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1、(10)申请公布号 CN 102488891 A (43)申请公布日 2012.06.13 CN 102488891 A *CN102488891A* (21)申请号 201110420122.2 (22)申请日 2011.12.15 A61K 38/19(2006.01) A61K 38/20(2006.01) A61K 35/28(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 35/14(2006.01) (71)申请人 天津济命生生物科技有限公司 地址 300384 天津市南开区兰苑路五号 4 号 楼 B 座 303 室 (72)发明人 赵钢 王国新 王智佳 张伟 。
2、(54) 发明名称 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种抗肿瘤生物制品及其制备 方法， 采用了猪血和猪脾取代人的血和脾等淋巴 组织， 通过分离淋巴细胞， 再用鸡新城疫病毒或仙 台病毒诱导培养， 经过纯化除菌等方法制成抗肿 瘤细胞因子。本发明的复合细胞因子能够通过改 变淋巴因子诱导细胞毒细胞作用， 使其具有强大 的抗肿瘤作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 其特征在于 ： 取新鲜猪血、 猪。
3、脾， 无菌操作制成 细胞悬液 ； 经分离淋巴细胞， 加 RPMI1640 的培养基、 接种鸡新城疫病毒或仙台病毒， 诱导培 养 72 96 小时， 收集诱导培养液经超滤纯化， 除菌制成细胞因子。 2. 根据权利要求 1 所述的一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 其特征在于经检疫新鲜 的猪脾 600g， 立即放入抗菌素溶液浸泡 2 小时 ； 在超净台中无菌操作， 用研磨器将脾研碎制 成细胞悬液， 按15比例加生理盐水稀释， 200目细胞筛过滤， 沿管壁将滤液小心倒入离心 管中， 1500转/分离心30分钟， 计数细胞数量， 按6106浓度加入RPM1640培养基， 按4000 单位/ml加入抗菌素。
4、， 再加入鸡新城疫病毒(NDV)或仙台病毒。 培养瓶中培养， 57CO2， 37， CO2培养箱中培养48小时， 取培养上清液， 4000转/分， 离心30分钟， 弃沉渣， 取上清， 获 400ml 上清液。 3. 根据权利要求 1 所述的一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 其特征在于经检疫新鲜 的猪血 800ml， 在超净台中无菌操作， 1500 转 / 分离心 30 分钟， 取白细胞悬液加入 RPM1640 培养基， 调节细胞浓度为 6106浓度， 再加入鸡新城疫病毒 (NDV) 或仙台病毒， 培养瓶中培 养， 57CO2， 37， CO2培养箱中培养48小时， 取培养上清液， 4000转/。
5、分， 离心30分钟， 弃沉渣， 取上清， 获上清液 900ml。 4. 根据权利要求 1 所述的一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 其特征在于上述上清液 在超滤器中经 300Kd 超滤膜超滤， 取 300Kd 超滤膜的膜以下部分， 再在超滤器中经 5Kd 超滤 膜超滤， 取 5Kd 超滤膜的膜以上部分， 即为白细胞介素为主的复合细胞因子。 权 利 要 求 书 CN 102488891 A 2 1/4 页 3 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法 技术领域 0001 本发明是涉及生物技术领域， 尤其是一种抗肿瘤生物制品及其制备方法。 背景技术 0002 白细胞介素 -2( 即白细胞介素 -2) 是 80。
6、 年代国际上开始研制的生物制品。它是 继传统治疗肿瘤的三大疗法 ( 手术、 化学、 放射疗法 ) 之后的第四种疗法即生物疗法 (BRM) 的关键药物。其本身大大剂量可有抗癌活性 ； 用白细胞介素 -2 在人体外培养人的淋巴细 胞， 使淋巴细胞具有杀伤肿瘤细胞， 而不损伤正常细胞， 其杀伤肿瘤细胞能力大为增强的特 性， 并使淋巴细胞的数量得到大量、 快速的增殖 ( 此种经白细胞介素 -2 激活的淋巴细胞称 之为 LAK 细胞 )。美国癌研究中心 Rosenberg.SA 用 LAK 细胞加白细胞介素 -2 治疗晚期恶 性肿瘤， 获得 8 例肿瘤完全消失的显著效果。但是目前所使用的白细胞介素 -2。
7、 是来自人 体的淋巴细胞、 人的扁桃腺、 人的脾， 这些都是从车祸等死者身上及时采取或从活人身上采 取， 诱导培养白细胞介素 -2( 而不用白细胞介素 1-7 等 )， 提取工艺复杂， 设备昂贵， 药物来 源困难， 所以价格极高。也有采用基因工程方法， 将人的白细胞介素 -2 基因掺入大肠杆菌 中， 生产的白细胞介素-2称之为重组白细胞介素-2(即白细胞介素-2)， 其价格也未降下来 多少， 用Rosenberg.SA的剂量， 一人一疗程， 需1000万元人民币， 且含有大肠杆菌毒素无法 完全消除， 人体使用发高烧， 有毒素放应。 0003 因此， 研发一种使用安全， 价格低廉、 药源广泛的细。
