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1、(10)申请公布号 CN 102512492 A (43)申请公布日 2012.06.27 CN 102512492 A *CN102512492A* (21)申请号 201210009952.0 (22)申请日 2012.01.01 A61K 36/53(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (71)申请人 山东大学威海分校 地址 264209 山东省威海市高技区文化西路 180 号 (72)发明人 张崇禧 张成城 侯欣池 李小叶 郑友兰 (54) 发明名称 美汉草制剂及其抗氧化用途 (57) 摘要 本发明所属医药产品研究开发技术领域。
2、。本 发明涉及美汉草制剂及其抗氧化用途。称取美汉 草干燥粗粉， 以美汉草粗粉10倍量的50乙醇浸 泡 10h 后， 然后超声提取 30min-35min， 超声温度 为30-32， 超声功率为80W， 超声提取三次， 静 置过滤， 经抽滤后合并滤液， 将滤液置于旋转蒸发 仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 48h-60h， 抽滤， 得流浸膏 ； 将流浸膏加适量水稀释成混悬液， 再 以流浸膏 4-5 倍量的石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和的 正丁醇分别萃取 3 次， 合并正丁醇层萃取液， 减压 浓缩， 冷冻干燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂。 美汉草制剂用于制备抗氧化作用的制剂。 (51)Int.Cl. 。
3、权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 美汉草制剂， 其特征在于美汉草制剂包括以下过程 ： 步骤(1) ： 称取美汉草干燥粗粉， 以美汉草粗粉10倍量的50乙醇浸泡10h后， 然后超 声提取30min-35min， 超声温度为30-32， 超声功率为80W， 超声提取三次， 静置过滤， 经 抽滤后合并滤液， 将滤液置于旋转蒸发仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 48h-60h， 抽滤， 得 流浸膏 ； 步骤 (2) ： 将步骤 (1) 中的流浸膏加适量水稀释成混悬液， 再以流浸膏 4-5。
4、 倍量的石油 醚、 乙酸乙酯、 水饱和的正丁醇分别萃取 3 次， 合并正丁醇层萃取液， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂， 备用。 2. 如权利要求 1 所述的美汉草制剂的用途， 其特征在于该制剂用于制备抗氧化作用的 制剂。 权 利 要 求 书 CN 102512492 A 2 1/5 页 3 美汉草制剂及其抗氧化用途 技术领域 0001 本发明所属医药产品研究开发技术领域。本发明涉及美汉草制剂及其抗氧化用 途。 背景技术 0002 目前， 大量资料已经证明 ： 炎症、 肿瘤、 衰老、 血液病、 以及心、 肝、 肺、 皮肤等各方面 疑难疾病的发生机理与体内自由基产生过多或清除。
5、自由基的能力下降有着密切的关系。 由 于抗氧化剂对由自由基引起的机体损伤有干扰作用， 而被公认为是一种新的治疗途径， 在 预防医学领域里， 对抗氧化剂研究兴趣空前高涨。 合成的抗氧化剂虽然抗氧化性能较好， 但 有一定的副作用。所以， 开发研究抗氧化作用的天然药物是目前研究的重中之重。 0003 美 汉 草 为 唇 形 科 (Labiatae) 龙 头 草 属 (Meehania) 植 物 芝 麻 花 Meehania urticifolia(Miq.)Makino 的干燥地上部分， 别名荨麻叶龙头草， 芝麻花 ( 辽宁 )、 美汉花， 异名水升麻 ( 四川 )， 为多年生草本植物， 分布于通化。
