一种竹荪醇提取物及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种竹荪醇提取物及其制备方法与应用， 具体涉及一种竹荪中抗衰 老、 美容美白有效成分及其制备方法与应用。背景技术
竹荪 (Dictyophora indusiata) 为笔鬼科 (Phallaceae) 竹荪属 (Dictyophora) 真菌， 又名竹笙、 竹参、 网纱菌等， 是一种珍贵的兼具食用和药用价值的两用真菌， 在我国主 要分布在云南、 福建、 湖南、 四川及东北三省等地区。
竹荪是一种名贵的食用菌， 富含多种优质植物营养蛋白， 蛋白质含量高且含有组 成蛋白质的全套氨基酸， 其中必需氨基酸含量占总氨基酸的 1/3 以上， 高于谷物与一些肉 类， 谷氨酸含量最为丰富， 占氨基酸总量的 17.0％以上。 竹荪的子实体酥脆可口， 香味浓郁， 味道鲜美， 别具风味， 素有 “菌中皇后” 、 “山珍之王” 的美称。竹荪属于生理碱性食品， 能够 调节人体中血酸和脂肪酸的含量， 降血压作用效果明显， 竹荪还能够降低体内胆固醇、 减少 腹壁脂肪的贮积 ； 竹荪中所含有的高活性的大分子物质多糖成分具有抑制肿瘤、 抗炎症、 抗 凝血、 刺激免疫以及降血糖等疗效， 对艾滋病也有一定的抑制作用 ； 竹荪中含有的有效成分 对肌肤具有美白及延缓衰老的功效。
目前对竹荪的研究多集中在液体培养条件、 多糖的提取、 发酵菌及子实体营养成 分等方面， 近年来随着竹荪提取物尤其是醇提取物的美容美白功效的发现， 竹荪逐渐成为 时尚化妆品有效成分的原材料， 但是针对竹荪醇提物， 由于液体中含有乙醇， 一般很难作为 化妆品活性原料进行添加， 所以对竹荪醇提物进行研究， 研发出适用于化妆品原料要求的 竹荪醇提物， 此提取物也可以作为食品、 保健品的功效成分添加到产品之中， 具有重要的经 济价值。 发明内容
本发明的目的是提供一种竹荪醇提取物及其制备方法与应用。
本发明提供的一种竹荪醇提取物的制备方法， 包括如下步骤 ：
(1) 将竹荪粉末与乙醇水溶液混合后经加热提取得提取液 ；
(2) 所述提取液经静置沉淀后经过滤得到回收液 ；
(3) 浓缩所述回收液得浓缩液 ；
(4) 向所述浓缩液中加入糊精， 并搅拌均匀后依次经预冻成冰和冷冻干燥即得产 品。
上述的制备方法中， 步骤 (1) 中， 所述竹荪粉末的粒度为 60 目～ 80 目， 具体可为 60 目、 70 目或 80 目 ； 所述竹荪粉末与乙醇水溶液的质量份数比为 1 ∶ (30 ～ 40)， 具体可 为 1 ∶ 30、 1 ∶ 40 或 1 ∶ 50 ； 所述乙醇水溶液中， 乙醇的体积百分含量为 80％～ 90％， 具 体可为 80％、 85％或 90％。
上述的制备方法中， 步骤 (1) 中， 所述加热提取的温度为 80℃～ 85℃， 具体可为80℃或 85℃， 时间为 2.0h ～ 2.5h， 具体可为 2.0h 或 2.5h。
上述的制备方法中， 步骤 (2) 中， 所述静置沉淀的时间为 0.5h ～ 1h， 具体可为 0.5h 或 1h ； 步骤 (3) 中， 所述浓缩的温度为 55℃～ 60℃， 具体可为 55℃或 60℃， 所述浓缩 液与所述回收液的质量份数比为 1 ∶ (28 ～ 37)， 具体可为 1 ∶ 28、 1 ∶ 32 或 1 ∶ 37。
上述的制备方法中， 步骤 (4) 中， 所述糊精与所述浓缩液中可溶性固形物的质量 份数比为 1 ∶ (2 ～ 3)， 具体可为 1 ∶ 3 或 1 ∶ 2 ； 用数字式折射仪或阿贝折射率仪测定所 述浓缩液中可溶性固形物的含量。