8、胞因子是现阶段亟待解决的技 术问题。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗肿瘤生物制品及其制备方法。 0005 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案是 ： 0006 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 是由下述方法得到的 ： 0007 取新鲜猪血无菌操作制成细胞悬液， 加入鸡新城疫病毒或仙台病毒于 RPMI1640 的培养基中、 诱导培养 72 96 小时， 收获上清液， 上清液在超滤器中经 300Kd 超滤膜超滤， 取 300Kd 超滤膜的膜以下部分， 再在超滤器中经 5Kd 超滤膜超滤， 取 5Kd 超滤膜的膜以上部 分， 除菌后即为白细胞介素为主的复合细胞因子。 0。
9、008 上述用于一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 具体步骤如下 ： 0009 取新鲜猪脾无菌操作制成细胞悬液， 加入鸡新城疫病毒或仙台病毒于 RPMI1640 的培养基中、 诱导培养 72 96 小时， 收获上清液， 上清液在超滤器中经 300Kd 超滤膜超滤， 取 300Kd 超滤膜的膜以下部分， 再在超滤器中经 5Kd 超滤膜超滤， 取 5Kd 超滤膜的膜以上部 分， 除菌后即为白细胞介素为主的复合细胞因子。 0010 上述用于一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 具体步骤如下 ： 0011 (1) 取新鲜猪脾放入庆大霉素溶液中浸泡 2 小时， 用研磨器将脾研碎制成细胞悬 液 ； 说 明 书 。
10、CN 102488891 A 3 2/4 页 4 0012 (2) 按体积比 1 5 加入生理盐水稀释， 将稀释后细胞悬液经 200 目细胞筛过 滤， 将滤液倒入离心管中， 1500 转 / 分离心 30 分钟， 计数细胞数量， 按 6106浓度加入到 RPM1640培养基中， 按4000单位/ml加入庆大霉素， 再加入鸡新城疫病毒(NDV)或仙台病毒 各 10ml 于培养瓶中培养 ； 0013 (3) 于 37， 5 7 CO2培养箱中培养 48 小时， 取培养上清液， 4000 转 / 分离心 30 分钟， 弃沉渣， 取上清， 收获上清液 ； 0014 (4) 取步骤 (3) 所得上清液在。
11、超滤器中经 300Kd 超滤膜超滤， 取超滤膜下部分， 再 在超滤器中经 5Kd 超滤膜超滤， 取超滤膜上部分， 即为细胞因子。 0015 上述用于一种抗肿瘤生物制品及其制备方法， 具体步骤如下 ： 0016 (1) 取新鲜猪血 1500 转 / 分离心 30 分钟， 取白细胞悬液加入 RPM1640 培养基， 调 节细胞浓度为 6106浓度， 再加入鸡新城疫病毒或仙台病毒各 10ml 于培养瓶中培养 ； 0017 (2) 于 37， 5 7 CO2培养箱中培养 48 小时， 取培养上清液， 4000 转 / 分， 离心 30 分钟， 弃沉渣， 取上清， 收获上清液 ； 0018 (3) 取步。
12、骤 (2) 所得上清液在超滤器中经 300Kd 超滤膜超滤， 取超滤膜下部分， 再 在超滤器中经 5Kd 超滤膜超滤， 取超滤膜上部分， 即为细胞因子。 0019 本发明的有益效果是 ： 0020 上述用于一种抗肿瘤生物制品及其制备方法采取 1 万至 300Kd 的低分子量蛋白 质， 取得包括白细胞介素-1至白细胞介素-7及干扰素等多种因子(这些因子分子量均在1 万至 5 万分子量之间 ) 的细胞因子， 几种细胞因子的共同作用， 增强抗肿瘤作用的效果， 其 疗效高， 使用安全， 价格低廉、 药源广泛 ； 以猪血和猪脾制取白细胞介素(白细胞介素)为主 的抗肿瘤生物制品的生产方法， 制备方法简单，。
13、 适合大规模工业化生产的需要。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。 0022 实施例 1 ： 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法制备过程如下 ： 0023 经检疫新鲜的猪脾 800g， 立即放入庆大霉素溶液浸泡 2 小时 ； 在超净台中无菌操 作， 用研磨器将脾研碎制成细胞悬液。按 1 5 比例加生理盐水稀释。200 目细胞筛过滤， 沿管壁将滤液小心倒入离心管中， 1500 转 / 分离心 30 分钟， 计数细胞数量， 按 7106浓度 加入 RPM1640 培养基。按 5000 单位 /ml 加入抗菌素， 再加入鸡新城疫病毒 54ml。培养瓶中 培养，。
