用于增加CFTR活性的方法.pdf

本披露提供了有效于增加受试者的粘液纤毛清除的化合物。在一个实施例中，该化合物具有通式I。本披露进一步显示，此类化合物有效于增加CFTR的激活，从而增加受试者的粘液纤毛清除。本披露进一步显示，此类化合物有效于增加ASL的深度，从而增加受试者的粘液纤毛清除。在上述每个中的一个实施例中，该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

权利要求书
1.  一种用于增加受试者的粘液纤毛清除的方法，该方法包括向受试者给予囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的激活剂的步骤，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。

2.  如权利要求1所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

3.  如权利要求1所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

4.  如权利要求1所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的获得性异常。

5.  如权利要求1所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

6.  如权利要求1所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物：

其中：
R1是＝O、OH或H；并且
R2和R3各自独立地是H、OH或取代的或未取代的C1-C7烷基。

7.  如权利要求1所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物


8.  如权利要求1所述的方法，其中所述治疗增加了气道上皮细胞功能的参数。

9.  如权利要求8所述的方法，其中此类参数是(ASL)的深度、顶侧纤毛液体(PCL)的深度、纤毛摆动频率(CBF)、粘液纤毛转运(MCT)的速率或以上的任意组合。

10.  如权利要求8所述的方法，其中此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。

11.  如权利要求10所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

12.  如权利要求10所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

13.  如权利要求1所述的方法，其中所述给予增加了CFTR的活性。

14.  一种用于治疗受试者的次优的粘液纤毛清除的方法，该方法包括向该受试者给予囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的激活剂的步骤，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。

15.  如权利要求14所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

16.  如权利要求14所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

17.  如权利要求14所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的获得性异常。

18.  如权利要求14所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

19.  如权利要求14所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物：

其中：
R1是＝O、OH或H；并且
R2和R3各自独立地是H、OH或取代的或未取代的C1-C7烷基。

20.  如权利要求14所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物


21.  如权利要求14所述的方法，其中所述治疗增加了气道上皮细胞功能的参数。

22.  如权利要求21所述的方法，其中此类参数是(ASL)的深度、顶侧纤毛液体(PCL)的深度、纤毛摆动频率(CBF)、粘液纤毛转运(MCT)的速率或以上的任意组合。

23.  如权利要求21所述的方法，其中此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。

24.  如权利要求23所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

25.  如权利要求23所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

26.  如权利要求14所述的方法，其中所述治疗增加了CFTR的活性。

27.  一种用于增强受试者的气道上皮细胞功能的参数的方法，该方法包括向该受试者给予囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的激活剂的步骤，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。

28.  如权利要求27所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

29.  如权利要求27所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

30.  如权利要求27所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的获得性异常。

31.  如权利要求27所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

32.  如权利要求27所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物：

其中：
R1是＝O、OH或H；并且
R2和R3各自独立地是H、OH或取代的或未取代的C1-C7烷基。

33.  如权利要求27所述的方法，其中该CFTR激活剂是具有下式的一种化合物


34.  如权利要求27所述的方法，其中此类参数是气道表面液体(ASL)的深度、顶侧纤毛液体(PCL)的深度、纤毛摆动频率(CBF)、粘液纤毛转运(MCT)的速率或以上的任意组合。

