一种提取大黄中总蒽醌的方法.pdf

本发明提供了一种提取大黄中总蒽醌的方法，本发明提供的方法由以下步骤组成：大黄粗粉加乙醇提取→乙醇提取液回收乙醇成浸膏→浸膏加水沉淀→沉淀物加盐酸/氯仿回流，冷却后分取氯仿层，除去氯仿得游离型蒽醌→浓缩上清液加乙醇至含醇量80％，用碱调PH沉淀，剩余溶液调PH至中性，除去乙醇后调PH至1.0～2.0，冷藏沉淀得结合型蒽醌→将游离型蒽醌和结合型蒽醌混合均匀，得大黄总蒽醌。通过本发明提供的方法简化了大黄总蒽醌提取的工艺，操作简便，缩短了生产周期；能较大程度保留结合型蒽醌，提高了大黄总蒽醌提取物中的结合型蒽醌占比。

权利要求书
1.  一种提取大黄中总蒽醌的方法，包括如下步骤：
(A)取大黄粗粉，用乙醇提取，得乙醇提取液；
(B)浓缩乙醇提取液至无醇味，得浸膏；
(C)浸膏加水混匀产生沉淀，分离沉淀，得到沉淀物和上清液；
(D)沉淀物采用盐酸/氯仿回流，冷却后分离氯仿层，氯仿层除去氯仿得游离型 蒽醌；
(E)浓缩上清液，加入浓乙醇至含醇量80％，加碱调节PH至不再产生沉淀，除 去沉淀，调节剩余溶液PH至6.0-7.0，除去乙醇，调节剩余溶液PH值至1.0-2.0， 低温冷藏得沉淀，除去溶剂，得到的固体即为结合型蒽醌；
(F)混合游离型蒽醌与结合型蒽醌，得大黄总蒽醌。

2.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：步骤(A)中 所述乙醇提取为乙醇加热回流提取，乙醇浓度为55％-95％，乙醇用量为药材量的 3-5倍，提取次数为3-5次，提取时间为30-60分钟/次。

3.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：步骤(B)中 所述浓缩为减压浓缩。

4.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：步骤(C)中 所述加水的加水量为浸膏体积的10-15倍。

5.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：步骤(D)中 所述盐酸/氯仿的体积为所述沉淀物体积的4-5倍。

6.  根据权利要求5所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：所述盐酸浓 度为8％。

7.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：步骤(E)中 所述碱为强碱，所述低温为2-4℃。

8.  根据权利要求1所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：
所述游离型蒽醌包括：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚；
所述结合型蒽醌包括：芦荟大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大 黄素‐8‐O‐葡萄糖苷。

9.  根据权利要求8所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：所述大黄总 蒽醌中总蒽醌含量超过50％。

