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1、(10)申请公布号 CN 102462688 A (43)申请公布日 2012.05.23 CN 102462688 A *CN102462688A* (21)申请号 201010530639.2 (22)申请日 2010.11.04 A61K 31/704(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 5/30(2006.01) A23L 1/30(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二炮兵总医院 地址 100088 北京市西城区新街口外大街 16 号 (72)发明人 刘丽宏 雷宁 蓝苑元 张晓菲 罗恋 王玲 李超 吴诚。
2、 (54) 发明名称 木通皂苷 D 在制备治疗与预防脂肪肝及其相 关疾病的药物中的应用 (57) 摘要 本发明的目的在于提供木通皂苷 D 的一种新 应用， 尤其是以木通皂苷 D 为活性成分， 制备用于 治疗和预防脂肪肝及其相关疾病的药物和 / 或保 健品。其中所涉及的脂肪肝包括酒精性与非酒精 性脂肪肝， 以及雌激素水平下降引起脂肪肝和高 脂血症 ； 所涉及的相关疾病脂肪肝并有脂质代谢 紊乱、 激素水平失调， 脂肪肝并有血脂异常， 以及 脂肪性肝炎、 肝硬化等症。本发明通过药理、 药效 及其毒理研究证实， 以木通皂苷 D 为活性成分制 备而成的药物和 / 或保健品对治疗与预防脂肪肝 及脂肪肝并有。
3、高脂血症、 糖尿病等相关的疾病具 有显著的作用效果， 并且毒性极小。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 1/1 页 2 1. 木通皂苷 D 在制备治疗与预防酒精性脂肪肝、 单纯性脂肪肝及其相关疾病的药物和 / 或保健品中的应用。 2.木通皂苷D在制备治疗与预防雌激素水平下降引起的脂肪肝及高脂血症的药物和/ 或保健品中的应用。 3. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述相关疾病包括脂肪肝并有脂质代谢紊 乱、 激素水平失调， 脂肪肝并有血脂异常， 以及脂肪性肝。
4、炎、 肝硬化等。 4. 如权利要求 1、 2、 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述药物含有在药学上可接受的组分 和 / 或载体。 5. 如权利要求 1、 2、 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述药物为口服制剂、 胃肠外给药制剂 或外用制剂。 6. 如权利要求 1、 2、 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述药物和 / 或保健品的活性成分为 木通皂苷 D。 权 利 要 求 书 CN 102462688 A 2 1/11 页 3 木通皂苷 D 在制备治疗与预防脂肪肝及其相关疾病的药物 中的应用 技术领域 0001 本发明涉及木通皂苷 D 的新应用， 尤其是在制备治疗和预防脂肪肝及脂肪肝并。
5、有 高脂血症等相关疾病的药物和 / 或保健品中的应用。 背景技术 0002 脂肪性肝病 (fatty liver disease， FLD)， 简称脂肪肝， 是指多种因素导致的肝脏 脂肪代谢障碍， 脂类物质的动态平衡失调， 致使肝细胞内脂肪蓄积过多， 肝脏发生弥漫性脂 肪浸润 ( 脂肪变性 ) 及一系列病理生理变化的一种临床病理综合征， 其包括酒精性脂肪肝 和非酒精性脂肪肝。脂肪肝是当今社会人群中的一种多发的、 常见的生活方式病， 近年来， 国内外脂肪肝的患病率逐渐上升， 并呈现低龄化趋势， 经流行病学普查统计显示， 脂肪肝的 患病率约为 10， 其中 50以上的肥胖人群及糖尿病患者合并患有脂。
