关重要的作用。花生是重要的油料作物， 但是在我国北方石 灰性土壤上花生缺铁黄化成为限制其产量和品质的重要因子 （Zuo 等 ,2000） 。对于花生铁 螯合物转运蛋白 AhYSL2 基因的获得与研究将为从分子育种或基因工程培育耐低铁胁迫花 生品种提供重要的理论基础， 具有深远的指导及实践意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种花生铁螯合物转运蛋白及其编码基因与应用。 0006 为了实现本发明目的， 本发明的一种花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2， 其氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示， 或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成。

12、的具有同等功 能的氨基酸序列。 0007 本发明从豆科植物花生中分离到铁螯合物转运蛋白基因 AhYSL2， 核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示， 共有 3066bp， 包括 5 端非编码区， 一个完整的开放阅读框和包含 ployA 尾巴的 3 端非编码区， 表明是完整的核苷酸编码序列， SEQ ID No.2 所述序列自 5 端第 785-2806 碱基为该基因的编码区， 编码了 SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列， 该 AhYSL2 蛋白 由 674 个氨基酸组成， 具有 12 个跨膜区域。 0008 本发明还提供了含有编码前述花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 基因或其片段的。

13、载 体及含有该载体的宿主。 0009 本发明进一步提供编码前述花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 的基因在提高植物铁 利用率， 从而提高植物耐低铁胁迫能力中的应用。 0010 本发明提供的 AhYSL2 基因在花生的根系、 新叶及老叶中都有表达， 且在叶片中的 表达量相对较高。在花生根系及新叶中 AhYSL2 基因表达在加铁条件下显著高于缺铁条件。 通过酵母功能互补试验， 将 AhYSL2 基因转入铁缺陷酵母突变体中， 在供给 NA-Fe(II) 的介 质中转入 AhYSL2 基因的酵母明显比转入空载体的酵母长势好， 而供给 NA-Fe(III) 时转入 AhYSL2基因的酵母也稍微比转入空载。

14、体的酵母长势好， 但不如前两者。 结果表明AhYSL2基 因对 NA-Fe(II) 具有明显的转运能力， 同时对 NA-Fe(III) 也具有一定的转运作用。此外， 对 AhYSL2 与绿色荧光蛋白 （GFP） 的融合蛋白定位研究表明 AhYSL2 基因定位在细胞质膜 上。综上表明， 本发明获得的 AhYSL2 基因是一个铁螯合物转运蛋白， 且位于细胞质膜上， 可 能对铁在植物体内的转运与分配起到重要的作用。 0011 本发明首次公开了一种花生铁螯合物转运蛋白， 并获得了编码该蛋白的基因全序 列， 同时运用分子生物学及基因工程技术证实了该花生 AhYSL2 基因在转录水平表达受供 铁水平的影响。

15、， 且是一个定位于细胞质膜上具有转运各种铁螯合物的转运蛋白， 同时基于 此研究结果， 为通过基因工程或分子育种提高植物铁利用效率和籽粒铁的富集提供了必要 的理论依据和技术支持， 具有较大的应用前景。 说 明 书 CN 103159838 A 4 3/8 页 5 附图说明 0012 图 1 为本发明花生根系 AhYSL2 基因片段扩增结果。 0013 图 2 为本发明花生根系 AhYSL2 基因的 5 RACE PCR 扩增结果。 0014 图 3 为本发明花生根系 AhYSL2 基因的 3 RACE PCR 扩增结果。 0015 图 4 为 AhYSL2 蛋白 TMHMM 跨膜区域分析。 00。

16、16 图 5 为 AhYSL2 与其它植物 YSL 基因进化树分析。 0017 图 6 为本发明酵母表达载体 pDR195-AhYSL2 的图谱。 0018 图 7 为 AhYSL2 基因在转录水平表达受铁供应水平的影响。 0019 图 8 为 AhYSL2 基因酵母功能互补试验结果。 0020 图 9 为 AhYSL2 基因洋葱表皮细胞定位结果， 其中 N 代表细胞核。 具体实施方式 0021 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0022 实施例 1 花生铁螯合物转运蛋白 。