10.  根据权利要求9所述的提取大黄中总蒽醌的方法，其特征在于：所述总蒽醌 中结合型蒽醌占比超过30％。

说明书一种提取大黄中总蒽醌的方法
技术领域
本发明涉及一种提取大黄中有效成分的方法，尤其涉及一种提取大黄中总蒽 醌的方法。
背景技术
大黄为蓼科植物唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)、掌叶大黄 (Rheum palmatum L.)或药用大黄(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根茎。 大黄中含有多种成分，包括蒽醌类、鞣质类、苯丁酮类、二苯乙烯等，其中蒽醌 类、鞣质类成分含量较高。大黄蒽醌类成分分游离型和结合型两种，统称大黄总 蒽醌，大黄中总蒽醌的含量约为2％～5％，其中游离型蒽醌仅占10～20％，游 离型蒽醌主要为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，结合型蒽 醌主要为上述5个游离型蒽醌与葡萄糖结合的苷，即游离型蒽醌与结合型蒽醌是 苷元和苷的关系(大黄炮制前后物质基础变化规律研究[D].李丽.北京：中国 中医科学院，2011)。
大黄蒽醌类成分具有多种药理活性，但游离型蒽醌和结合型蒽醌具有不同药 理活性(RP-HPLC-DAD同时测定大黄中9种有效成分的含量[J].程小丽，魏胜 利，刘春生，等.中国实验方剂学杂志，2013，19(18)：99-102)。近年来的 研究也表明，长期过量应用大黄可引起肝肾损害，其毒性成分也可能是其所含的 蒽醌类成分，但结合型蒽醌和游离型蒽醌的毒性也不一样，前者大于后者(炮制 对大黄化学成分和肝肾毒性的影响及其典型相关分析[J].王伽伯，马永刚，张萍， 等.药学学报，2009，44(8)：885-890)。因此，从大黄中提取总蒽醌或分别提取 结合型蒽醌和游离型蒽醌对研究大黄的药效、毒性及毒-效关系更有意义。
目前从大黄中提取蒽醌类成分的文献报道或公开的专利可分为提取总游离 蒽醌和提取总蒽醌两大类。从大黄中提取总蒽醌需分游离型蒽醌和结合型蒽醌两 个部分进行。游离型蒽醌的提取较为简单。结合型蒽醌的提取存在两个技术难点。
第一，结合型蒽醌和鞣质均为水溶性成分，需要经特殊处理才能去除鞣质。 通常去除鞣质的方法有：(1)大孔树脂吸附结合型蒽醌；(2)聚酰胺吸附鞣质； (3)明胶法或改良明胶法沉淀鞣质等。
第二，结合型蒽醌容易水解，提取过程中会转化为游离型蒽醌。现有技术中 提取分离工艺较为复杂，容易导致结合型蒽醌脱糖转化为其苷元(游离型蒽醌)， 最终得到的产物大部分为游离型蒽醌，导致提取大黄总蒽醌中的结合型蒽醌占比 低。
从目前涉及大黄总蒽醌提取的技术来看，多存在工艺繁琐、不易操作，结合 型蒽醌破坏严重，或者两者兼有等问题。
发明内容
为克服现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种提取大黄中总蒽醌的 方法，包括如下步骤：
(A)取大黄粗粉，用乙醇提取，得乙醇提取液；
(B)浓缩乙醇提取液至无醇味，得浸膏；
(C)浸膏加水混匀产生沉淀，分离沉淀，得到沉淀物和上清液；
(D)沉淀物采用盐酸/氯仿回流，冷却后分离氯仿层，氯仿层除去氯仿得游离型 蒽醌；
(E)浓缩上清液，加入浓乙醇至含醇量80％，加碱调节PH至不再产生沉淀，除 去沉淀，调节剩余溶液PH至6.0-7.0，除去乙醇，调节剩余溶液PH值至1.0-2.0， 低温冷藏得沉淀，除去溶剂，得到的固体即为结合型蒽醌；
(F)混合游离型蒽醌与结合型蒽醌，得大黄总蒽醌。
本发明进一步提供了上述技术方案的优选技术方案。
作为优选，步骤(A)中所述乙醇提取为乙醇加热回流提取，乙醇浓度为 55％-95％，乙醇用量为药材量的3-5倍，提取次数为3-5次，提取时间为30-60 分钟/次。
作为优选，步骤(B)中所述浓缩为减压浓缩。
作为优选，步骤(C)中所述加水的加水量为浸膏体积的10-15倍。
作为优选，步骤(D)中所述盐酸/氯仿的体积为所述沉淀物体积的4-5倍。
作为优选，所述盐酸浓度为8％。
作为优选，步骤(E)中所述碱为强碱，所述低温为2-4℃。
作为优选，所述游离型蒽醌包括：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、 大黄素甲醚；
所述结合型蒽醌包括：芦荟大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大 黄素‐8‐O‐葡萄糖苷。
作为优选，所述大黄总蒽醌中总蒽醌含量超过50％，其中总蒽醌中结合型蒽 醌占比超过30％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：简化了总蒽醌提取的工艺，操作简 便，缩短了生产周期；能较大程度保留结合型蒽醌，提高了大黄总蒽醌提取物中 的结合型蒽醌占比。
附图说明
图1是对照品高效液相色谱图；
图2是本发明实施例3制备的大黄总蒽醌的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例3制备的大黄总蒽醌的高效液相色谱图中20个色谱峰 紫外吸收光谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
取产自甘肃礼县掌叶大黄粗粉50g，加5倍量55％的乙醇，加热回流提取5 次，每次30分钟，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，并适当浓缩得浸膏，浸膏 冷却后加入10倍量去离子水，搅拌均匀，每分钟5000转离心10分钟，得上清 液A和沉淀A。上清液A适当浓缩，放冷后加入95％乙醇，使含醇量达80％， 加10％氢氧化钠溶液至不产生沉淀为止，每分钟5000转离心10分钟，取上清液 用盐酸调PH至6.0～7.0，减压回收乙醇，冷却后用盐酸调PH至1.0～2.0，至 4℃冰箱冷藏24～48小时，抽滤，滤饼真空干燥，得结合型蒽醌；沉淀A中加 入4～5倍8％盐酸及4～5倍氯仿加热回流1小时，冷却后过滤，滤液分取氯仿 层，滤饼加固体8％盐酸及氯仿重复操作5次，合并氯仿提取液，减压回收氯仿 后真空干燥，得游离型蒽醌。将游离型蒽醌和结合型蒽醌混合均匀，得大黄总蒽 醌。
定性定量分析结果：所得大黄总蒽醌高效液相色谱图标定主要色谱峰20个， 均具有大黄蒽醌类成分的紫外吸收特征，其中8个成分分别被鉴定为芦荟大黄素 ‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、芦荟大黄素、大 黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。大黄总蒽醌中总蒽醌的含量为54.78％， 结合型蒽醌占比为33.88％。
实施例2