6、肪肝。我国肝病研究 专家指出， 中国脂肪肝患者约 1.2 亿， 超过乙肝患者 0.93 亿， 从而成为中国第一大肝病， 其 中城市人口约 25患有脂肪肝， 且女性比男性患病率高， 儿童患脂肪肝的比率亦约 10， 皆高出农村近 1 倍。此外， 慢性嗜酒者近 60发生脂肪肝， 20 30最终将发展为肝硬 化， 而非酒精性脂肪肝发生肝纤维化的发病率为25。 可以预测， 未来脂肪肝将成为国内外 肝病防治的主要对象， 因此研究与开发防治脂肪肝的新药是非常迫切、 必要的。 0003 脂肪肝按病理变化的进展程度分为单纯性脂肪肝、 脂肪性肝炎、 脂肪性肝纤维化、 脂肪性肝硬化四个阶段。脂肪肝是由各种原因引起肝。
7、细胞内脂肪堆积过多的病变， 其形成 主要是以下几类原因 ： 1) 长期饮酒会严重损害肝脏， 因为酒精对肝细胞的毒性使肝细胞对 脂肪酸的分解和代谢发生障碍， 引起肝内脂肪沉积而造成脂肪肝， 饮酒越多， 脂肪肝也就 越严重， 还可诱发肝纤维化， 进而引起肝硬化 ； 2) 营养过剩长期摄入过多的动物脂肪、 植物 油、 蛋白质和碳水化合物， 这些食物在体内不能被充分利用， 过剩的营养物质便转化为脂肪 储存起来， 导致肥胖、 高血脂和脂肪肝 ； 3) 长期营养不良， 缺少蛋白质和维生素， 同样可引 起营养缺乏性脂肪肝。 如因患有慢性肠道疾病、 长期厌食、 节食、 素食、 吸收不良综合征及胃 肠旁路手术等。
8、原因， 造成低蛋白血症、 缺乏胆碱、 氨基酸或驱脂物质， 从而使肝内脂肪堆积， 形成脂肪肝 ； 4) 糖尿病、 肝炎、 甲亢、 重度贫血等慢性疾病患者由于身体对葡萄糖的利用减 少， 体内脂肪酸显著增加， 使肝脏的脂肪合成亢进， 从而引起脂肪肝 ； 5) 药物性肝损害占成 人肝炎的十分之一， 脂肪肝是常见类型 ； 6) 高脂血症高胆固醇血症与脂肪肝关系密切， 其 中以高甘油三酯血症关系最为密切， 绝大多数伴有肥胖、 糖尿病和酒精中毒。 7)雌激素也参 与了肝脏中极低密度脂蛋白合成和排泄， 能将肝脏中大量合成的胆固醇转运到血液中而降 低甘油三酯在肝脏中的堆积。 雌激素水平下降或缺乏， 可以引起肝脏。
9、脂代谢紊乱， 使血脂升 高， 形成高脂血症， 进而导致肥胖、 脂肪肝、 冠心病、 高血压、 骨质疏松等一系列疾病的发生， 严重影响身体健康。 此外， 某些工业毒物、 妊娠、 遗传或精神、 心理与社会因素也与脂肪肝发 生有关系。 0004 目前， 脂肪肝的治疗有肝细胞保护剂、 降脂药物及抗氧化剂等， 如维生素 B、 C、 E、 卵 说 明 书 CN 102462688 A 3 2/11 页 4 磷脂、 熊去氧胆酸、 水飞蓟素、 肌苷、 辅酶 A、 还原型谷胱甘肽、 牛磺酸、 肝泰乐， 以及某些降脂 药物等等。然而， 胆碱仅适用于营养不良性脂肪肝。磷脂和多不饱和卵磷脂如多烯磷 脂酰胆碱， 虽可减少。
10、肝细胞的脂变， 保护和修复受损的肝细胞膜及并有的炎症和纤维化， 但 对不能戒酒者慎用。熊去氧胆酸是临床常用的治疗脂肪肝药物， 曾被认为能减少肝脏脂 肪含量， 对脂肪肝有效， 但经两年随机双盲试验并未证实其疗效。 抗氧化剂如还原型谷胱 苷肽、 水飞蓟素、 维生素 E、 牛磺酸等具有一定的降酶保肝作用， 参与肝内脂肪代谢， 减轻肝 脏炎症反应， 促进损伤的肝细胞康复， 有助于治疗脂肪肝， 并可减少诱发的肝纤维化， 但其 确切疗效有待证实。 研究表明， 植物雌激素能有效地调节去卵巢大鼠的脂质代谢， 这类药 物既有雌激素样作用又没有雌激素的副作用， 并且对肝脏有保护作用， 尽管对于这类药物 的单体成分。
11、及复方都有研究报道， 但目前尚无一个植物雌激素通过药品注册用于激素缺乏 相关的脂肪肝的治疗。另外， 天然药物和中药如胆宁片、 血脂康、 绞股蓝总甙， 以及大、 小柴 胡汤等防治脂肪肝多以调理为主， 其疗程长， 治疗效果甚微。 0005 同时治疗脂肪肝的药物还存在安全性问题， 如联苯双酯类在降低谷丙转氨酶的同 时会引起谷草转氨酶升高及黄疸， 加重肝损害。另外， 临床研究证实， 大多数降血脂药物都 有肝毒性， 可以导致肝内胆汁淤积， 引起黄疸或药物性肝损伤， 甚至导致肝硬化和肝功能衰 竭 ； 而且， 降血脂药物具有 “驱脂” 作用， 能将血液中的脂类 “驱赶” 到肝脏， 而肝脏内本来就 已有脂肪堆。