上述的制备方法中， 步骤 (4) 中， 所述预冻成冰步骤在冰箱中于 -40℃～ -60℃下 进行， 如 -40℃或 -60℃ ； 所述冷冻干燥步骤在真空冷冻干燥机中进行 ； 所述冷冻干燥的温 度为 -70℃， 时间为 18h ～ 36h， 如 18h、 24h 或 36h。
本发明还提供了上述方法制备的竹荪醇提取物。
本发明还进一步提供了上述竹荪醇提取物在制备化妆品中的应用， 该化妆品具有 抗衰老、 美白美容的功效。
本发明方法操作简单， 生产成本低， 制备的产物具有较高的纯度， 活性成分产率 高； 该方法制备的竹荪醇提取物容易成粉， 颜色呈淡黄色或黄色， 容易添加到化妆品配方之 中； 采用此提取物制备的化妆产品具有明显的抗衰老效果， 美白美容效果更为显著。 附图说明
图 1 为本发明实施例 1 制备竹荪醇提取物的工艺流程图。 图 2 为本发明实施例 1 制备的竹荪醇提取物的照片。 图 3 为本发明实施例 1 制备的竹荪醇提取物对 L- 酪氨酸酶的活性抑制率曲线。 图 4 为本发明实施例 2 制备的竹荪醇取提物清除超氧阴离子自由基的清除率曲 图 5 为本发明实施例 3 制备的竹荪醇取提物清除 DPPH 自由基的清除率曲线。线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 竹荪醇提取物的制备及美白功效试验
1、 制备竹荪醇提取物
本实施例制备竹荪醇提取物的工艺流程图如图 1 所示。
1) 制备样品 ： 将竹荪粉碎 ( 粉碎设备 ： 多功能粉碎机 GX-04， 上海高翔食品机械 厂 ) 并过 60 目筛得到粉末， 置于通风干燥处保存， 备用， 称取竹荪粉末 100g ；
2) 加热提取 ： 将制备的竹荪粉末和体积百分含量为 80％的乙醇水溶液以 1 ∶ 30 的质量比混合搅拌均匀， 置于 80℃微沸条件 ( 加热设备 ： 电子调温电热器 98-1-B 型， 天津 市泰斯特仪器有限公司 ) 下回流提取 2.5h ；
3) 沉淀抽滤 ： 将提取液静置沉淀 0.5h， 用滤板进行抽滤 ( 抽滤设备 ： SHZ-III 型循 环水式多用真空泵， 上海知信实验仪器有限公司 ) 得到回收液 ；
4) 浓缩 ： 将 2800g 回收液置于 55 ℃条件下浓缩 ( 浓缩设备 ： 旋转蒸发器 RE2000型， 上海亚荣生化仪器厂 ) 到 100g 浓缩液， 其中浓缩液与回收液的质量份数比为 1 ∶ 28， 并 采用固含仪 (ATAGO 数字式折射仪 PR-101α) 测定浓缩液中可溶性固形物含量为 40％ ；
5) 加入糊精 ： 向浓缩液中加入 2 倍于可溶性固形物质量的糊精 80g 得混合液 ；
6) 将混合液搅拌均匀， 充分溶解后， 放在冰箱中于 -40℃预冻成冰后， 再置于真空 冷冻干燥机中 ( 美国 VIRTIS 公司 )-70℃条件下真空冷冻 18h， 得到竹荪醇提取物冻干粉， 如图 2 所示。
2、 上述制备的竹荪醇提取物的美白功效试验 - 对 L- 酪氨酸酶的活性抑制率实验
酪氨酸酶是黑素形成过程中主要的限速酶， 该酶的活性大小决定着黑素形成的数 量， 当前化妆品市场上的美白产品绝大多数以酪氨酸酶抑制剂为主。
L- 酪氨酸酶与其底物 L- 酪氨酸可以发生催化反应， 当在反应体系中添加有 L- 酪 氨酸酶活性抑制作用的试剂后， 对催化反应可以产生抑制作用， 通过测定添加有 L- 酪氨酸 酶活性抑制作用的试剂前后 475nm 处吸光度值的变化， 来评价该有 L- 酪氨酸酶活性抑制作 用的试剂对 L- 酪氨酸酶活性的抑制率。
具体实验过程如下 ：
1) 称取 17.91g 十二水磷酸氢二钠溶于 500mL 蒸馏水中， 得到溶液 a ； 称取 7.8g 二 水磷酸二氢钠溶于 500mL 蒸馏水中， 得到溶液 b ； 将 92.6mL 溶液 a 和 107.4mL 溶液 b 混合， 得到 200mL pH 为 6.8 的 PBS 缓冲溶液 ； 2) 称取 0.05g L- 酪氨酸， 先用少量 0.1mol/L 的盐酸溶解， 待其溶解后用上述配制 的 pH 为 6.8 的 PBS 缓冲液定容至 100mL ；