17、AhYSL2 基因的获得 0023 1.1 水培花生的培养 0024 所用花生品种为 鲁花 14 ( 购于中国农业科学院 )， 将花生种子用 10% 双氧水 消毒 20-30 分钟后， 清洗置于饱和硫酸钙溶液中通气 8 小时， 然后置于铺有吸水纸的托盘 中并盖好避光于人工培养室中。培养室设置条件为光照 14 小时 30， 黑暗 10 小时 22。 1-2 天左右花生发芽后移入石英砂中培养， 待长出 1-2 片叶子后转入水培营养液中培养。 水培营养液配方如下 ： KH2PO4(0.5mM)、 K2SO4（0.75mM)、 KCl(0.1mM)、 MgSO4.7H2O(0.65mM)、 CaSO4。

18、.2H2O(2mM)、 H3BO3(1M） 、 MnSO4.4H2O(1M） 、 ZnSO4.7H2O(1M)、 CuSO4.5H2O(0.1M)、 (NH4)6Mo7O24.4H2O(0.005M)、 EDTA-Fe(80M)， pH 为 5.86。正常培养一周后缺铁处理约 一周取花生根系， 迅速放入液氮中， 并于 -80冰箱保存备用。 0025 1.2 花生总 RNA 提取 0026 将保存于 -80冰箱的花生根系样品放入已经用液氮预冷的研钵中， 迅速加入液 氮研磨植物样品直至成粉末状， 取出约 0.1 克粉末样品于 1.5l 无 RNase 离心管中， 加入 1mlRNA 提取液 Tri。

19、zol（购自 Invitrogen） ， 立即涡旋震荡 15 秒， 使核蛋白充分解离， 室温 静置 5 分钟， 加入 200l 氯仿， 充分混匀， 静置 5 分钟， 放入事先已经预冷到 4的离心机 中以 12000g 的速度离心 15 分钟， 取上清液入新的 1.5ml 的离心管中， 加入 500l 异丙 醇， 上下颠倒充分混匀， 室温放置10分钟， 然后412000g离心10分钟， 取出后倒掉上清 液， 加入 1ml75% 的乙醇， 4 7500g 离心 5 分钟， 重复洗涤两次， 取出后倒掉乙醇， 并吸出 所有上清液后置于超净台中室温下风干。 加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂后放于-2。

20、0 或 -80冰箱中贮存备用。 0027 1.3RT-PCR 获得 YSL 基因 cDNA 序列 0028 取已提好的花生根系 RNA 样品约 2g， 利用 invitrogen 公司的 Super Script 逆转录酶试剂盒， 以 Oligo （dT） 15为引物， 42反应 1.5 小时进行 cDNA 第一条链的合成， 根 据拟南芥等其它已知的 YSL 基因序列比对结果， 选择保守性区域设计引物， 以得到的 cDNA 说 明 书 CN 103159838 A 5 4/8 页 6 第一条链为模板扩增花生 YSL 基因片段， 设计的正反向引物分别为 ： 0029 AhYSL-1F 5- AT。

21、GAACATGGCTTACAACTA-3 0030 AhYSL-1R 5- GTCTTGAAATCATGCATCA-3 0031 PCR 反应体系为 ： 反转后的根系 cDNA 稀释 5 倍后用 2l， 10 反应缓冲液 2l， dNTPs(10mM)0.5l， MgCl2（50mM） 0.5l， 正向引物 Ahnramp-F（0.01mM） 0.5l， 反向引 物 Ahnramp-R（0.01mM） 0.5l， ddH2O 13.7l， Taq DNA 聚合酶 （TIANGEN 公司） 0.3l. 将上述混合后进行 PCR 反应。PCR 反应程序为 ： 94预变性 3min ； 94变性 3。

22、0s ； 55退火 30s ； 72延伸30s ； 30个循环 ； 72延伸10min。 PCR反应后琼脂糖凝胶电泳得到152bp DNA 条带 （图 1） ， 进行胶回收纯化， 然后将回收得到的 DNA 连接到 pMD20-T 载体 （TaKaRa 公司） ， 16过夜反应， 再转化到大肠杆菌 DH5 感受态细胞 （TIANGEN 公司） ， 涂于含 Amp 抗生素的 LB板后37过夜培养， 挑单克隆于LB液体37过夜摇菌， 菌落PCR确定条带正确后送菌液 测序 （上海生物工程公司） ， 得到 AhYSL2 片段序列。 0032 用测序得到的 AhYSL2 片段序列设计引物， 通过 Clon。