12、积， 故对大量涌来的脂类难以进行处理， 脂肪便会堆积在肝脏内， 使脂肪肝更加 严重。 0006 到目前为止， 尚无用于防治脂肪肝的有效药物， 多以中药长期调理治疗防止脂肪 肝严重恶化。因此， 研究开发安全有效的、 用于治疗和预防脂肪肝及脂肪肝并有高脂血症、 糖尿病等相关疾病的新药具有重要的创新意义和临床使用价值。 0007 木通皂苷 D 为传统中药植物续断 Dispsacus japonicus Miq. 或川续断 D.asper Wall.的主要化合物成分之一， 为三萜皂苷类成分。 目前对于木通皂苷D的研究大多基于其 雌激素样和抗氧化防治老年痴呆等作用， 用于防治妇女更年期综合征和骨质疏松。。
13、 0008 0009 木通皂苷 D 0010 目前， 尚未见续断及木通皂苷 D 在制备治疗与预防脂肪肝及其相关疾病的药物和 / 或保健品中的应用的报道。 发明内容 0011 本发明的目的在于提供木通皂苷D的新应用 ： 即以木通皂苷D为活性成分， 制备用 说 明 书 CN 102462688 A 4 3/11 页 5 于治疗和预防脂肪肝及脂肪肝并有高脂血症等相关疾病的药物和 / 或保健品。 0012 本发明提供了木通皂苷 D 在制备治疗与预防雌激素水平下降引起的脂肪肝及高 脂血症的药物和 / 或保健品中的应用。 0013 本发明提供了木通皂苷 D 在制备治疗与预防高脂血症及糖尿病并有脂肪肝的药 。
14、物和 / 或保健品中的应用。 0014 本发明提供了木通皂苷 D 在制备治疗与预防酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝的 药物和 / 或保健品中的应用。 0015 本发明提供了木通皂苷D在制备治疗与预防脂肪肝相关疾病的药物和/或保健品 中的应用， 其中相关疾病包括脂肪肝引起的脂质代谢紊乱、 激素水平失调， 脂肪肝并有血脂 异常， 以及脂肪性肝炎、 肝硬化等。 0016 本发明提供了木通皂苷 D 的提取分离纯化工艺。 0017 在本发明中， 木通皂苷 D 可制成口服制剂、 胃肠外给药制剂或外用制剂等多种剂 型的药物， 优选为注射剂和片剂。本发明涉及的各种剂型由木通皂苷 D 与药学辅料、 载体混 合制备而。
15、成。 0018 本发明通过药理、 药效及其毒理研究证实， 以木通皂苷 D 为活性成分制备而成的 药物和 / 或保健品对治疗与预防脂肪肝及其脂肪肝并有高脂血症等相关疾病具有显著的 作用效果， 并且毒性极小。 具体实施方式 0019 针对本发明所进行的药理、 药效及其毒理研究表明， 本发明对脂肪肝及脂肪肝并 有高脂血症等相关疾病的治疗和预防取得了意想不到的有益效果， 记载的药理、 药效及其 毒理实验结果如下 ： 0020 实施例 1 木通皂苷 D 的分离纯化 0021 按照提取工艺优化研究结果， 取川续断药材饮片 5.0kg， 加 70乙醇加热回流提 取两次， 提取溶媒倍量每次为生药材的 10 倍。
16、 (V/W)， 提取时间为每次 2 小时， 合并两次提取 液， 减压回收乙醇， 得木通皂苷D的转移率为93。 通过筛选实验结果， 选用AB-8大孔吸附 树脂作为粗步分离手段， 富集木通皂苷 D 的粗品， AB-8 大孔吸附树脂柱为直径 10cm 长度 65cm， 树脂用量与药材的重量比为 1 1。将上述的浓缩药液加水稀释至固含量为 8， 上 样， 分别用3个柱体积水洗涤， 2个柱体积30乙醇除杂， 最后用3个柱体积70乙醇洗脱， 收集 70乙醇洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩蒸干， 得粗品 450g ； 该粗品木通皂苷 D 的含量为 67， 转移率为 78。将上述粗品用正相硅胶柱进行分离， 收集。