35.  如权利要求27所述的方法，其中此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。

36.  如权利要求27所述的方法，其中所述给予增加了MCT的速率。

37.  如权利要求27所述的方法，其中所述给予增加了ASL的深度。

38.  如权利要求27所述的方法，其中所述给予增加了PCL的深度。

39.  如权利要求27所述的方法，其中所述给予增加了CBF。

40.  如权利要求35所述的方法，其中该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。

41.  如权利要求35所述的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。

42.  如权利要求27所述的方法，其中所述给予增加了CFTR的活性。

说明书用于增加CFTR活性的方法
史蒂文·M·罗和马克·德雷恩斯菲尔德
披露领域
本披露涉及增强受试者的粘液纤毛清除的方法。在一个具体实施例中，本披露涉及增强受试者的粘液纤毛清除的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。
背景
粘液清除障碍(粘液淤滞)和粘液产生增加是影响许多人病症的常见问题。即使在正常上皮功能和正常运作的细胞粘液纤毛清除器官的背景中也是如此，因此粘液纤毛清除对该具体病症是次优的。许多疾病和/或病症可能会导致次优的粘液清除和/或过量的粘液生产。在这种情况下，粘液纤毛清除可被视为受损，即使在该细胞粘液纤毛清除器官中不存在缺陷或异常，因为正常运作的细胞粘液纤毛清除器官未被充分给予患者的潜在病症。
例如，患有由先天性或遗传性病症引起的神经肌肉疲软(例如但不限于肌肉萎缩、脊髓性肌萎缩、以及ALS)的个体遭受复发性肺炎，归因于导致粘膜淤滞的不良的咳嗽清除。此外，患有获得性解剖学问题导致肌肉无力(例如但不限于截瘫、四肢瘫痪、膈神经麻痹等)的个体遭受着同样的命运。其他受试者，如由于病症(例如但不限于哮喘和哮喘持续状态)遭受过量粘液产生的那些，由于病症(例如但不限于免疫球蛋白缺陷、SCID、高IgE综合征、以及类似病症)遭受受损的免疫的那些，遭受解剖学呼吸异常损害粘液清除的那些，和因为不明原因遭受复发性肺炎的那些 以及遭受口咽部异常的那些，遭受着肺不张和/或肺炎(归因于粘液产生过多压制了该粘液纤毛清除器官有效转运它的能力)。归因于或导致次优的粘液清除和/或粘液产生过多的这些障碍是严重的复发性问题，引起相当大的发病率，而且也导致死亡率的一个促因。因此，即使在其中粘液纤毛清除功能是正常的疾病中，粘液纤毛清除功能增强到超常水平也有利于对抗特定的疾病。
本领域缺乏增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能的化合物和治疗方法。本领域尤其缺乏增强受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能的化合物和治疗方法，该受试者在细胞粘液纤毛清除器官方面不具有先天性或遗传性缺陷和/或在细胞粘液纤毛清除器官方面不具有获得性异常。此类化合物和治疗方法将通过治疗由次优的粘液清除和/或粘液产生过量引起的病症和类似的病症，为那些受试者提供实质利益。
本披露为本领域中遇到的问题提供了一种解决方案，通过提供化合物和治疗方法来增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，以克服次优的粘液清除和/或粘液产生过量。此外，本披露为本领域中遇到的问题提供了一种解决方案，通过提供化合物和治疗方法诱导超常的粘液纤毛清除来增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，以克服次优的粘液清除和/或粘液产生过量。而且，本披露在受试者中提供了以上益处，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在一个实施例中，该次优的粘液清除和/或增加的粘液产生是由于或与神经肌肉疾病、解剖学呼吸异常、获得性解剖学问题相关联，导致肌肉疲软、解剖学疲软、哮喘和哮喘持续状态，相对易于呼吸感染(例如归因于受损的免疫)、和/或粘液产生过量。
附图简要说明
图1示出CFTR增效剂艾维卡夫特(ivacaftor)增强了野生型CFTR活性。
图1A示出了使具有和不具有野生型CFTR的互补表达的CFBE41o- 细胞在空气-液体界面生长，然后将其安装在尤斯(Ussing)室中，并在Cl-分泌梯度的背景下，在阿米洛利(amiloride)(100μM)和毛喉素(forskoiin)(100nM)之后，用艾维卡夫特(VX-770；10μM)或运载体对照进行刺激。将通过稳定表达WT-CFTR(通过慢病毒启动子)互补的CFBE41o-细胞与不具有WT CFTR互补的CFBE41o-细胞(亲本细胞)对比显示。*P<0.05，**P<0.005，n＝5/条件。
图1B示出将细胞的代表性Isc跟踪依次暴露于在阿米洛利(100μM)背景下的毛喉素(100nM)和艾维卡夫特(VX-770；10μM)或运载体对照，随后是CFTR Inh-172(10μM)。
图2示出该CFTR增效剂艾维卡夫特增强ASL深度并增加粘液纤毛清除。
图2A示出在测定前将运载体对照或艾维卡夫特(VX-770；1.0μM)暴露于基底外侧隔室24h后来源于HBE细胞的表面的代表性Z-扫描共聚焦图像。白比例尺指定10μm。
图2B示出来自示于图2A中的实验的汇总数据。**P<0.005，n＝10/条件。虚线表示使用完全相同的方法的一组CF HBE细胞的ASL深度。
图2C显示来源于在时间＝0h测量后立即将HBE细胞、艾维卡夫特(VX-770；10μM)或运载体对照添加到用cAMP激动剂VIP(30nM)共刺激的单层的基底外侧隔室的粘液纤毛传输速率。**P<0.001，相对于运载体对照，n＝10个粒子/条件。
图2D示出将完全分化的HBE细胞暴露于CSE(2％)或顶上地暴露于运载体(具有2％DMSO的介质)和VX-770(10μM)或基底外侧地暴露于运载体(0.1％，DMSO)24小时的代表性的SD-OCT图像。ASL深度显示为红色条。白比例尺＝10μm。
图3示出CFTR增效剂艾维卡夫特增强了野生型CFTR活性。
图3A显示来自于正常人类受试者的支气管在切割粘膜层之后，然后在电压钳位条件下安装在尤斯室并浸入匀称的林格氏溶液的代表性Isc跟踪。显示了顺序添加阿米洛利(100μM)、毛喉素(100nM)和艾维卡夫 特(VX-770；10μM)或运载体对照，随后添加ATP(10μM)和CFTR Inh-172(10μM x 2)作为对照添加。
图3B示出来源于示于图3A中的实验的汇总数据。示出了在添加艾维卡夫特(VX-770)或运载体对照后的Isc的变化。*P<0.05，n＝19，24个样品/条件。
图4通过μOCT示出CFTR激活剂对人支气管上皮细胞中的气道上皮功能的影响。含有缺陷型CFTR的对照HBE细胞(指定的对照，CF)以及含有WT-CFTR的HBE细胞(指定对照和VX-770，野生型)仅接受运载体(对照；0.2％DMSO)或艾维卡夫特(10μM)。小图A-D显示ASL深度(A)、PCL深度(B)、纤毛摆动频率(C)、和粘液纤毛转运(MCT)速率(D)，如从μOCT图像量化的。