6、、 浑江、 柳河、 集安、 抚松、 靖宇、 蛟河、 舒兰、 安图、 敦化、 长白朝鲜族自治区、 通化县等地， 朝鲜、 日本也有分布。 美汉草味辛、 苦、 性 微寒， 全草入药， 可作为民间药， 具有清热解表， 利水消肿等功效。 用于感冒发热， 泻痢腹痛， 肝炎， 胆囊炎， 小便不利， 蛇咬伤等症。 在民间作美汉草药用， 全草可入药， 作为寒药， 具有发 表清热， 利湿解毒等功效， 其天然资源极为丰富， 且蕴含量大。 0004 经查阅文献发现， 国内外对美汉草的抗氧化作用研究鲜见报道。 通过本文的研究， 为深入研究美汉草植物提供理论依据。为其在食品、 药品等领域开发新的天然抗氧化剂提 供参考依据。
7、。 发明内容 0005 1、 美汉草制剂， 其特征在于美汉草制剂包括以下过程 ： 0006 步骤(1) ： 称取美汉草干燥粗粉， 以美汉草粗粉10倍量的50乙醇浸泡10h后， 然 后超声提取 30min-35min， 超声温度为 30 -32， 超声功率为 80W， 超声提取三次， 静置过 滤， 经抽滤后合并滤液， 将滤液置于旋转蒸发仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 48h-60h， 抽 滤， 得流浸膏 ； 0007 步骤 (2) ： 将步骤 (1) 中的流浸膏加适量水稀释成混悬液， 再以流浸膏 4-5 倍量的 石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和的正丁醇分别萃取 3 次， 合并正丁醇层萃取液， 减压浓缩。
8、， 冷冻干 燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂， 备用。 0008 2、 美汉草制剂具有抗氧化作用。 0009 根据本发明， 本发明中的 “” 是重量百分比。 具体实施方式 0010 本发明所述的美汉草制剂及其抗氧化用途包括以下实施例， 下面的实施例可进一 步说明本发明， 但不以任何方式限制本发明。 说 明 书 CN 102512492 A 3 2/5 页 4 0011 实施例 1 ： 0012 1、 美汉草制剂， 其特征在于美汉草制剂包括以下过程 ： 0013 步骤 (1) ： 称取美汉草干燥粗粉 2.25kg， 加入 22.5kg 的 50乙醇浸泡 10h 后， 然 后超声提取 30min，。
9、 超声温度为 30， 超声功率为 80W， 超声提取三次， 静置过滤， 经抽滤后 合并滤液， 将滤液置于旋转蒸发仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 48h， 抽滤， 得流浸膏 ； 0014 步骤 (2) ： 将步骤 (1) 中的流浸膏加适量水稀释成混悬液， 再以流浸膏 4 倍量的 石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和的正丁醇分别萃取 3 次， 合并正丁醇层萃取液， 减压浓缩， 冷冻干 燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂， 备用。 0015 2、 美汉草制剂具有抗氧化作用。 0016 实施例 2 ： 0017 1、 美汉草制剂， 其特征在于美汉草制剂包括以下过程 ： 0018 步骤 (1) ： 称取美汉草干燥粗。
10、粉 2.25kg， 加入 23.0kg 的 50乙醇浸泡 10h 后， 然 后超声提取 35min， 超声温度为 32， 超声功率为 80W， 超声提取三次， 静置过滤， 经抽滤后 合并滤液， 将滤液置于旋转蒸发仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 60h， 抽滤， 得流浸膏 ； 0019 步骤 (2) ： 将步骤 (1) 中的流浸膏加适量水稀释成混悬液， 再以流浸膏 5 倍量的 石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和的正丁醇分别萃取 3 次， 合并正丁醇层萃取液， 减压浓缩， 冷冻干 燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂， 备用。 0020 2、 美汉草制剂具有抗氧化作用。 0021 药理试验 美汉草制剂的抗氧化。