17、流动相为氯仿 - 甲醇 7 3 洗脱液， 减压回收有机溶剂， 浓缩蒸干 ； 再用反相硅胶柱进行纯化， 收集流动相为甲醇 - 水 28洗脱液， 加压回收甲醇， 蒸干， 得白色粉末药物200g， 即木通皂苷D ； 用HPLC和ELSD经 归一化法测定分析， 该白色粉末药物木通皂苷 D 的含量为 98。 0022 实施例 2 木通皂苷 D 的制剂制备 0023 试验 1. 木通皂苷 D 注射剂的制备 0024 处方1 ： 木通皂苷D1000mg， 增溶剂F68为20mg， 助溶剂丙二醇60mg， 抗氧剂亚硫酸 钠 30mg。无水葡萄糖调节等渗， 缓冲盐调节 pH 值到 7， 加入重蒸水到 150mL。
18、。 0025 处方 2 ： 木通皂苷 D1000mg， 增溶剂 F68 为 25mg， HP- 环糊精 2000mg， 抗氧剂亚 说 明 书 CN 102462688 A 5 4/11 页 6 硫酸钠 50mg。取处方量 HP- 环糊精溶解在 40mL 乙醇中， 在 600r.min-1搅拌下加人木通 皂苷 D 粉末， 继续搅拌 2h， 备用 ； 取亚硫酸氢钠和 F68 加入 50mL 水溶液溶解， 搅拌下注入木 通皂苷 D 的 HP- 环糊精乙醇溶液， 直至木通皂苷 D 完全溶解， 然后置 -60下预冻， 真空 干燥， 得类白色疏松冻干粉末。 0026 试验 2. 木通皂苷 D 片剂的制备 。
19、0027 处方1.木通皂苷D10g， 羟丙基甲基纤维素3g， 淀粉2g， 乳糖1g， 乙基纤维素0.5g， PVP0.5g。取处方量木通皂苷 D、 羟丙基甲基纤维素、 乙基纤维素、 淀粉及乳糖， 分别过 80 目 筛， 混合均匀， 加入 3的 PVP 水溶液制软材， 用 20 目筛网制粒， 于 60干燥 4h， 18 目筛网 整粒后， 加入适量硬脂酸镁， 充分混匀后， 用6mm平冲压片， 片重为0.32g， 每片含木通皂苷D 0.18g。 0028 处方 2. 木通皂苷 D10g， CMC-Na0.5g， 胶化淀粉 0.5g， 微晶纤维素 2g， 90乙醇溶 液作为黏合剂， 适量硬脂酸镁作润滑。
20、剂。取处方量木通皂苷 D、 CMC-Na、 胶化淀粉、 微晶纤维 素、 分别过 80 目筛， 混合均匀， 用 90乙醇制软材， 用 20 目筛网制粒， 于 60干燥 4h， 18 目 筛网整粒后， 加入适量硬脂酸镁， 充分混匀后， 用 6mm 平冲压片， 片重为 0.32g， 每片含木通 皂苷 D 0.25g。 0029 实施例 3 木通皂苷 D 抑制脂肪细胞生长、 增殖的作用 0030 材料 ： 木通皂苷 D 含量 98 ( 第二炮兵总医院药学部制备， 批号 ： 20090926 ； 溶解 灭菌蒸馏水中， 4冷藏贮存备用， 加药时用含 10胎牛血清的 DMEM/Ham s F12 培养液稀 。
21、释到所需浓度 )。小鼠前脂肪细胞 3T3-L1( 中国医学科学院细胞中心 )。DMEM/Ham s F12 培养基 (Gibco) ； 胎牛血清 (FCS， Gibco) ； 新生牛血清 (NCS， Gibco) ； 二甲基亚砜 (DMSO， Sigma) ； 四甲基偶氮唑盐 (MTT， Sigma) ； 碘化丙啶 (PI， Sigma) ； TritonX-100(Sigma) ； 胰蛋 白酶 (AMRESCO) ； 3- 异丁基 -1- 甲基黄嘌呤 (IBMX， Sigma) ； 地塞米松 (Dex， Sigma) ； 胰岛素 (Insulin， Sigma)。LS-1F 型超净工作台 (。
22、 上海索普仪器 ) ； 4950E 型 CO2 细胞培养箱 (USA， NUNR) ； AU640 倒置显微镜 (Olympus) ； 550 型酶标仪 (Bio-rad 550) ； 流式细胞仪 (EPICS XL， COULTER USA)。 0031 方法 ： 96 孔培养板接种细胞， 培养至第 3 天， 更换培养液， 分组并加入一定浓度的 木通皂苷 D， 使药物的终浓度分别达 0， 37.5， 75， 150， 300， 600gmL-1， 每组处理设 6 个重 复， 以0mol mL-1为对照， 在药物作用48h时间点上进行MTT测定。 用酶联检测仪在490nm 处测定各组吸光度 A。