图5通过μOCT示出CFTR激活剂对人支气管上皮细胞中的气道上皮功能的影响。小图A显示了将完全分化的HBE细胞暴露于运载体(对照；具有2％DMSO的介质)、CSE(2％)、CSE(2％)和艾维卡夫特(10μM)或仅艾维卡夫特(10μM；0.1％DMSO)的代表性μOCT图像。顶上地给予CSE并且基底外侧地给予艾维卡夫特。将细胞暴露于每种条件24小时。ASL深度显示为暗条。白比例尺＝10μm。小图B-D显示ASL深度(B)、纤毛摆动频率(C)、和粘液纤毛转运(MCT)速率(D)，如从μOCT图像量化的。数据来源于每孔5个测量以及3孔每个条件。
图6通过μOCT示出CFTR激活剂对人支气管组织中的气道上皮功能的影响。小图A-C分别显示ASL深度、CBF和MCT。小图A-C分别显示响应于艾维卡夫特处理(10μM)的ASL深度、CBF和MCT。
图7通过μOCT示出CFTR激活剂对完整的猪气管中的气道上皮功能的影响。小图A和B显示关于CFTR-/-(小图A)和CFTR+/+(小图B)动物的代表性的μOCT图像。小图C-F分别显示ASL深度、PCL深度、CBF和MCT测量，来源于来自CFTR-/-和CFTR+/+动物的μOCT图片。小图G和H显示响应于艾维卡夫特(10μM)、毛喉素(100nM)和乙酰胆碱(100μM)的连续药物干预的上皮功能参数，即CFTR-/-和CFTR+/+ 动物的ASL深度和MCT。
详细说明
粘液纤毛转运及气道表面的功能是人呼吸系统活性研究的一个领域。在健康的气道中，一层纤毛连续转运气道粘液，这是抵御颗粒污染和生物入侵者的一个至关重要的机制。
粘液纤毛清除的缺陷是现有技术中已知的。一个常见的实例是囊性纤维化(CF)。CF是由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的突变引起的。CFTR是主要表达于外分泌组织中的上皮阴离子通道。在编码CFTR的基因中的突变是CF的近因。在肺中，CFTR功能的损失导致气道表面液体(ASL)损耗、粘液增稠、粘液纤毛清除降低、慢性细菌感染、和过量的炎症。随着时间的推移，由于呼吸道分泌物浓缩和支气管扩张，肺梗阻随之而来，导致呼吸衰竭。
CF和其他影响粘液纤毛清除的病症是由粘液纤毛清除器官的先天性缺陷引起，例如但不限于CFTR。增加患有CFTR的先天性缺陷的受试者的CFTR活性的化合物是本领域已知的。
然而，本披露基于增强患有次优的粘液纤毛清除和/或粘液产生过量的受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，并基于在其中受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常的受试者中增强患有次优的粘液纤毛清除和/或粘液产生过量的受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能。其结果是，该粘液纤毛清除器官的功能得到改善。
增加或增强细胞粘液纤毛清除器官的活性具有重要的临床意义，即使在不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常的个体中。细胞粘液纤毛清除器官中的一个重要成员是CFTR。如上所讨论的，CFTR的突变可以导致次优的粘液清除。在一个实施例中，本披露采用增加不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷和/或获得性异常的受试者的CFTR的活性和/或功能的化合物以增强受试者 的粘液纤毛清除。在一个实施例中，粘液纤毛清除被增强到超常水平。最近，CFTR增效剂艾维卡夫特(KalydecoTM，VX-770)近日被批准用于具有G551D-CFTR门控突变的CF患者，基于第2和第3阶段试验中的显着改善(拉姆齐(Ramsey)BW等人，新英格兰医学杂志(The New England Journal of Medicine)2011；365：1663-1672；阿库尔索(Accurso)FJ等人，新英格兰医学杂志2010；363：1991-2003)。艾维卡夫特通过加强cAMP介导的CFTR的通道门控强力地增强阴离子分泌(范古尔(Van Goor,F.)等人，美国科学院院报2009；106：18825-18830)，导致增加的气道流体分泌。
本披露基于通过增加受试者的细胞粘液纤毛清除器官的一个组件的活性来增强受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能。在一个实施例中，该细胞粘液纤毛清除器官的组件是CFTR。在一个实施例中，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。在另一个实施例中，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在另一个实施例中，该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。
在一个实施例中，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于神经肌肉疾病或与之有关。神经肌肉疾病可能由先天性或获得性遗传病症例如但不限于肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩、ALS引起或与之有关。
在另一个实施例中，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于导致肌肉无力的获得性解剖问题或与之有关。导致肌肉无力的此类获得性解剖学问题可以由病症如但不限于截瘫、四肢瘫痪、和膈肌麻痹引起或与之有关。
在仍另一个实施例中，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于过量粘液产生或与之有关。此类过量粘液产生可通过病症如但不限于哮喘和哮喘持续状态引起或与之有关。
在仍另一个实施例中，受试者的粘液纤毛清除是正常的，但由于免疫缺陷该受试者遭受呼吸道感染的增加的发病率。呼吸道感染的风险可以通过粘液纤毛清除的增强降低。
在上述实施例的任一个中，该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在上述的一个实施例中，粘液纤毛清除被增强到超常水平。在上述的一个实施例中，细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常可能是由于环境因素，例如但不限于吸烟或慢性阻塞性肺病。
化合物
在此处所披露的方法中有用的化合物包括该细胞粘液纤毛清除器官的任何已知激活剂。在一个实施例中，此类激活剂是CFTR激活剂化合物。在一个实施例中，该CFTR激活剂是CFTR增效剂。已知的CFTR增效剂包括但不限于蒽-9-羧酸(9-蒽甲酸)、焰红染料B、苯并咪唑酮类似物NS004和NS1619、染料木黄酮、7-正丁基-6-(4-羟基苯基)[5H]吡咯并[2,3-b]吡嗪(aloisine A)、2-(2-(1H-吲哚-3-基)-N-甲基乙酰胺基)-N-(4-异丙基苯基)-2-苯基乙酰胺(PG01)、N-环庚基-6-(N-乙基-N-苯基氨磺酰基)-4-氧-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(SF01)，磺酰胺6-(N-乙基-N-苯基氨磺酰基)-N-(2-甲氧基苄基)-4-氧-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(SF03)、辣椒素和姜黄素。
在一个实施例中，该化合物是具有以下通式I的化合物。