实验过程中， 各组中各物质的加入量如表 1 所示。
表 1 竹荪醇提取冻干粉对 L- 酪氨酸酶的活性抑制实验中各物质的加入量
注： C1 组和 T1 组均加入 0.5mL 酪氨酸酶， 酶活为 100U/mL。
3)C0 组各溶液配好摇匀后， 在 37℃水浴锅中水浴加热 10min， 波长 475nm 下调零。 C1 组溶液配好摇匀后， 37℃水浴 10min 后加入 0.5ml 酶活为 100U/mL 的酪氨酸酶， 继续水浴 10 分钟， 测定吸光度值。
4)T0 组各溶液配好摇匀后， 在 37℃水浴锅中水浴加热 10min， 波长 475nm 下调零。 T1 组溶液配好摇匀后， 37℃水浴 10min 后加入 0.5ml 酶活为 100U/mL 的酪氨酸酶， 继续水浴 10 分钟， 测定吸光度值。
5) 计算酪氨酸酶的活性抑制率 T(％ )， T(％ ) ＝ (C1-T1)/C1×100％。
实验设三次重复， 三次重复的平均结果如图 3 所示。结果表明， 当竹荪醇提物冻干
粉浓度为 2％时， 酪氨酸酶活性抑制率达到 79％， 随着浓度的增大， 抑制率也呈上升趋势， 当 3％浓度时， 抑制率达到 88％， 表明竹荪醇提取物具有良好的美白效果。
实施例 2、 竹荪醇提取物的制备及抗衰老功效试验
1、 制备竹荪醇提取物
1) 制备样品 ： 将竹荪粉碎 ( 粉碎设备 ： 多功能粉碎机 GX-04， 上海高翔食品机械 厂 ) 并过 80 目筛得到粉末， 置于通风干燥处保存， 备用， 称取竹荪粉末 100g ；
2) 加热提取 ： 将制备的竹荪粉末和体积百分含量为 90％的乙醇水溶液以 1 ∶ 40 的质量比混合搅拌均匀， 置于 85℃微沸条件 ( 加热设备 ： 电子调温电热器 98-1-B 型， 天津 市泰斯特仪器有限公司 ) 下回流提取 2.0h ；
3) 沉淀抽滤 ： 将提取液静置沉淀 1.0h， 用滤板进行抽滤 ( 抽滤设备 ： SHZ-III 型循 环水式多用真空泵， 上海知信实验仪器有限公司 ) 得到回收液 ；
4) 浓缩 ： 将 3700g 回收液置于 60 ℃条件下浓缩 ( 浓缩设备 ： 旋转蒸发器 RE2000 型， 上海亚荣生化仪器厂 ) 到 100g 浓缩液， 其中浓缩液与回收液的质量份数比为 1 ∶ 37， 并 采用固含仪 (ATAGO 数字式折射仪 PR-101α) 测定浓缩液中可溶性固形物含量为 50％ ；
5) 加入糊精 ： 向浓缩液中加入 3 倍于可溶性固形物质量的糊精 150g 得混合液 ；
6) 将混合液搅拌均匀， 充分溶解后， 放在冰箱中于 -60℃预冻成冰后， 再置于真空 冷冻干燥机中 ( 美国 VIRTIS 公司 )-70℃条件下真空冷冻 24h， 得到竹荪醇提取物冻干粉。
2、 上述制备的竹荪醇提取物的抗衰老功效试验 - 清除超氧阴离子自由基实验
取 0.05mol/L pH 8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 4.5ml， 置于 25 ℃水浴中预热 20min， 分别加入 1ml 不同浓度的上述制备的竹荪醇提取物冻干粉水溶液和 0.4ml 25mmol/L 的 邻苯三酚溶液， 混匀后于 25 ℃水浴中反应 5min， 加入 1.0ml 8mol/L 的 HCl 终止反应， 以 Tris-HCl 缓冲液作参比， 在 299nm 处测定吸光度， 计算清除率。
空白对照组以 1ml 去离子水代替样品， 每个处理均做三个重复。