23、， 并计算实验组的细胞存活率。结果见表 1。 0032 表 1 木通皂苷 D 对前脂肪细胞存活率的影响 0033 0034 由表 1 结果显示， 在浓度 37.5-300g/mL 范围内细胞的存活率变化不大， 并且在 显微镜下观察可见细胞的状态良好。 0035 6 孔细胞培养板接种细胞， 分为正常细胞对照组、 诱导组、 药物干预组， 正常细胞用 含 10 NCS 的 DMEM/Ham s 常规培养， 诱导组和药物干预组细胞培养至细胞 100长满后， 说 明 书 CN 102462688 A 6 5/11 页 7 加入诱导液 I(DMEM， 10胎牛血清， 0.5mmol/L IBMX， 1mo。
24、l/L 地塞米松， 1.7mol/L 胰岛 素 )， 药物干预组的诱导液 I 中加入不同浓度待测药物 (37.5， 75， 150， 300gmL-1)， 诱导 组不加药物换为加入等量的 PBS， 培养 14h 后， 以 0.25胰蛋白酶加 0.02的 EDTA 消化， 1000rpm 离心 5min， 收集细胞 2106， PBS 洗涤， 1000rpm 离心 10min， 重复 3 遍， 4预冷的 75乙醇于 4固定 48h 后用 PBS 洗去酒精， 2mL PBS 重悬细胞， RNaseA 酶 50g/mL 37 下孵育 30min 后， 冷却后每个样品加入 PI 至终浓度 1.5mg/。
25、mL， 冰浴避光染 30min， 用 300 目 尼龙网过滤后用流式细胞仪检测细胞周期。结果见表 2。 0036 表 2 木通皂苷 D 抑制前脂肪细胞增殖的作用 0037 0038 由表2结果显示， 木通皂苷D能有效抑制前脂肪细胞的增殖， 在浓度37.5-300g/ mL 范围内 S 期的细胞所占比率呈现剂量依赖关系， 并且在显微镜下观察可见细胞的状态良 好， 随药物浓度增高处于分裂期的细胞比率降低， 认为细胞周期被抑制。 0039 实施例 4 木通皂苷 D 对酒精性脂肪肝的作用 0040 材料 ： 木通皂苷 D 含量 98 ( 第二炮兵总医院药学部制备， 批号 ： 20090926)。雄 性。
26、Wistar大鼠， SPF级， 体重(18020)g， 购于北京大学医学部实验动物中心。 转氨酶AST、 ALT 试剂盒 ( 均购于北京中生生化试剂有限公司 )， 丙二醛 (MDA) 测试盒 ( 皆购自南京建成 工程研究所 )。52 度红星二锅头， 北京双庆和酒业有限责任公司生产。水飞蓟素 ( 德国， Madaus AG)。高脂饲料及其配方 ： 60普通饲料粉， 15猪油， 10蛋黄粉， 3蔗糖， 2胆 固醇， 10奶粉， 鱼肝油 10 滴 /kg， 军事医学科学院五所动物中心制备。721 型荧光分光光 度计 ( 上海第三分析仪器厂 )， 高速冷冻离心机 ( 中国， 型号 CT15RT)， 光。
27、学显微镜 ( 日本 OLYMPUS)。 0041 方法 ： 将 60 只大鼠随机分成两组 ： 正常对照组 (10 只 )， 给予普通饲料， 灌服生理 盐水 15mL/kg ； 模型组 (50 只 )， 前 3 天以酒精浓度为 15的红星二锅头代替水给与动物自 由饮用， 第 4 天始按 15mL/kg 灌服酒精浓度为 52的红星二锅头酒， 1 次 /d， 同时给予高脂 饲料。5wk 后模型成功， 随机将 10 只模型动物为一组， 灌服生理盐水 15mlLkg， 剩余的 40 只 模型组大鼠随机分成4组， 每组10只， 分别灌胃木通皂苷D(0.35g/kg， 0.70g/kg)， 水飞蓟素 ( 浓。
28、度为 5.00mg/mL， 15.00mg/d)。30d 结束实验， 最后 1 次灌胃后禁食 12h， 自由饮水， 取血 后处死， 离心 (3000rpm， 10min) 分离血浆， -20低温保存， 待测 AST 和 ALT ； 解剖取肝脏后 分两部分， 一部分 10中性甲醛固定后切片 HE 染色病理观察， 一部分 -20保存测定 MDA。 0042 采用 SPSS 11.5 软件进行资料统计和差异的显著性检验。实验结果以平均值 标准差表示， 采用单因素方差分析进行多组间均数比较， 以组间 t 检验进行统计学处理， P 0.05 为显著水平。结果见表 3。 0043 表 3 木通皂苷 D 对。