在此结构中，R2和R3各自独立地是H、OH或取代的或未取代的C1-C7烷基链，并且R1是OH或H。
如此处使用的，术语“烷基”，无论单独或作为取代基或连接基团的部分使用，包括含有从1至4个碳原子的直链烃基。因此该短语包括直链烷基，例如甲基、乙基、丙基等。该短语还包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于以举例的方式提供的以下各项：-CH(CH3)2、-C(CH3)3、 -CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、以及其他。该短语还包括环烷基，例如环丙基和环丁基。
在一个实施例中，R2和R3中每个是-C(CH3)3并且R1是OH。
在一个具体实施例中，该化合物是艾维卡夫特(VX-770)，并具有II中所示的结构。

在一个实施例中，该CFTR激活剂化合物是CFTR增效剂。在另一个实施例中，该CFTR激活剂化合物是具有通式I的化合物。在仍另一个实施例中，该CFTR激活剂化合物是艾维卡夫特(VX-770)。
在另一个实施例中，该CFTR激活剂化合物是罗氟司特及通过cAMP的升高激活CFTR的其他PDE类似物。
在另一个实施例中，该CFTR激活剂是类黄酮，如异黄酮(例如染料木黄酮、槲皮素等)。
在另一个实施例中，该CFTR激活剂是cAMP或PKA的一种激动剂。
在另一个实施例中，该试剂可激活阴离子转运的其他调节剂，如钙激活的氯离子通道。
治疗方法
本披露表明，该细胞粘液纤毛清除器官的激活剂，例如但不限于CFTR激活剂，有效于增强受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能。因此，此类化合物有效于治疗受试者次优的粘液纤毛清除。在一个实施例中，此类化合物是具有通式I的化合物。本披露进一步表明，有效于增加CFTR的活性和/或功能的化合物有效于增强受试者的粘液纤毛清除和/或气道上 皮细胞功能，从而增加受试者的粘液纤毛清除。即使在粘液纤毛器官被认为正常运行的情况下上述益处也被实现。在一个实施例中，此类化合物通过增强该粘液纤毛清除器官的一个组件将受试者的粘液纤毛清除诱导到超常的水平。
本披露进一步表明，此类化合物有效于增加气道上皮细胞功能的参数。气道上皮细胞功能的有关参数包括但不限于气道表面液体(ASL)、顶侧液体的深度(PCL)、纤毛摆动频率(CBF)和粘液纤毛转运(MCT)的速率。在一个实施例中，气道上皮细胞功能的单个参数增加。在一个替代实施例中，气道上皮细胞功能的两个或多个参数增加。在一个替代实施例中，气道上皮细胞功能的三个或多个参数增加。在一个替代实施例中，气道上皮细胞功能的所有四个更多参数增加。在一个具体实施例中，MCT的速率增加。在一个具体实施例中，ASL的深度增加。在具体实施例中，ASL的深度和MCT的速率增加。在另一个具体实施例中，ASL的深度、CBF和MCT的速率增加。在另一个具体实施例中，ASL的深度、PCL的深度和MCT的速率增加。在另一个具体实施例中，ASL的深度、PCL的深度、CBF和MCT的速率增加。在另一个具体实施例中，粘液粘度被改善(即减少)，作为气道上皮细胞功能的参数增加的结果。在某些实施例中，粘液粘度被改善而气道上皮细胞参数例如ASL的深度、PCL的深度或CBF没有明显差异或相应的提高。粘液粘度的改善可能是由于通过CFTR或钙激活的氯离子通道增加了流体和/或碳酸氢盐转运。
作为增加气道上皮细胞功能的一个或多个参数的结果，受试者的粘液纤毛清除被增强。在一个实施例中，粘液纤毛清除被增强到超常水平。在上述各项的一个实施例中，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。在上述的一个实施例中，该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。在上述的一个实施例中，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在上述的一个实施例中，该受试者不具有CFTR的获得性异常。
在一个实施例中，本披露提供了用于治疗受试者的次优的粘液纤毛清除的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛 清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了气道上皮细胞功能的一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的粘液纤毛清除的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了气道上皮细胞功能的一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的CFTR的活性的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给 予增加了气道上皮细胞功能的一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。
在另一个实施例中，本披露提供了用于改善受试者的粘液的粘度(即降低粘液的粘度)的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。用于确定粘液的粘度的方法是本领域中已知的，并且包括在光漂白和粒子跟踪微观流变学后的原位荧光。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的一个实施例中，粘液粘度被改善，作为增加气道上皮细胞功能的参数例如但不限于ASL的深度、PCL的深度、CBF和MCT的速率的结果。在该方法的一个实施例中，粘液粘度被改善而气道上皮细胞参数例如ASL的深度、PCL的深度或CBF没有明显差异或相应的提高。在此类实施例中，粘液粘度的改善可能是由于通过CFTR或钙激活的氯离子通道的激活增加了流体和/或碳酸氢盐转运。