11、作用 0022 1 材料与方法 0023 1.1 实验样品来源 0024 药材采于吉林省临江市， 由吉林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定美汉草为唇形 科 (Labiatae) 龙头草属 (Meehania) 植物芝麻花 Meehania urticifolia(Miq.)Makino 的 干燥地上部分。 0025 1.2 仪器 0026 T6 新世纪紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限责任公司 ) ； 百灵 LA114 型电子天平 (110g/0.0001g， 常熟市百灵天平仪器有限公司 ) ； 电子计数天平 (500g/0.001g， 金羊天平仪器厂 ) ； KQ-250DB 型超声波。
12、清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公 司) ； 101-2A型数显电热鼓吹干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司) ； RE 52-05 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ； RE-52AA 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ； 电子 恒温水浴锅 ( 天津泰斯特仪器有限公司 ) ； 移液枪 (20ul， 上海肯强贸易有限公司 )。 0027 1.3 试剂 0028 DPPH 溶液， 蒸馏水， 无水乙醇， 甲醇， ABTS， 过硫酸钾， 铁氰化钾， 磷酸盐缓冲液 (PH 6.6)， 三氯乙酸， 三氯化铁， 抗坏血酸(以下用Vc表示)(上海惠世生化试剂有限公司， 批 号 ： 08040。
13、8)， Folin-Ciocalteu 试剂， 无水碳酸钠。 0029 2 实验方法与步骤 0030 2.1 药材组分的提取 0031 取美汉草样品粉末 2.25kg， 分别以美汉草粉末 10 倍量的 50乙醇浸泡 10h 后， 超 声 35min， 温度为 30， 功率为 80W， 超声提取三次， 静置过滤， 经抽滤后合并滤液， 将滤液置 说 明 书 CN 102512492 A 4 3/5 页 5 于旋转蒸发仪中回收乙醇后置于 4冰箱中 60h， 抽滤， 得流浸膏， 将此流浸膏加适量水稀 释成混悬液， 再以流浸膏4-5倍量的石油醚、 乙酸乙酯、 水饱和的正丁醇分别萃取3次， 合并 正丁醇层。
14、萃取液， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到美汉草正丁醇提取物制剂， 备用。 0032 2.2 DPPH 法测定抗氧化活性 0033 2.2.1 样品溶液的制备 0034 准确称取干燥至恒重的美汉草正丁醇提取物制剂 30mg， 用无水乙醇定容于 10mL 容量瓶中， 配成浓度为 3mg/mL 的样品母液， 将样品母液用无水乙醇逐级稀释成浓度为 0.000mg/ml， 0.018mg/mL， 0.037mg/mL， 0.075mg/mL， 0.15mg/mL， 0.31mg/mL， 0.62mg/mL， 1.25mg/mL 的样品溶液待用。 0035 2.2.2 DPPH 溶液的制备 0036 精密称。
15、取 DPPH 样品 0.01g， 加入无水乙醇定容至 50ml 容量瓶中， 得到 DPPH 母液 ( 浓度 0.2mg/mL)。从母液中移取 10mL， 用无水乙醇定容置 50mL 容量瓶中， 得到 DPPH 溶液 ( 浓度 0.04mg/mL)， 整个过程都需要避光。 0037 2.2.3 样品测定 0038 美汉草正丁醇提取物制剂样品溶液按表 1 加入反应液， 摇匀后于室温避光静置 30min， 在 515nm 处测定吸光度值。用 Vc 作对照。 0039 表 1 美汉草正丁醇提取物制剂样品溶液加样表 0040 0041 DPPH 清除率 (A-B+C)/A*100 0042 2.3 AB。
16、TS 法测定抗氧化活性 0043 2.3.1 样品溶液的制备 0044 精确称取干燥至恒重的美汉草正丁醇提取物制剂 30mg， 用水定容于 10mL 容量 瓶中， 配成浓度为 3mg/mL 的样品母液， 将样品母液用水逐级稀释成浓度 0.000mg/ml， 0.018mg/mL， 0.037mg/mL， 0.075mg/mL， 0.15mg/mL， 0.31mg/mL， 0.62mg/mL， 1.25mg/mL， 的样 品溶液待用。 0045 2.3.2 ABTS+溶液的制备 0046 5mL， 14mM 的 ABTS 和 5mL， 4.9mMk2S2O8 混合产生 ABTS+， 黑暗中静止 。