29、酒精性脂肪肝的作用 0044 说 明 书 CN 102462688 A 7 6/11 页 8 0045 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0046 由表 3 结果可知， 与模型组比较， 木通皂苷 D 的低、 高剂量对酒精性脂肪肝大鼠的 转氨酶和丙二醛有显著的降低作用 ； 并且肝脏指数明显降低至正常。显微镜下观察肝脏的 病理切片， 与模型组比较， 给予木通皂苷 D 有使实验动物的肝脏恢复至正常的作用效果， 无 明显的病理现象。 0047 实施例 5 木通皂苷 D 预防与治疗非酒精性脂肪肝的作用 0048 材料 ： 木通。
30、皂苷 D 含量 98 ( 第二炮兵总医院药学部制备， 批号 ： 20090926)。昆 明种小鼠， 雌性， 体重 202g， 由北京大学医学部实验动物科学部提供。游离脂肪酸 (NEFA) 测试盒、 超氧化物岐化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)试剂盒、 考马斯亮蓝测试盒(皆购自南京建成 工程研究所 ) ； 转氨酶 AST、 ALT 试剂盒 ( 均购于北京中生生化试剂有限公司 )。齐墩果酸 片 ( 北京万辉双鹤药业有限责任公司 )。高脂饲料及其配方 ： 60普通饲料粉， 15猪油， 10蛋黄粉， 3蔗糖， 2胆固醇， 10奶粉， 鱼肝油 10 滴 /kg， 军事医学科学院五所动物中 心制备。电子分。
31、析天平 ( 德国， 型号 CP225D) ； 550 型酶标仪 (Bio-rad 550) ； 高速冷冻离心 机 ( 中国， 型号 CT15RT) ； 紫外分光光度计 ( 中国 Unico， 型号 UV2800A) ； OLYMPUS 倒置显微 镜 ( 日本， 型号 AU640) ； HPLC( 日本岛津， 型号 S1L-20A)。 0049 方法 ： 健康成年雌性昆明种小鼠 140 只， 体重为 202g， 分为预防给药和治疗给 药， 各70只。 两者皆是随机分为两组， 正常对照组10只， 给予普通饲料， 灌服生理盐水10mL/ kg， 模型组 60 只， 给与高脂饲料， 又随机分为 6 组。
32、， 分别为模型组 ( 生理盐水 )， 木通皂苷 D 给药组(0.25g/kg， 0.50g/kg， 1.00g/kg)、 阳性对照组(齐墩果酸， 浓度为4.500mg/mL， 给药 量 0.900mg/d)， 每组 10 只。预防给药实验组为造模同时给药， 时间为 6wk ； 治疗实验组为先 造模6wk， 再给药4wk， 给药同时继续给予高脂饲料。 结束实验后， 最后1次灌胃后禁食12h， 自由饮水， 眼球取血后处死， ， 分离血浆， -20低温保存， 待测 AST 和 ALT， 测定肝脏 MDA， 并 取部分肝组织 10中性甲醛固定后切片 HE 染色病理观察。 0050 采用 SPSS 11。
33、.5 软件进行资料统计和差异的显著性检验。实验结果以平均值 标准差表示， 采用单因素方差分析进行多组间均数比较， 以组间 t 检验进行统计学处理， P 0.05 为显著水平。结果见表 4、 5。 0051 表 4 木通皂苷 D 对非酒精性脂肪肝的预防作用 0052 说 明 书 CN 102462688 A 8 7/11 页 9 0053 0054 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0055 由表4结果可知， 与模型组比较， 木通皂苷D对低、 中、 高剂量非酒精性脂肪肝小鼠 的转氨酶和丙二醛有非常显著的降低作用 ； 并。