在另一个实施例中，本披露提供了用于在受试者中增强气道上皮细胞功能的参数的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数 是增加ASL的深度。在另一个方面，此类参数是增加MCT的速率。在仍另一个方面，此类参数是增加ASL的深度和增加MCT的速率。在仍另一个方面，此类参数是增加ASL的深度、增加PCL的深度、增加CBF、增加MCT的速率或上述的组合。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的MCT的速率的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了MCT的速率并且除此之外增加了气道上皮细胞功能的另一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的ASL的深度的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了ASL的深度并且除此之外增加了气道上皮细胞功能的另一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是MCT的速率。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的PCL的深度的方 法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了PCL的深度并且除此之外增加了气道上皮细胞功能的另一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。
在另一个实施例中，本披露提供了用于增加受试者的CBF的方法。此类方法包括向受试者给予一个量的、能够增强细胞粘液纤毛清除器官的活性的激活剂化合物的步骤。在一个实施例中，此类激活剂化合物是CFTR激活剂或其药理学上可接受的盐。在一个实施例中，这种给予增强了CFTR的活性和/或功能。在另一个实施例中，该激活剂化合物直接或间接地激活了其他阴离子转运机制，例如但不限于钙激活的氯离子通道。在该方法的另一个实施例中，这种给予增强受试者的粘液纤毛清除。在该方法的另一个实施例中，这种给予将受试者的粘液纤毛清除增强到超常水平。在该方法的仍另一个实施例中，这种给予增加了CBF并且除此之外增加了气道上皮细胞功能的另一个参数。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是ASL的深度、MCT的速率或以上的一个组合。
在上述方法的一个方面，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷。在上述方法的另一个方面，该受试者不具有该细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在上述方法的仍另一个方面，该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。在上述方法的仍另一个方面，该受试者不具有CFTR的先天性或遗传性缺陷。在上述方法的仍另一个方面，该受试者不具有 CFTR的获得性异常。
在上述方法的一个方面，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于神经肌肉疾病或与之有关。神经肌肉疾病可能由先天性或获得性遗传病症例如但不限于肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩、ALS引起或与之有关。
在上述方法的另一个方面，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于导致肌肉无力的获得性解剖问题或与之有关。导致肌肉无力的此类获得性解剖学问题可以由病症如但不限于截瘫、四肢瘫痪、和膈肌麻痹引起或与之有关。
在上述方法的仍另一个方面，受试者的粘液纤毛清除是正常的，但由于免疫缺陷而遭受呼吸道感染的增加的发病率。呼吸道感染的风险可以通过粘液纤毛清除的增加而降低。
在上述方法的又另一个方面，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于过量粘液产生或与之有关。此类过量粘液产生可通过病症如但不限于哮喘和哮喘持续状态引起或与之有关。
在上述方法的仍另一个方面，受试者的次优的粘液纤毛清除归因于环境因素或与之有关。此类环境因素包括但不限于吸烟。
在上述方法的一个方面，该化合物是一种CFTR激活剂化合物。在上述方法的另一个方面，该CFTR激活剂是CFTR增效剂。在上述方法的仍另一个方面，该CFTR激活剂化合物是具有通式I的化合物中的一种化合物。在上述方法的又另一个方面，该CFTR激活剂化合物是艾维卡夫特(VX-770)。在上述方法的另一个方面，该CFTR激活剂是一种cAMP升高激动剂，例如但不限于罗氟司特。在上述方法的另一个方面，该CFTR激活剂化合物是通过cAMP的升高激活CFTR的一种PDE类似物。在上述方法的另一个方面，该CFTR激活剂是类黄酮，例如但不限于一种异黄酮。适合的异黄酮包括但不限于染料木黄酮和槲皮素。在上述方法的另一个方面，该CFTR激活剂是cAMP或PKA的一种激动剂。在上述方法的另一个方面，该化合物激活其他阴离子转运，例如但不限于钙激活的氯离子通道。
在上述方法的仍另一个方面，该化合物可以单独或作为如此处所述的药物组合物的部分给予。可给予本披露的一种单独的化合物，或可给予本披露的多种化合物。在该实施例的一个方面，该化合物是具有通式I的化合物。此外，在上述方法的仍另一个方面，所给予的化合物是艾维卡夫特(VX-770)。
在上述方法的仍另一个方面，该受试者被确定为需要此类治疗。在上述方法的仍另一个方面，以治疗有效量给予该化合物。
在上述方法的又另一个方面，该受试者可以是哺乳动物。在某些实施例中，该受试者是人类。
在上述方法的仍另一个方面，可进一步用一种或多种另外的活性剂治疗所治疗的受试者。该一种或多种另外的活性剂和此处所述的化合物或其药学上可接受的盐或其前药，能以单个组合物或按任何顺序(包括同时给予，以及在时间上相隔高达几天的顺序)以分开的组合物给予。该方法还可以包括一次以上单独给予该一种或多种另外的活性剂和/或此处所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药。给予该一种或多种另外的药剂和此处所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药可以通过相同或不同的途径并同时或顺序地进行。
在上述方法的仍另一个方面，本披露的化合物是以75-750mg/天的剂量给予。本披露的化合物可以每天一次、每天两次或每天两次以上给予。在一个实施例中，该化合物是艾维卡夫特(VX-770)，并且该化合物是以每天1-2次、300mg/天的总剂量给予的。
药物组合物