清除率的计算公式 ： 超氧阴离子自由基清除率 (％ ) ＝ 100(A1-A2)/A1， 其中 A1 为 空白对照的平均吸光度， A2 为竹荪醇提取物冻干粉水溶液的平均吸光度。
上述制备的竹荪醇提取冻干粉对超氧阴离子自由基的清除作用的清楚率曲线如 图 4 所示 ； 结果表明， 竹荪醇提取冻干粉浓度为 3％时， 超氧阴离子自由基的清除率为 82％， 说明竹荪醇提取冻干粉具有显著的延缓衰老的功效。
实施例 3、 竹荪醇提取物的制备及美容功效试验
1、 制备竹荪醇提取物
1) 制备样品 ： 将竹荪粉碎 ( 粉碎设备 ： 多功能粉碎机 GX-04， 上海高翔食品机械 厂 ) 并过 70 目筛得到粉末， 置于通风干燥处保存， 备用， 称取竹荪粉末 100g ；
2) 加热提取 ： 将制备的竹荪粉末和体积百分含量为 85％的乙醇水溶液以 1 ∶ 35 的质量比混合搅拌均匀， 置于 85℃微沸条件 ( 加热设备 ： 电子调温电热器 98-1-B 型， 天津 市泰斯特仪器有限公司 ) 下回流提取 2.0h ；
3) 沉淀抽滤 ： 将提取液静置沉淀 1.0h， 用滤板进行抽滤 ( 抽滤设备 ： SHZ-III 型循 环水式多用真空泵， 上海知信实验仪器有限公司 ) 得到回收液 ；
4) 浓缩 ： 将 3200g 回收液置于 60 ℃条件下浓缩 ( 浓缩设备 ： 旋转蒸发器 RE2000 型， 上海亚荣生化仪器厂 ) 到 100g 浓缩液， 其中浓缩液与回收液的质量份数比为 1 ∶ 32， 并采用固含仪 (ATAGO 数字式折射仪 PR-101α) 测定浓缩液中可溶性固形物含量为 50％ ；
5) 加入糊精 ： 向浓缩液中加入 3 倍于可溶性固形物质量的糊精 150g 得混合液 ；
6) 将混合液搅拌均匀， 充分溶解后， 放在冰箱中于 -40℃预冻成冰后， 再置于真空 冷冻干燥机中 ( 美国 VIRTIS 公司 )-70℃条件下真空冷冻 36h， 得到竹荪醇提取物冻干粉。
2、 上述制备的竹荪醇提取物的美容功效试验 - 清除 DPPH 自由基 (DPPH·) 实验
DPPH· 是一种很稳定的以氮为中心的自由基， 若提取物能将其清除， 则表示提取物 具有降低羟自由基、 烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。 DPPH·在有机溶剂中非常稳定， 呈紫色， 在 517nm 处有一个特征吸收峰， 当其遇到自由基清 除剂时， DPPH· 的孤电子被配对， 使其颜色变浅， 在最大吸收波长处的吸光度变小。因此， 可 通过测定吸光度的变化来评价其对 DPPH·的清除效果。
准确称取 20mg DPPH·(sigma 公司 )， 用无水乙醇定容至 250ml 容量瓶中， 得到浓 度为 20mmol/L 的 DPPH· 溶液， 将上述制备的竹荪醇提取冻干粉分别用蒸馏水溶解成不同浓 度的测试液。分别取 2ml 不同浓度的测试液及 2ml 20mmol/L DPPH·， 混匀后反应 30min， 测定 517nm 波长下吸光度的变化， 对照溶剂用无水乙醇代替， 按下式计算抑制率。
抑制率 (％ ) ＝ [1-(Ai-Aj)/Ac]×100 ； 式中， Ai 为 2ml DPPH·溶液与 2ml 不同浓度的测试液组成的混合液的吸光度 ； Aj 为 2ml 不同浓度的测试液与 2ml 无水乙醇组成的混合液的吸光度 ； Ac 为 2ml DPPH· 溶液与 2ml 无水乙醇组成的混合液的吸光度。
上述制备的竹荪醇提取冻干粉对 DPPH·的清除作用的清除率曲线如图 5 所示， 从 图中可以看出， 随着浓度的增大， DPPH 自由基清除率也逐渐增大， 说明竹荪醇提取冻干粉清 除 DPPH 自由基效果显著， 具有抗衰老的美容功效。