34、且肝脏指数明显降低至正常。显微镜下观察 肝脏的病理切片， 与模型组比较， 给予木通皂苷 D 的实验动物其肝脏无脂肪粒、 脂肪纤维化 等病理现象， 有明显的预防脂肪肝作用。 0056 表 5 木通皂苷 D 对非酒精性脂肪肝的治疗作用 0057 0058 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0059 由表 5 结果可知， 木通皂苷 D 对非酒精性脂肪肝小鼠的转氨酶和丙二醛有显著的 降低作用 ； 并且木通皂苷 D 的中、 高剂量组与脂肪肝模型大鼠相比， 肝脏指数明显降低至正 常。显微镜下观察肝脏的病理切片， 与模型组比较， 。
35、给予木通皂苷 D 的实验动物其肝脏无脂 肪粒、 脂肪纤维化等病理现象， 有恢复至正常的作用效果， 具有明显的预防脂肪肝作用。 0060 实施例 6 木通皂苷 D 对单纯性脂肪肝小鼠血脂的影响 说 明 书 CN 102462688 A 9 8/11 页 10 0061 根据实施例 5 的方法， 将采集得到的实验动物血清同时进行血生化指标总胆固醇 (TC)， 甘油三脂 (TG)， 高密度脂蛋白 (HDL)， 低密度脂蛋白 (LDL) 的检测。结果见表 6、 7。 0062 表 6 木通皂苷 D 对预防给药单纯性脂肪肝小鼠血脂的影响 0063 0064 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p。
36、0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0065 表 7 木通皂苷 D 对治疗给药单纯性脂肪肝小鼠血脂的影响 0066 0067 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0068 由表6、 7结果可知， 与模型组比较， 木通皂苷D中、 高剂量组的总胆固醇(TC)、 甘油 三脂 (TG) 和低密度脂蛋白 (LDL) 的水平显著降低， 以及高密度脂蛋白 (HDL) 的水平显著升 高， 可见木通皂苷 D 具有调节单纯性脂肪肝小鼠的血脂平衡作用效果。 0069 实施例 7 木通皂苷 D 对单纯性脂肪肝小鼠。
37、肝脏氧化损伤的影响 0070 根据实施例 5 的方法， 将采集得到的治疗组实验动物肝脏匀浆和血清同时进行生 化指标总蛋白 (TP)， 游离脂肪酸 (FFA)， 超氧化岐化酶 (SOD) 的检测。结果见表 8。 0071 表 8 木通皂苷 D 对单纯性脂肪肝小鼠的血清蛋白和游离脂肪酸的影响 说 明 书 CN 102462688 A 10 9/11 页 11 0072 0073 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0074 由表 8 结果显示， 与模型组比较， 木通皂苷 D 中、 高剂量能明显提高单纯性脂肪肝 小鼠的总蛋白。
38、和超氧化岐化酶， 降低血清中的游离脂肪酸， 对脂肪肝造成的肝脏损伤有保 护和修复的作用。 0075 实施例 8 木通皂苷 D 对单纯性脂肪肝血糖的影响 0076 根据实施例 5 的方法， 将采集得到的实验动物血清还同时进行血糖的检测。结果 见表 9。 0077 表 9 木通皂苷 D 对单纯性脂肪肝小鼠血糖的影响 0078 0079 0080 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0081 由表9结果显示， 与模型组比较， 木通皂苷D能明显降低单纯性脂肪肝小鼠血清中 的血糖。 0082 实施例 8 木通皂苷 D 对去卵巢大。
39、鼠高脂血症及脂肪肝的治疗作用 0083 材料 ： 木通皂苷 D 含量 98 ( 第二炮兵总医院药学部制备， 批号 ： 20090926)。戊 酸雌二醇 ( 德国先灵公司生产， 国药准字 J2009008)。健康未交配雌性 3 月龄 S 大鼠体重 (20518g)， 由北京维通利华实验动物科技有限公司提供， 动物级别为二级。游离脂肪酸 (NEFA) 测试盒、 SOD 检测试剂盒、 丙二醛 (MDA) 测试盒、 考马斯亮蓝测试盒 ( 皆购自南京 建成工程研究所 ) ； 胆固醇 (TC)、 甘油三酯 (TG)、 高低密度脂蛋 (HDL-C)、 低密度白胆固醇 (LDL-C)( 皆购自北京中生生化试剂。