提供了药物组合物，该药物组合物包括一个量的、本披露的化合物。在一个实施例中，此类药物组合物含有治疗有效量的一种化合物。在具体实施例中，该化合物是具有通式I的化合物，例如但不限于艾维卡夫特(VX-770)。此外，其他活性剂可以被包括在此类药物组合物中。基于待治疗的疾病或病症，可以选择待被包括在内的另外的活性剂。
所披露的药物组合物可以包括本披露的一种或多种化合物，单独或与 另外的活性剂组合，与一种药学上可接受的载体组合。此类载体和配制方法的实例可以在以下中找到：雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第20版，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins)，丹尼尔林姆(Daniel Limmer)编辑)。此类药物组合物可以在用于在本文所述的治疗和预防方法中使用的药物的制造中使用。处于两种游离形式和药学上可接受的盐的形式的本披露的化合物是有用的。
本文所述的药学上可接受的载体，包括但不限于，运载体、辅助剂、赋形剂、或稀释剂，是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的赋形剂也是本领域的普通技术人员所熟知的。赋形剂的选择将部分地由一种或多种具体化合物以及由用于给予该组合物的具体方法来确定。因此，存在多种本发明的药物组合物的适合的配制品。以下方法和赋形剂只是示例性的而决不是限制性的。适合的载体和赋形剂包括溶剂(例如水、乙醇、丙二醇)、固体吸收剂和稀释剂、表面活性剂、悬浮剂、压片粘合剂、润滑剂、矫味剂和着色剂。该药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质。典型地，该药学上可接受的载体对该组合物中的活性剂而言是化学惰性的，并在使用条件下不具有有害副作用或毒性。
本披露的化合物和包含如在本披露中所述的此类化合物的药物组合物可以通过可用于与药物结合使用的任何常规方法进行给予，作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合。
在一个实施例中，本披露的化合物是以治疗有效量给予的，不论是单独或作为药物组合物的一部分。给予的治疗有效量和剂量当然应取决于已知的因素，如具体的药剂的药效特征和其给予方式和途径，接受者的年龄、健康和体重，疾病状态或病症的严重度和阶段，同时治疗的种类，治疗的频率，和所希望效果。
所给予的化合物的总量也应通过给予的途径、定时和次数以及可能伴随该化合物的给予的任何不良副作用的存在、性质和程度以及所希望的生理学效果来确定的。本领域普通技术人员会理解，各种病症或疾病状态，特别是慢性病症或疾病状态，可能需要涉及多次给予的长期治疗。
在这些药物组合物中，本披露的一种或多种化合物通常可以按基于该组合物的总重量的约0.5％-95％重量的量存在。多剂量剂型可以作为单一治疗的一部分给予。
该活性剂能以固体剂型如胶囊剂、片剂和粉剂，或液体剂型如牛奶、酏剂、糖浆和悬浮液经肠内给予。它也能以无菌液体剂型经肠道外给予。本披露的一种或多种化合物也可经鼻内(滴鼻液)或通过肺系统吸入(如通过基于推进剂的定量吸入器或干粉吸入装置)给予。其他剂型是潜在可能的，如透皮给予，通过贴剂机制或软膏。
适合于肠内或口服给予的配制品可以是液体溶液，例如溶解在稀释剂如牛奶、水、盐水、缓冲溶液、婴儿配方奶粉、其他适合的载体、或其组合中的治疗有效量的这种或这些化合物。然后可以在给予前将这种或这些种化合物混合到该稀释剂中。在一个替代实施例中，适合于肠内或口服给予的配制品可以是胶囊、香囊、片剂、锭剂、以及糖锭。在每个实施例中，该配制品可含有预定量的本披露的一种或多种化合物，作为固体或颗粒剂、粉剂、悬浮液和适合的乳液。液体配制品可以包括稀释剂如水和醇，例如乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油和聚乙烯醇，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂、或乳化剂。胶囊形式可以是具有普通的硬壳或软壳的明胶类型，包含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可包括以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸，以及其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和药理学上相容的载体。
锭剂形式可以包括调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)中的活性成分，以及包括惰性基质(如明胶和甘油、或蔗糖和阿卡迪亚)中的活性成分的软锭剂，除了活性成分外含如本领域中已知的这些载体的乳剂和凝胶。
适合于肠胃外给予的配制品包括水性和非水性的、等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该配制品与患者的血液等渗的溶 质，以及水性和非水性无菌悬浮液，该无菌悬浮液可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。这种或这些种化合物可以在生理学上可接受的稀释剂，在药学上可接受的载体中进行给予，例如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、水性右旋糖和有关的糖溶液，醇如乙醇、异丙醇、或十六醇，二醇如丙二醇或聚乙二醇(如聚(乙二醇)400)，甘油缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇，醚，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化的脂肪酸甘油酯(添加或不添加药学上可接受的表面活性剂如皂或洗涤剂)，悬浮剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素，或乳化剂和其他药用辅助剂。