23、etech 公司 RACE 试剂盒 (SMARTTM RACE cDNA 扩增试剂盒 ) 进行 PCR 反应， 分别克隆测序得到 AhYSL2 基因 5 及 3 端 （方法参见所述试剂盒说明书） 。 0033 5 端克隆引物为 ： 0034 AhYSL2-5 -GSP 5- TCCCAGTGCCGATTGCTTGGCTTAG-3 0035 3 端克隆引物为 ： 0036 AhYSL2-3 -GSP 5- TGACGGTGTCGTTGCAGGGCTTGT-3 0037 扩增分别得到 2325bp 的 5 端序列 （图 2） 和 893bp 的 3 端序列 （图 3） ， 再将所得 到的序列拼接得。

24、到理论全长序列。利用拼接的理论全长序列， 设计扩增该基因编码区全长 的引物， 如下 ： 0038 AhYSL2-F 5- GAATTAAGCGGTGAGGATTTGAT-3 0039 AhYSL2-R 5- GGGAGATTCTGAAATACTACTTGGA-3 0040 应用高保真 DNA 聚合酶 （Invitrogen 公司）进行 PCR 反应， 切胶回收后连接到 pMD20-T 载体 （TaKaRa公司） ， 然后转化获得正确的克隆进行测序。 经测序最终确定， AhYSL2 核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示。利用 DNAman 软件翻译得到其编码的氨基酸序列， 如 SEQ ID。

25、 No.1所示。 应用TMHMM跨膜区域分析软件 （http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 对 AhYSL2 转运蛋白序列进行分析表明该 AhYSL2 蛋白具有 12 个跨膜区域 （图 4） 。通过 NCBI 数据库 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/） 查找其它植物 YSL 基因家族蛋白序列， 应用 BioEdit 分析软件构建基因进化树， 表明该 AhYSL2 基因与拟南芥 AtYSL3 基因比较接近 （图 5） 。 0041 实施例 2 花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 基因表达对铁的响应 0042 1.1 样品准备 0043 。

26、水培培养花生， 在正常条件下培养约一周后转入缺铁的营养液中培养， 同时设置 正常供铁作为对照。处理 4、 7、 11 天后分别取根系、 新叶及老叶样品， 然后提取花生根系 及叶片 RNA， 利用 DNase 消化去除可能污染的基因组 DNA， 然后进行反转录， 通过相对定量 RT-PCR 方法， 利用 Ahubiquitin 基因作为内参基因， 分析 AhYSL2 基因在缺铁条件下其转录 水平表达量的变化。 说 明 书 CN 103159838 A 6 5/8 页 7 0044 1.2 相对定量 RT-PCR 0045 在制备标准曲线时， 首先需要分别含有 AhYSL2 基因及内参基因 Ahu。

27、biquitin 基 因的质粒。构建过程如下 ： 首先用 KOD-plus DNA 聚合酶 （购自 TOYOBO）进行 PCR 反应。 反应体系为 KOD-plus DNA 聚合酶 0.4l， 10KOD-plus 缓冲液 2l， 2mM dNTPs 2l， 25mMMgSO40.8l， 正反向引物 10M 各 0.6l， 花生根系 cDNA 1l， 最后用灭菌水补足到 20l体系。 PCR反应程序为942min， 9415s， 5530s， 6830s， 30个循环， 7210min。 PCR反应后电泳检测， 鉴定得到单一条带且条带大小无误后利用Zero Blunt Topo PCR克隆 试。

28、剂盒 （购自Invitrogen公司） ， 将剩下的PCR产物取1l， 加0.5l盐溶液， 1l灭菌水， 及 0.5LPCR Blunt TOPO 载体， 室温连接约 30 分钟， 然后将 3l 连接反应液加到 Topo10 感受态细胞中 （购自 Invitrogen 公司） 进行转化， 冰上放置 30 分钟左右， 然后 42水浴放 置约45秒， 迅速放到冰上， 3分钟后加200l LB， 置于37摇床摇1小时， 然后把该菌液涂 到含有卡那霉素 （Kanamycin） 的 LB 平板上， 37培养箱过夜培养约 13-15 小时后， 可见单 一的小菌落， 挑单菌落于 2ml LB 培养基中在 3。

29、7摇床摇 12 小时左右， 提取质粒， 进一步测 序鉴定分析， 保证所有碱基序列无误后选择该质粒待用。 0046 把构建好的分别含有 AhYSL2 基因及内参基因 Ahubiquitin 基因的质粒稀释成 不同的浓度梯度， 使拷贝数分别为 103， 104， 105， 106， 107， 分别以此为模板 1l 作标准曲线 时用， 同时用花生的根系及叶片样品 RNA 反转录后的 cDNA 稀释 5 倍加 2l 为模板， 反应 体系为 TaKaRa SYBR Green premix 6.25l， ROX Reference Dye 0.25l， 正向反向引 物各 0.2mol， 然后以灭菌水补足。