40、有限公司 )。电子分析天平 ( 德国， 型号 CP225D) ； 高速 说 明 书 CN 102462688 A 11 10/11 页 12 冷冻离心机离心机 ( 中国， 型号 CT15RT) ； 紫外分光光度计 ( 中国， 型号 UV2800A) ； OLYMPUS 显微镜 ( 日本， 型号 AU640) ； HPLC( 日本岛津， 型号 S1L-20A)。 0084 方法 ： 70只健康3月龄的雌性SD大鼠， 随机分为7组每组各10只， 分别为正常组、 假手术组、 模型组、 戊酸雌二醇组、 高剂量木通皂苷 D 组 (700mg/kg)、 中剂量木通皂苷 D 组 (350mg/kg)、 低剂。
41、量木通皂苷 D 组 (175mg/kg)。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠 (40mg/kg) 麻醉 后， 进行摘除卵巢手术。假手术组同上法打开腹腔， 暴露卵巢， 仅切去部分脂肪块但不摘除 卵巢。正常组的大鼠不给于任何处理。术后各组大鼠正常饮食 1 周恢复创伤， 并连续观察 阴道涂片 5d 证实无动情周期变化。随后分别按照各组的给药剂量每日灌胃给药一次， 正常 组、 假手术组和模型组给予生理盐水 10mL/kg。连续给药 7 周， 最后一次给药后禁食不禁水 12h， 用戊巴比妥钠麻醉， 腹主动脉采血， 所取血液于 3000r/min 离心 5min， 取血清用于各项 血生化指标测定 ； 取肝脏， 称重后。
42、剪下一小片边缘整齐的肝小叶放于 4福尔马林里固定， 其余部分称重后冻存在 -20的冰箱里。 0085 采用SPSS 11.5软件进行资料统计和差异的显著性检验。 实验结果以平均值标 准差表示， 采用单因素方差分析然后进行多组间均数比较， 以组间 t 检验进行统计学处理， P 0.05 为显著水平。结果见表 10-12。 0086 表 10 木通皂苷 D 对肝脏功能的影响 0087 0088 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0089 由表 10 结果可知， 与模型组比较， 木通皂苷 D 对去卵巢大鼠的转氨酶和丙二醛有。
43、 显著的降低作用， 并且木桶皂苷 D 的中、 高剂量对超氧化岐化酶有明显的升高作用。 0090 表 11 木通皂苷对大鼠肝组织甘油三脂及胆周醇的影响 说 明 书 CN 102462688 A 12 11/11 页 13 0091 0092 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0093 由表 11 结果可知， 与模型组比较， 木通皂苷 D 高剂量对去卵巢大鼠肝脏的总胆固 醇和甘油三酯有显著的降低作用。 0094 表 12 木通皂苷 D 对大鼠血清血脂的影响 0095 0096 #与正常对照组比较p0.05， #与模型比较。
44、p0.01 ； 与模型比较p0.05， 与模型比较 p 0.01。 0097 由表12结果可知， 与模型组比较， 木桶皂苷D的高剂量对总胆固醇(TC)、 甘油三脂 (TG) 和低密度脂蛋白 (LDL) 的水平能显著降低， 以及高密度脂蛋白 (HDL) 的水平能显著升 高， 因此木通皂苷 D 能调节去卵巢大鼠血脂平衡。 0098 实施例 9 木通皂苷 D 的毒理研究 0099 材料 ： 木通皂苷 D 含量 98 ( 第二炮兵总医院药学部制备， 批号 ： 20090926)。昆 明种小鼠， 雌雄各半， 体重 202g， 由北京大学医学部实验动物科学部提供。 0100 方法 ： 用蒸馏水将木通皂苷 D 溶解浓度为 0.5g/mL， 取 20 只昆明种小鼠， 雌雄各 半， 体重 202g， 按照 0.8ml/20g， 于上午 10 时一次性灌胃给药， 然后连续观察 7 天。 0101 结果 ： 在该剂量下， 小鼠没有出现中毒及死亡现象。 给药剂量相当于成人日常用量 的 40 倍。证明木通皂苷 D 的安全性好。 说 明 书 CN 102462688 A 13 。