可以在肠胃外配制品中使用的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物。用于在肠胃外配制品中使用的适合的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合的脂肪酸酯的实例。用于在肠胃外配制品中使用的适合的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且适合的洗涤剂包括(a)阳离子型洗涤剂，例如像二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶鎓，(b)阴离子型洗涤剂，例如像烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐，以及磺基琥珀酸酯，(c)非离子型洗涤剂，例如像脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺、和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如像烷基β-氨基丙酸盐以及2-烷基咪唑啉季铵盐，以及(e)其混合物。
该肠胃外配制品典型地在溶液中包含按重量计的从约0.5％至约50％的这种或这些种化合物。可以在此类配制品中使用适合的防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有一种或多种具有从约12到约17的亲水亲油平衡(HLB)的非离子表面活性剂。在此类配制品中的表面活性剂的量按重量计从约5％至约15％变化。适合的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯和具有疏水基的氧化乙烯的高分子量加合物(由氧化丙烯与丙二醇缩合形成)。
本披露的一种或多种化合物可以被配制成气溶胶配制品，以经鼻或肺吸入给予。这些气溶胶配制品可置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟 甲烷、丙烷和氮气。此类气溶胶配制品可以通过定量吸入器给予。它们也可以被配制成药物用于非加压配制品，如在喷雾器或雾化器中。
本披露的一种或多种化合物(单独或与其他适合的组分组合)可以在水溶液中作为鼻或肺喷雾给予，并且可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法以喷雾形式分配。用于分配作为鼻喷雾的液体的系统在美国专利号4,511,069中披露。该配制品可以存在于多剂量容器中，例如在密封分配系统(披露于美国专利号4,511,069中)中。另外的气溶胶递送形式可包括例如压缩的空气式、喷气式、超声波式-和压电式喷雾器，其递送溶解或悬浮于药用溶剂如水、乙醇或其混合物中的活性剂。
本发明的鼻和肺的溶液典型地包括该药物或待递送的药物，任选地用表面活性剂如非离子表面活性剂(如聚山梨醇酯-80)和一种或多种缓冲剂配制。在本发明的一些实施例中，该鼻喷雾溶液进一步包括一种推进剂。该鼻喷雾溶液的pH值任选地是约pH 3.0和6.0之间，优选4.5.+-.0.5。用于在这些组合物中使用的适合的缓冲液是如上所述的或如本领域中另外已知的。可添加其他组分以增强或保持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂、或气体。适合的防腐剂包括但不限于苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、间甲酚、硫柳汞、氯丁醇、苄基酮氯化鎓(benzylalkonimum chloride)等。适合的表面活性剂包括但不限于油酸、脱水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱、以及各种长链甘油二酯和磷脂。适合的分散剂包括但不限于乙二胺四乙酸等。适合的气体包括但不限于氮、氦、氯氟烃(CFC)、氢氟烃(HFC)、二氧化碳、空气等。
在替代实施例中，鼻和肺配制品是作为用于鼻内递送的干粉配制品给予的，该配制品包括处于干燥(通常是冻干的)的形式的具有适合的粒径或在适当的粒径范围内的活性剂。适合于鼻或肺通道内的沉积的最小粒径通常是约0.5μm质量中值等效空气动力学直径(MMEAD)，一般是约1μm MMEAD，并且更典型约2μm MMEAD。适合于鼻通道内的沉积的最大粒径通常是约10μm MMEAD，一般是约8μm MMEAD，并且更典型约4μm MMEAD。这些尺寸范围内的鼻内和肺地可吸入的粉末可通过多种常规技 术例如喷射研磨、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体缩合等来制造。这些具有适当MMEAD的干燥粉末可以通过常规的干燥粉末吸入器(DPI)来给予患者，其经肺或鼻吸入后依赖于患者的呼吸，以将该粉末分配为雾化量。可替代地，该干燥粉末可以通过空气辅助装置来给予，该空气辅助装置使用一个外部动力源以将该粉末分配为雾化量，例如活塞泵。
为了配制用于经鼻或肺递送的组合物，可将该活性剂与各种药学上可接受的添加剂以及基质或载体进行组合，用于分配这种或这些活性剂。所希望的添加剂包括但不限于pH值控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸、等等。此外，可以包括局部麻醉药(如苯甲醇)、等渗剂(如氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制剂(如吐温80)、溶解增强剂(如环糊精及其衍生物)、稳定剂(如血清白蛋白)和还原剂(如谷胱甘肽)。当用于鼻或肺递送的组合物为液体时，该配制品的张力，如参照0.9％(w/v)生理盐水溶液作为单位的张力测量的，典型地被调整到一个值，在该值处在鼻粘膜给予部位不会诱导实质性的、不可逆的组织损伤。通常，该溶液的张力被调节至约1/3至3、更典型地1/2至2、并且最常地是3/4至1.7的值。
本披露的一种或多种化合物可以被分散在一种基质或运载体中，该基质或运载体可包括具有分散该活性剂和任何所希望的添加剂的能力的亲水化合物。该基质可以从范围广泛的适合的载体中选择，包括但不限于多元羧酸或其盐、羧酸酐(如顺丁烯二酸酐)与其他单体(例如甲基丙烯酸(甲)酯、丙烯酸等)的共聚物，亲水性乙烯基聚合物如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，纤维素衍生物如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等，以及天然聚合物如脱乙酰壳多糖、胶原蛋白、藻酸钠、明胶、透明质酸、和其无毒的金属盐。通常，可生物降解的聚合物被选择为一直基质或载体，例如聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-羟基乙酸)共聚物及其混合物。替代地或另外地，合成的脂肪酸酯，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等可以用作载体。亲水性聚合物和其他载体可单独使用或组合使用，并且可通过部分结晶、离子键合、交联等来赋予该载体增强的结构完整性。能以各种形式提供该载体，包括液体或粘性 溶液、凝胶、糊剂、粉剂、微球和膜，以直接应用到鼻粘膜。在这种背景下，使用所选择的载体可导致该活性剂的吸收的促进。
