重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶 技术领域 本发明涉及生物制品领域。 特别是涉及一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶 及其制备方法。
背景技术 皮肤是机体避免遭受感染和脱水的重要屏障， 严重创伤、 烧烫伤以及某些疾病例 如糖尿病引起的皮肤溃疡会给患者带来身体和精神上的巨大影响。因此， 对皮肤创面的修 复是医药领域十分关注的问题。
自上世纪末开始， 已对创伤后的组织修复过程、 发生机制和治疗等进行了多种研 究， 其中， 分子生物学的迅速发展以及各学科之间的相互交叉影响， 使创伤修复与组织再生 等水平得到不断提升。目前， 已构建了多种促进肉芽组织生长、 血管化和再上皮化的基因， 例如表皮细胞因子、 碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子等。
已发现碱性成纤维细胞生长因子 (Basic fibroblast growth factor， 简写为 bFGF) 在体内可参与多种组织的创伤修复过程， 是重要的创伤愈合因子之一， 它能诱导微血 管的形成、 发育和分化， 同时直接刺激成纤维细胞和细胞外基质的蛋白合成， 以形成胶原纤 维， 增加创面的抗张力强度， 并促进真皮细胞的移行、 分裂、 分化， 以完成皮肤的修复过程， 并能促进皮肤软骨组织、 骨组织和神经组织损伤修复和肢体再生。大量基础研究和临床试 验证实， bFGF 对烧伤、 外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用， 并且安全、 有效、 无不良反应。
重 组 牛 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 (Recombinant bovine basic fibroblast growth factor， 简写为 rb-bFGF) 是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大 肠杆菌， 经发酵、 分离和高度纯化后得到的活性因子。 rb-bFGF 可促进创面愈合， 用于烧伤创 面 ( 包括浅 II 度、 深 II 度、 肉芽创面 )、 慢性创面 ( 包括体表慢性溃疡等 ) 和新鲜创面 ( 包 括外伤、 供皮区创面、 手术伤等 )。
中国专利申请 200510036465( 申请人为南海朗肽制药有限公司 ) 公开了一种重 组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂， 其由重组人碱性成纤维细胞生长因子原液和可药用 辅料组成， 其中可药用辅料选自卡波姆 940NF、 透明质酸钠、 海藻糖、 甘露醇、 右旋糖酐 40、 肝素钠。中国专利申请 200510009218( 申请人为北京双鹭立医药科技有限公司 ) 公开了 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂， 其凝胶基质包括增稠剂 ( 选自重量百分比为 0.1-10％的羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 聚乙二醇、 卡波姆、 甲壳胺 )、 保湿剂、 防腐剂、 稳 定剂、 pH 调节剂和水。但是， 上述公开的两种凝胶剂中均使用了种类多、 用量大的辅料， 给 生产过程和制剂稳定性带来不可预料的困难。
因此， 需要开发一种 rb-bFGF 的凝胶剂， 其不仅使用的辅料简单， 并且具有较好的 稳定性和释放效果。
发明内容本发明要解决的技术问题对现有的 bFGF 凝胶剂进行改进， 提供一种经济实用、 稳 定性好的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。
本发明的发明目的通过以下的实施方式来实现。
一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶， 其特征在于所述凝胶的组分及用量 为：
重组牛碱性成纤维细胞生长因子 10000-30000IU ；
蛋白保护剂 0.5-2.5mg ；
凝胶基质 10-30mg ；
pH 调节剂 适量 ；
注射用水 加至 5ml ；
其中， 所述的蛋白保护剂选自人血白蛋白、 甘露醇和聚乙二醇， 优选人血白蛋白 ； 所述的凝胶基质选自羟丙基甲基纤维素和卡波姆， 优选羟丙基甲基纤维素和卡波姆 ； 所述 的 pH 调节剂为氢氧化钠或盐酸 ；
在一个优选的实施方式中， 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的组分及用量 为： 重组牛碱性成纤维细胞生长因子 21000IU ；
蛋白保护剂 1.5mg ；
凝胶基质 20mg ；
pH 调节剂 适量 ；
注射用水 加至 5ml ；
其中， 所述的蛋白保护剂为人血白蛋白 ； 所述的凝胶基质为羟丙基甲基纤维素和 卡波姆 ； 所述的 pH 调节剂为氢氧化钠或盐酸 ；
上述重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备方法包含以下步骤 ：
(1) 将凝胶基质用适量注射用水溶胀， 调 pH 值使形成透明凝胶， 然后在 121℃热压 灭菌， 冷却后备用 ；
(2) 将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和蛋白保护剂溶于适量的注射用水中， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 ；
(3) 在无菌条件下将步骤 (1) 得到的透明凝胶和步骤 (2) 得到的溶液混合均匀， 分 装即得。
优选的， 制备方法为 ：
(1) 将 10-30mg 凝胶基质用适量注射用水溶胀， 调 pH 值使形成透明凝胶， 然后在 121℃热压灭菌， 冷却后备用 ；
(2) 将 10000-30000IU 重组牛碱性成纤维细胞生长因子和 0.2-2.5mg 蛋白保护剂 溶于适量的注射用水中， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 ；