30、到 12.5l 体系， 应用 Applied Biosystems StepOne PlusTMRT-PCR系统进行PCR反应。 PCR反应程序为95预变性2min30s;95变性15s;58 退火30s;72延伸30s， 同时收集荧光 ； 40个循环 ； 溶解曲线9515s， 601min， 9515s。 PCR 后仪器将自动通过用质粒作为模板所做的标准曲线得出在不同模板条件下 AhYSL2 基 因及内参基因 Ahubiquitin 基因的拷贝数。最后通过计算用 AhYSL2 基因拷贝数 / 内参基 因 Ahubiquitin 基因的拷贝数得到 AhYSL2 基因在不同处理下的相对表达值。结。

31、果如图 7 所示。结果表明该花生 AhYSL2 基因的表达在缺铁处理 4、 7、 11 天时都显著低于加铁条件下 的表达， 在新叶中缺铁处理 7、 11 天时其表达量也都低于加铁条件， 但在老叶中的表达趋势 与根系及新叶中不一致， 在缺铁 7 天时加铁与缺铁条件对其表达量没有影响， 在缺铁 11 天 时其表达量却在缺铁处理下显著高于正常供铁条件。 0047 相对定量 RT-PCR 引物内参基因 Ahubiquitin 基因引物参照文献 Luo 等 ,2004， AhYSL2基因引物通过引物设计软件primer premier5.0及结合oligo6软件设计获得， 引物 为 ： 0048 QYS。

32、L2-F 5 -AGCCGCAGATTGAGGGTGAG-3 0049 QYSL2-R 5 -CCGAGTGAAAGGTGTTGAAATAATA-3 0050 实施例 3 花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 基因酵母功能互补 0051 1.1 酵母功能互补载体构建 0052 在 AhYSL2 基因序列编码区两端设计引物， 包括起始密码子与终止密码子， 并在正 反向引物 5 端分别加上酶切位点 NotI 和 BamHI， 引物为 ： 0053 NotI-YSL-F 5 -TGCGGCCGCATGAATCCAATGGAAATC-3 0054 BamHI-YSL-R 5 -CCGCGGATCCCTA。

33、CTTGGATGTAAAGAAGCT-3 说 明 书 CN 103159838 A 7 6/8 页 8 0055 用 KOD-plus DNA 聚合酶 PCR 扩增加酶切位点 AhYSL2 基因全长， PCR 反应体系为 10KOD-plus 缓冲液 2l， 2mM dNTPs 2l， 25mM MgSO40.8l， 正向反向引物分别 10M 0.6l， 花生根系 cDNA0.5l， KOD-plus DNA 聚合酶 0.4l， 加灭菌水至 20l 体系。PCR 反应程序为 94 2min ； 94 15s， 60 30s， 68 2min， 共 30 个循环 ； 72 10min。PCR 反。

34、 应后电泳检测鉴定条带大小正确后， 取 1lPCR 产物， 利用 Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit 进行连接反应， 然后转化涂板， 提取质粒， 测序确定该质粒序列无误 （具体同前） 。将构 建好的质粒用 NotI 和 BamHI 进行酶切， 双酶切体系为 ： 质粒 20l， 缓冲液 M 5l， NotI 和 BamHI 酶各 2l， 灭菌水 21l 以补足到 50l 体系。并同时酶切载体质粒 PDR195， 体系同 上， 电泳并切胶回收双酶切后含有 AhYSL2 全长的目的条带。 0056 将酶切后的空载体质粒 PDR195 进行碱性磷酸酶处理， 体系为 45l 。

35、酶切后质粒， 5l H缓冲液， 1l碱性磷酸酶 （购自NEB， New England Biolabs） ， 49l灭菌水， 37放置 1 小时。然后用苯酚氯仿异戊醇抽提， 无水乙醇沉淀及 70% 乙醇洗涤， 干燥沉淀后用 20l 的灭菌双蒸水溶解。随后用 Takara ligation Kit Mix 连接酶切去磷酸化处理后的载体 PDR195 和酶切切胶回收后的全长目的条带。连接反应体系为 pDR195 载体 0.5l， AhYSL2 切胶回收产物 4l， ligation Kit solution 4.5l， 连接反应过夜。然后转化到大肠杆 菌， 提取质粒， 酶切鉴定， 测序确定序列的正。