14、 5 7 CO2， 37， CO2培养箱中培养 58 小时。取培养上清， 4000 转 / 分， 离心 30 分 钟， 弃沉渣， 取上清， 获 500ml 上清液。 0024 上清液在超滤器中经分子量300Kd超滤膜超滤， 取300Kd超滤膜的膜以下部分， 再 经 5Kd 超滤膜超滤， 取 5Kd 超滤膜的膜以上部分， 得 35ml 浓缩液。用分光光度计检测， 取 蛋白质部分， 得 400ml 白细胞介素 -2 细胞因子， CTLL 细胞 MTT 法测白细胞介素 -2 活性为 4500u/ml， 除菌分装低温保存。 0025 临床治疗肿瘤效果见下表 ： 0026 抗肿瘤生物制品治疗肿瘤的疗效 。
15、( ) 0027 说 明 书 CN 102488891 A 4 3/4 页 5 0028 实施例 2 ： 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法的具体制备方法如下 ： 0029 采取新鲜猪血500ml， 0.1肝素抗凝， 庆大霉素抑菌， 低速2500转/分， 离心30分 钟其血浆层加 2 倍生理盐水， 2500 转 / 分， 离心 30 分钟， 收集淋巴细胞待用。以 1 3 加 淋巴细胞分离液， 先将淋巴细胞分离液放于离心杯下部， 白细胞重层于其上， 1500 转 / 分， 30分钟其血浆层加取梯度离心的淋巴细胞层， 加2倍体积生理盐水1500转/分， 离心20分 钟取淋巴细胞沉渣， 与前述梯度离心的。
16、淋巴细胞合并， 加一倍生理盐水洗一次， 计数细胞数 量， 以 RPMI1640 培养基稀释淋巴细胞为 5106/ml， 加庆大霉素 (4000 单位 /ml) 加仙台病 毒 34ml， 注入培养瓶中， 在 CO2培养箱中， 5 7 CO2， 37培养 4 小时。取培养上清， 1500 转 / 分， 离心 30 分钟， 取上清， 获 450ml， 在超滤器中经分子量 300Kd 滤膜超滤， 取 300Kd 以 下部分， 再经 5Kd 滤膜超滤， 取 5Kd 以上部分， 得 50ml 浓缩液， 用国产紫外可见分光光度计 检测， 280nm 波长， 取蛋白质部分。得 100ml 白细胞介素 -2 细。
17、胞因子。CTLL 细胞 MTT 法测 白细胞介素 -2 活性为 3100 单位 /ml。0.2m 孔径滤膜， 除菌过滤， 4000 单位 / 支， 分装， 低 温保存。 0030 临床使用病例 ： XX， 女， 51岁， 住院号34565临床诊断 ： 右肩部肿物切除术后(转移 腺癌 )， 多发性骨转移肝硬化腹水， 肝转移。患者已处肿瘤晚期 (IV 期 )， 卧床不起不能自动 翻身， 黄疸。骨 ECT 检查为多发性骨转移。经三周 CMFA 化疗无效。化疗肿出现腹水， 腹围 110cm， 衰竭尿少， 不能进行任何化疗， 病人危在旦夕。仅用腹腔注射白细胞介素 -2 细胞因 子 12000 单位 3 。
18、次， 异体 LAK 细胞三次总量 2.0109。二个月腹水不仅未增加而且减少为 腹围92.5cm。 维持生命近半年， 延长生存期3个月， 注药后无皮疹， 无发烧， 无急性或迟发型 过敏反应， 无肝肾功能障碍。 0031 实施例 3 ： 一种抗肿瘤生物制品及其制备方法制备过程如下 ： 0032 经检疫新鲜的猪脾 8000g， 立即放入庆大霉素溶液浸泡 2 小时 ； 在超净台中无菌操 作， 用研磨器将脾研碎制成细胞悬液。按 1 5 比例加生理盐水稀释。200 目细胞筛过滤， 沿管壁将滤液小心倒入离心管中， 1500 转 / 分离心 30 分钟， 计数细胞数量， 按 6106浓度 加入 RPM164。
19、0 培养基。按 5000 单位 /ml 加入抗菌素， 再加入仙台病毒 674ml。培养瓶中培 养， 5 7 CO2， 37， CO2培养箱中培养 48 小时。取培养上清， 3400 转 / 分， 离心 30 分钟， 弃沉渣， 取上清， 获 4000ml 上清液。 说 明 书 CN 102488891 A 5 4/4 页 6 0033 上清液在超滤器中经分子量300Kd超滤膜超滤， 取300Kd超滤膜的膜以下部分， 再 经 10Kd 超滤膜超滤， 取 10Kd 超滤膜的膜以上部分， 得 350ml 浓缩液。得 4000ml 细胞因子， 除菌分装低温保存。 0034 综上所述， 上述用于治疗癌症的细胞因子几种细胞因子的共同作用， 可协同提高 疗效， 该制剂含有白细胞介素-1到白细胞介素-7及干扰素等多种淋巴因子， 其在生理条件 下相辅相成， 大大提高抗癌疗效， 同时还具有抗病毒、 抗细菌、 抗寄生虫病作用 ； 该细胞因子 疗效高、 使用安全。 0035 上述参照实施例对该一种抗肿瘤生物制品及其制备方法进行的详细描述， 是说明 性的而不是限定性的， 可按照所限定范围列举出若干个实施例， 因此在不脱离本发明总体 构思下的变化和修改， 应属本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102488891 A 6 。