17、16h， 使用之前 用乙醇稀释成备用的 ABTS+， 要求其在 734nm 波长下的吸光度为 0.700.02。 0047 2.3.3 样品测定 0048 取 3ml 样品溶液加入 158LABTS+(Asample)， 用乙醇做空白， 158LABTS+和 3ml 水 为标准液 (Acontrol)， 6min 后在 734nm 波长下测定吸光度， 用 Vc 作对照。 0049 清除率 ( ) (Acontrol-Asample)/Acontrol100 0050 2.4 半数抑制率的计算 0051 半数抑制率 (IC50) 指清除率为 50时所需抗氧化剂的浓度， 根据不同浓度抗氧化 剂的清。
18、除率作曲线求出。 0052 2.5 总酚含量测定 说 明 书 CN 102512492 A 5 4/5 页 6 0053 2.5.1 标准曲线的绘制 0054 精密称取对照品没食子酸 0.0040g， 甲醇溶解转入 100ml 容量瓶， 制成浓度为 0.04mg/ml 的标准品溶液， 备用。 0055 分 别 吸 取 0.5ml、 1.0ml、 2.0ml、 4.0ml、 8.0ml 于 25ml 容 量 瓶 中 加 2.5ml Folin-Ciocalteu 试剂， 摇匀， 在 0-8min 再加入 2ml7.5 Na2CO3溶液， 于 50水浴反应 5min， 冷却至室温加蒸馏水定容。以空。
19、白溶液为参比溶液， 于 760nm 测定吸光度。对所 测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程， 并以对照品的质量为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。将数据进行回归分析得到标准曲线的回归方程为 ： Y 6.2168X-0.0421， R2 0.9991， 在 0.02-0.32mg 范围内线性关系良好。 0056 2.5.2 样品测定 0057 取样品 20mg 于 10mL 容量瓶中， 用甲醇定容， 取 0.5ml 样品溶液于 25mL 容量瓶 中， 加入 Folin-Ciocalteu( 福林酚试剂 )2.5mL， 在 0.5 至 8 分钟范围内间断加入 2mL 无水 Na2c。
20、o3(75g/L)， 在 50水浴中加热 5min， 冷却后用蒸馏水配平， 760nm 处测吸光度值， 用蒸 馏水作对照。 0058 3 结果与讨论 0059 3.1 结果 0060 3.1.1 DPPH 法测定抗氧化活性结果 0061 见表 2。 0062 表 2 DPPH 法测定抗氧化活性结果 清除率 0063 0064 美汉草正丁醇提取物制剂样品对 DPPH自由基有很强的清除作用。随着样品浓度 的增加， 清除自由基能力呈逐渐上升趋势， 具有良好的量效关系。 0065 3.1.2 ABTS 法清除自由基作用结果 0066 见表 3。 0067 表 3 ABTS 法清除自由基作用结果 006。
21、8 0069 美汉草正丁醇提取物制剂样品对 ABTS+自由基有很强的清除作用。随着样品浓 度的增加， 美汉草的抗氧化能力随之增强， 呈现良好的量效关系。 0070 3.1.3 美汉草正丁醇提取物制剂清除 DPPH 和 ABTS 的 IC50值及总酚含量 0071 见表 4。 0072 表 4 美汉草正丁醇提取物制剂的抗氧化活性及总酚含量 0073 说 明 书 CN 102512492 A 6 5/5 页 7 0074 美汉草正丁醇提取物制剂的总酚含量较高， 为 3.1mg/20mg， DPPH 法测得的 VC的 IC50值为 0.002mg/ml， 美汉草正丁醇提取物制剂的 IC50值为 0.004mg/ml， 接近于 VC。ABTS 法测得的 VC的 IC50值为 0.027mg/ml， 美汉草正丁醇提取物制剂的 IC50值接近于 VC， 为 0.063mg/ml。美汉草正丁醇提取物制剂具有较强的抗氧化能力， 能明显地清除 DPPH、 ABTS 自由基。 0075 通过对美汉草正丁醇提取物制剂的抗氧化活性的研究， 为其在食品、 药品等领域 开发新的天然抗氧化剂提供了参考。 说 明 书 CN 102512492 A 7 。