36、确性， 获得 PDR195-AhYSL2 载体质粒 （图 6） 。 0057 1.2 酵母转化 0058 主要试剂配制 0059 10TE ： 0.1M Tris,10mM EDTA 调节 PH 至 7.5， 121高压灭菌 20min。 0060 10LiAc ： 即 1M 醋酸锂， 称取 10.2g 醋酸锂加适量高纯水溶解， 用冰醋酸调节 PH 值到 7.5， 定容到 100ml， 121高压灭菌 20min。 0061 50%PEG ： 50g PEG 加水定容到 100ml， 120高压灭菌 20min。 0062 YPD 培养基 ： 20g 蛋白胨、 10g 酵母提取物、 20g 葡。

37、萄糖， 加水定容到 1L， 调节 PH 为 4.7。 0063 SD 平板 （1L） ： (NH4)2SO4 5g、 MgSO4 500mg、 NaCl 500mg、 CaCl2 500mg、 KH2PO4 850mg、 K2HPO4 150mg、 H3BO3 500g、 CuSO4 40g、 KI 100g、 FeCl3 200g、 MnSO4 400g、 Na6Mo7O24 200g、 ZnSO4 400g、 生物素 20g、 泛酸 2mg、 叶酸 2g、 肌醇 10mg、 烟酸 400g、 对氨基苯酸 200g、 维生素 B6400g、 核黄素 200g、 维生素 B1400g、 色氨酸。

38、 20mg、 亮氨酸100mg、 组氨酸20mg、 葡萄糖20g、 琼脂粉20g， 加水定容至1L， 121高压灭菌后 倒约 30 个平板。 0064 将高亲和力及低亲和力铁转运基因 fet3、 fet4 缺失的酵母突变体菌株 DEY1453 接种少量加入 4ml YPD， pH 为 4.7 的培养液中， 30摇 16-18 小时至饱和， 测定 OD600 值， 再用三角瓶装 50mlYPD 中加适量该菌液使 OD600 值调节至 0.2-0.3， 30摇 3-4 小时使 OD600 约为 0.4-0.6， 把得到的菌液 1000g 5min 25离心， 去上清加 8ml TE， 混匀后 10。

39、00g 5min 25离心， 去上清后在沉淀的菌中加入 1200l 灭菌水、 150l 10TE 及 150l 10LiAc， 震荡数秒使菌株悬浮起来。取 PDR195， PDR195-AhYSL2 载体质粒分别 10l 加入 80l灭菌水和10l已经过煮沸处理的鲑鱼精DNA， 然后加入前述已处理好的酵母突变株 菌悬浮液 100l， 震荡混匀， 加 480l 50% PEG、 60l 10TE 及 60l 10LiAc 后 30 摇 30min， 再加 70ul 二甲基亚砜温和混匀， 42水浴 15min， 冰上放置 90s， 短暂离心后去上 说 明 书 CN 103159838 A 8 7/。

40、8 页 9 清， 加 200l 灭菌双蒸水并轻轻混匀。取 100l 涂于加铁的 SD 平板上。约 2 天左右长出 菌落。 0065 1.3 功能互补试验 0066 含 Fe(II)-NA 及 Fe( )-NA 的 SD 平板配制 ： 先分别配制 1ml10mM 硫酸亚铁、 1ml 10mM FeCl3及 1ml 30mM 烟酰胺溶液， 取 30l10mM 的 FeSO4溶液和 15l 30mM 烟酰胺溶 液混合 （配成 Fe(II)-NA 溶液） ， 30l10mM FeCl3溶液和 15l 30mM 烟酰胺溶液混合 （配成 Fe( )-NA 溶液） ， 常温放置 4 小时左右后用 0.2m 。

41、过滤离心管 13500rpm 离心 10 分钟， 配 制缺铁的 SD 平板液 （同前） 30ml 并将 PH 调制 7.0 后高压灭菌， 分成 15ml 两份然后待灭菌 后溶液温度降至 60左右分别加入离心后的 Fe(II)-NA 及 Fe( )-NA 溶液。倒板冷却。 0067 挑单菌落 30过夜摇菌后， 测定 OD600 值， 再用三角瓶装的 20mlYPD 将 OD600 值 调节稀释为 0.2， 接着摇 4 小时左右， 测定 OD 值， 分别取 1ml 菌液离心 30s， 去上清， 加 1ml 10TE 涡旋混匀， 离心 30s， 去上清， 重复 2 遍后加 1ml 灭菌水重复洗 2 。