取掌叶大黄粗粉50g，加3倍量75％的乙醇，加热回流提取4次，每次45 分钟，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，并适当浓缩得浸膏，浸膏冷却后加入 10倍量去离子水，搅拌均匀，每分钟5000转离心10分钟，得上清液A和沉淀 A。上清液A适当浓缩，放冷后加入95％乙醇，使含醇量达80％，加10％氢氧 化钠溶液至不产生沉淀为止，每分钟5000转离心10分钟，取上清液用盐酸调 PH至6.0～7.0，减压回收乙醇，冷却后用盐酸调PH至1.0～2.0，至4℃冰箱冷 藏24～48小时，抽滤，滤饼真空干燥，得结合型蒽醌；沉淀A中加入4～5倍 8％盐酸及4～5倍氯仿加热回流1小时，冷却后过滤，滤液分取氯仿层，滤饼加 固体8％盐酸及氯仿重复操作5次，合并氯仿提取液，减压回收氯仿后真空干燥， 得游离型蒽醌。将游离型蒽醌和结合型蒽醌混合均匀，得大黄总蒽醌。
定性定量分析结果：所得大黄总蒽醌高效液相色谱图标定主要色谱峰20个， 均具有大黄蒽醌类成分的紫外吸收特征，其中8个成分分别被鉴定为芦荟大黄素 ‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、芦荟大黄素、大 黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。大黄总蒽醌中总蒽醌的含量为56.27％， 结合型蒽醌占比为31.37％。
实施例3
取掌叶大黄粗粉50g，加4倍量95％的乙醇，加热回流提取3次，每次60 分钟，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，并适当浓缩得浸膏，浸膏冷却后加入 10倍量去离子水，搅拌均匀，每分钟5000转离心10分钟，得上清液A和沉淀 A。上清液A适当浓缩，放冷后加入95％乙醇，使含醇量达80％，加10％氢氧 化钠溶液至不产生沉淀为止，每分钟5000转离心10分钟，取上清液用盐酸调 PH至6.0～7.0，减压回收乙醇，冷却后用盐酸调PH至1.0～2.0，至4℃冰箱冷 藏24～48小时，抽滤，滤饼真空干燥，得结合型蒽醌；沉淀A中加入4～5倍 8％盐酸及4～5倍氯仿加热回流1小时，冷却后过滤，滤液分取氯仿层，滤饼加 固体8％盐酸及氯仿重复操作5次，合并氯仿提取液，减压回收氯仿后真空干燥， 得游离型蒽醌。将游离型蒽醌和结合型蒽醌混合均匀，得大黄总蒽醌。
定性定量分析结果：所得大黄总蒽醌高效液相色谱图标定主要色谱峰20个， 均具有大黄蒽醌类成分的紫外吸收特征，其中8个成分分别被鉴定为芦荟大黄素 ‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、芦荟大黄素、大 黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。大黄总蒽醌中总蒽醌的含量为59.43％， 结合型蒽醌占比为32.36％。
定性定量分析方法：
(1)色谱条件
Agilent TC-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为甲醇(A)-0.1％ 磷酸水(B)梯度洗脱(0～10min，5％～30％A；10～40min，30％～60％A；40～ 60min，60％A；60～70min：60％～100％A；70～80min，100％A)；流速1ml/min； 柱温30℃；二极管阵列检测器检测，提取紫外吸收光谱图定性，定量波长430nm。
(2)溶液制备
对照品溶液的制备：精密称取芦荟大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄 糖苷、大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲 醚适量，置量瓶中加甲醇溶解，配成以上8种对照品含量分别为0.0315、0.0204、 0.0098、0.0150、0.0098、0.0099、0.0263、0.0594mg/ml的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：取约相当于大黄药材0.2g的总蒽醌提取物，精密称定， 置100ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30分钟，使其溶解，放冷，加甲醇 稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液(剩余滤液备用)，即得。
总蒽醌供试品溶液的制备：精密量取“供试品溶液的制备”项下的剩余滤液 10ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液20ml，再加三氯甲烷20ml，加热 回流2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中， 分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷 液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻 度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)定性分析
分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪， 按“色谱条件”测定，提取430nm波长下的高效液相色谱图，标定主要吸收峰， 并提取其紫外吸收管谱图，参考相关文献，判定其是否具有大黄蒽醌成分紫外吸 收特征，进一步通过与8个对照品色谱图保留时间及紫外吸收光谱图比对，判定 是否存在芦荟大黄素‐8‐O‐葡萄糖苷、大黄酚‐1‐O‐葡萄糖苷、大黄素‐8‐O‐葡萄糖 苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚。
(4)定量分析
线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20、30μL， 注入高效液相色谱仪，按“色谱条件”进样测定，以峰面积值Y对进样量X(μg) 进行回归处理，得8种成分的回归方程及线性范围，见下表。
8种成分回归方程及线性范围

样品测定及含量计算：分别精密吸取供试品溶液、总蒽醌供试品溶液10μL， 注入高效液相色谱仪，按“色谱条件”测定，将各成分峰面积代入回归方程，计 算各其在样品中的含量。
总蒽醌含量＝总蒽醌供试品溶液测得的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄 酚及大黄素甲醚含量之和。
结合型蒽醌含量＝总蒽醌含量减去供试品溶液测得的芦荟大黄素、大黄酸、 大黄素、大黄酚及大黄素甲醚含量之和。
结合型蒽醌占比＝结合型蒽醌含量/总蒽醌含量×100％
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并 非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其 他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关 领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的 精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。