(3) 在无菌条件下将步骤 (1) 得到的透明凝胶和步骤 (2) 得到的溶液混合均匀， 分 装即得。
本发明与现有技术相比， 具有以下的优点和效果 ：
①本发明凝胶剂中的辅料种类少、 用量低， 减少了配伍禁忌和辅料可能给人体带 来的危害 ；
②本发明的凝胶剂释药速度适中、 作用持久， 能更加有效地促进创面愈合 ； ③本发明凝胶剂使用方便、 经济实用， 增加了病人的依从性。具体实施方式
下面结合本发明较佳的实施例做进一步的说明， 这些实施例应理解为不会限制本 发明的实施范围， 其变型及等同方式均被涵盖在本发明的保护范围内。
实施例 1 ：
处方 ：
具体制备方法为 ：
将卡波姆和用适量注射用水溶胀， 调 pH 值使形成透明凝胶， 然后在 121℃热压灭 菌， 冷却后备用 ； 将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 ； 在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液混合均匀， 分装即得。
实施例 2 ：
处方 ：
具体制备方法为 ：
将卡波姆、 羟丙基甲基纤维素和用适量注射用水溶胀， 调 pH 值使形成透明凝胶， 然后在 121℃热压灭菌， 冷却后备用 ； 将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶 于适量的注射用水中， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 ； 在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液 混合均匀， 分装即得。
实施例 3 ：
处方 ：
具体制备方法为 ：
将羟丙基甲基纤维素和用适量注射用水溶胀， 调 pH 值使形成透明凝胶， 然后在 121℃热压灭菌， 冷却后备用 ； 将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的 注射用水中， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 ； 在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液混合均匀， 分装即得。
试验例 1 ： rb-bFGF 外用凝胶促进表皮细胞生长及烧伤创面愈合的实验研究
1、 试剂及仪器 ： rb-bFGF ； 细胞培养箱 ； 流式细胞仪 ； 电脑图象分析系统。
2、 动物烧伤创面模型 ： 选 20-25kg 白色小猪 5 只， 在实验的前一天用刀片给动物的 背部去毛。制成直径为 2.5 厘米的圆形深 II°度烧伤创面 18 个 ( 烧伤深度由病理切片和 免疫组化分析证实 )。 每 3 个创面为一平行组， 以不含 rb-bFGF 的生理盐水用于创面作为阴 性对照组， 直接在创面涂 1％的磺胺嘧啶银霜作为阳性对照组。
3、 给药方式 ： 创面清创后， 阳性对照组的创面直接涂 1％的磺胺嘧啶银。其余各组 的实验均按双盲法进行， 创面在清创后， 涂抹实施例 1 的外用凝胶。以后 10 天每天以同样 的方法换药一次。
4、 创面愈合指标 ： 在每次换药时照相， 照片经电脑图象分析系统灰度积分来比较 分析创面愈合的程度， 创面面积越小， 表明愈合效果越好。
5、 结果 ：
表 1、 各样品涂抹前和涂抹 48 小时后的平均创面面积 (cm2)
本发明组 涂抹前 涂抹后
4.92 4.13 阳性对照组 4.95 4.52 阴性对照组 4.90 4.88从表 1 可以看出， 当分别涂抹本发明组、 阳性对照组和阴性对照组样品 48 小时后， 在倒置显微镜下可观察到， 含 rb-bFGF 的本发明组的平均创面面积小于不含 rb-bFGF 的对 照组。
表 2、 涂抹各样品后不同时间的平均创面面积 (cm2)
6102357242 A CN 102357251 本发明组 第0天 第2天 第4天 第6天 第9天 第 13 天
4.92 4.13 3.56 2.73 0.18 0.05说明书阴性对照组 4.90 4.88 4.63 4.11 2.49 1.895/6 页阳性对照组 4.95 4.52 4.01 3.49 2.02 0.83从表 2 可以看出， 本发明组连续应用于猪的深 II°烧伤创面 2 天后， 与对照组之间 外观有较明显的区别。用电脑图象分析技术分别计算伤后第 0、 2、 4、 6、 9、 13 天时的创面面 积， 实验结果显示在创面愈合过程中应用含 rb-bFGF 的本发明组的烧伤创面的愈合速率明 显大于对照组。 试验例 2 ： 稳定性研究
1、 高温高湿试验 ：
将实施例 1 的外用凝胶灌装于内涂层封口铝管中， 密封置于 40℃、 相对湿度 75％ 条件下进行加速实验， 分别于 1、 5、 10 天检测凝胶的含量、 pH、 外观、 涂展性、 无菌和离心试 验 (300r/min)。结果如下表 ：
表 3、 高温高湿结果
1天 含量 pH 外观 涂展性 无菌 离心试验
100.01％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层 5天 99.98％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层 10 天 99.85％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层结果表明， 本发明的外用凝胶在高温高湿试验中质量稳定。
2、 低温试验 ：
将实施例 2 的外用凝胶灌装于内涂层封口铝管中， 密封置于 4℃下进行实验， 分别 于 1、 3、 6 月检测凝胶的的含量、 pH、 外观、 涂展性、 无菌和离心试验 (300r/min)。结果如下 表：表 4、 低温试验结果1 个月 含量 pH 外观 涂展性 无菌 离心试验 99.97％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层 3 个月 100.02％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层 6 个月 99.95％ 7.0 无色透明 好 合格 无分层
结果表明， 本发明的外用凝胶在低温试验中质量稳定。8