42、遍， 最后加 300ul 灭 菌水涡旋混匀， 测定OD600值， 用灭菌水将OD600值稀释调节为1， 然后依次稀释10倍， 得到 OD600值分别为1， 10-1， 10-2， 10-3浓度梯度的菌液， 然后分别将该菌液依次点5l于配制好 的Fe(II)-NA及Fe()-NA SD平板， 放置30培养室培养3-4天左右， 比较酵母的生长状 况。 0068 结果表明 （图 8） ， 转入 AhYSL2 基因的酵母在提供 Fe(II)-NA 铁的平板上明显比转 入空载体的酵母长势好， 而在提供 Fe( )-NA 时转入 AhYSL2 基因的酵母也稍比转入空载 体的酵母长势好， 但没有在提供 Fe。

43、(II)-NA 时差异明显， 在对照中提供 FeCl3（非螯合态铁） 转入空载体与转入含该转基因载体的酵母生长一致。说明该 AhYSL2 转运蛋白对螯合态铁 Fe(II)-NA 具有明显的转运作用， 对 Fe( )-NA 也有一定的转运作用。 0069 实施例 4 花生铁螯合物转运蛋白 AhYSL2 基因洋葱表皮亚细胞定位 0070 1.1 载体构建 0071 首先 PCR 获得含 AhYSL2 基因编码区 （不包含终止子） 全长的序列， 所用引物为 ： 0072 GAhYSL2-F 5 -CACCATGAATCCAATGGAAATC-3 0073 GAhYSL2-R 5 -CTTGGATGT。

44、AAAGAAGCTCATG-3 0074 用 KOD-plus DNA 聚合酶进行 PCR 反应， 具体方法同前， 然后取 0.5l PCR 产物 用 pENTRTM Directionalcloning kit（购自 Invitrogen 公司） 将 AhYSL2 基因克 隆到 pENTRTM载体。取克隆得到的载体质粒 2l， GFP 载体质粒 pH7FWG2(Karimi 等 .,2002)1l 及 1TE 缓冲液 (pH8.0)5l 进行 Gateway 反应 （试剂盒购自 Invitrogen 公司） ， 具体为将 2l LR ClonaseTM酶加入以上混合的载体质粒中， 混匀后简单。

45、离心， 25放置 1 小时， 加 1l 蛋白酶 K 溶液 37放置 10min 终止反应。然后转化到大肠杆菌， 获得 AhYSL2-pH7FWG2 载体质粒， 酶切鉴定后测序确定序列准确无误备用。 0075 1.2 洋葱表皮细胞定位 0076 用 QIAGEN 试剂盒 （www.qiagen.com） 提取高纯度且高浓度的 AhYSL2-pH7FWG2 载 体质粒 （浓度约 1g/l） ， 然后将准备好的质粒 1g 进行金粉包裹处理， 加 10l 金粉， 10l 2.5M CaCl2及4l 0.1M亚精胺并充分涡旋混匀。 同时做对照处理空载体质粒。 利用 Biolistic PDS-1000/。

46、He Particle Delivery System(Bio-Rad,东京,日本)， 将处理好的 载体转入洋葱表皮细胞中， 28避光孵育 4 小时左右后用激光共聚焦显微镜 (LSM510,Karl 说 明 书 CN 103159838 A 9 8/8 页 10 Zeiss) 观察表达的 GFP 荧光。 0077 结果如图9所示， 绿色荧光绕过细胞核表明该AhYSL2基因定位于洋葱表皮细胞细 胞质膜上。 0078 AhYSL2 基因为烟酰胺铁转运蛋白， 烟酰胺铁在铁的地上部分转运过程中发挥了重 要的作用， 通过转基因技术将该基因过表达到豆科植物中， 可促进铁向地上部分的转移或 向籽粒中的转移，。

47、 从而提高豆科植物的铁利用效率。 0079 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103159838 A 10 1/7 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103159838 A 11 2/7 页 12 0003 序 列 表 CN 103159838 A 12 3/7 页 13 0004 序 列 表 CN 103159838 A 13 4/7 页 14 000。

48、5 序 列 表 CN 103159838 A 14 5/7 页 15 0006 序 列 表 CN 103159838 A 15 6/7 页 16 0007 序 列 表 CN 103159838 A 16 7/7 页 17 序 列 表 CN 103159838 A 17 1/4 页 18 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103159838 A 18 2/4 页 19 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103159838 A 19 3/4 页 20 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103159838 A 20 4/4 页 21 图 9 说 明 书 附 图 CN 103159838 A 21 。