本披露的化合物可替代地包含如近似生理条件所需要的药学上可接受的载体物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。对于固体组合物，可以使用常规的无毒的药学上可接受的载体，其中包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、碳酸镁等。
本披露的组合物也可以被配制成溶液、微乳液、或适合于高浓度活性成分的其他有序结构。该载体可以是溶剂或包含以下各项的分散介质，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、及其适合的混合物。可以维持对于溶液的适当的流动性，例如通过使用包衣如卵磷脂、在可分散配制品的情况下通过保持所希望的粒径、以及通过使用表面活性剂。
在某些实施例中，本披露的一种或多种化合物和组合物是以定时释放配制品给予，例如以包括缓释聚合物的组合物。此类组合物可以用保护免于快速释放的载体例如控释运载体如聚合物、微囊化递送系统或生物粘附性凝胶来制备。在本发明的各种组合物中，延长递送可以通过包含在延迟吸收的组合物试剂例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶中来实现。当控释配制品是所希望的时，根据本发明适合使用的控释粘合剂包括对该活性剂而言是惰性的并能够结合该生物活性剂的任何生物相容的控释材料。许多此类材料是本领域中已知的。适合于局部给予的配制品包括除活性成分外含有如本领域中已知的此类载体的乳膏剂、乳液、以及凝胶。
本披露的这些化合物和组合物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前即刻添加无菌液体赋形剂(例如水)用于注射。即时注射溶液和悬浮液可以从无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。对于用于可注射组合物的、有效的药学上可接受的载体的需求是本领域的普通技术人员所熟知的。参见制药学和药学实践(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，J.B.利平科特公 司，费城，宾夕法尼亚州，班克和查尔莫斯编，238-250(1982)和可注射药物的ASHP手册，托伊塞尔(Toissel)，第4版，622-630(1986)。
此外，适合于直肠给予的配制品可通过与多种基质，如乳化基质或水溶性基质混合而作为栓剂呈现。适合于阴道给予的配制品可以呈现为阴道栓剂、内置卫生棉、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配制品，除了含有该活性成分外，这些配制品还含有此类如在本领域中已知的适合的载体。
本领域的普通技术人员将理解，向患者给予本发明的化合物的适合的方法是可用的，并且虽然可使用超过一种途径来给予一种具体化合物，一种具体的途径可以比另一个途径提供更即时和更有效的反应。
测定
本披露提供用于鉴定有效于治疗受试者的次优的粘液纤毛清除和/或增加气道上皮细胞功能的化合物的方法。本披露还提供了用于鉴定有效于增加受试者的CFTR的活性的化合物的方法。本披露提供了用于鉴定有效于增加受试者的气道上皮细胞功能的参数的化合物的方法。在该实施例的一个方面，此类参数是ASL的深度、PCL的深度、CBF、MCT的速率或上述的任意组合。在另一个方面，此类参数是增加ASL的深度。在另一个方面，此类参数是增加MCT的速率。在仍另一个方面，此类参数是增加ASL的深度和增加MCT的速率。在仍另一个方面，此类参数是增加ASL的深度、增加PCL的深度、增加CBF、增加MCT的速率或上述的组合。
在上述的各项中，该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常，包括但不限于CFTR。
该测定的一些实施例包括使候选试剂接触一个细胞系统(如此处所述的那些系统)；获得选自下组的特性的测量值，该组由以下各项组成：来自该细胞的氯化物分泌、CFTR的活性、粘液清除速率、ASL的深度、PCL的深度、CBF的速率和/或MCT的速率：所述测量发生在候选试剂接触该细胞后；对该特性的测量值与该特性的基线值进行比较；并且鉴别该候选试剂为推定的试剂(如果该特性的测量值显著大于该特性的基线值)。
在一个实施例中，此类筛选测定可以例如通过在适合的模型系统(例如但不限于此处所述的那些系统)中确定来进行。
此类筛选测定法可以在体外、体内或离体进行并且可以基于细胞培养(无论是整个细胞或溶胞产物)，或者可以基于动物模型。在一个实施例中，该测定利用鼠鼻中隔上皮细胞或人鼻腔鼻窦上皮细胞。在一些实施例中，该模型系统可以是来自C57小鼠的鼠鼻中隔上皮细胞。在另外的实施例中，该模型系统可以是小鼠的鼻腔，如由科迈特-波亚克(Cormet-Boyaka)等人，FASEB杂志23：3743-3751(2009)所述的。在另一个实施例中，这可以通过人支气管上皮细胞进行。在另一个实施例中，这可以是人、猪、大鼠或小鼠完整气管。
该氯离子通道的表达可以电化学地测量，例如通过在尤斯室中测量转运层(trans-layer)阴离子通量。
在一个实施例中，该方法涉及结合到该氯离子通道的候选或测试化合物或试剂(多肽、功能性核酸、碳水化合物、抗体、小分子或其他分子)的鉴别。然后可以在适当的系统(例如但不限于此处所述的模型系统)中进一步测试这些化合物，以确定所鉴别的化合物的活性。
候选化合物是使用多种测定法，例如但不限于采用表达该氯离子通道的细胞的测定法(基于细胞的测定法)或用分离的氯离子通道进行的测定法(无细胞测定法)来鉴别。各测定可以采用多种氯离子通道的变体(例如全长、其生物活性片段、该多肽的突变体形式或包括所希望的多肽的所有或一部分的融合蛋白)。此外，该氯离子通道可来源于任何适合的哺乳动物物种(例如人、猪、大鼠或小鼠)。
如果该氯离子通道是CFTR，例如它可以是来自任何物种的CFTR，或来自任何物种的CFTR的已知突变。公共数据库如Uniproi(www.uniprot.org)和GenBank上关于此种版本的CFTR的核苷酸和多肽序列对于本领域的普通技术人员是可用的。
用于筛选测定中的适合的测试化合物可从任何适合的来源获得，例如常规的化合物文库。这些测试化合物也可以使用本领域中已知的组合文库 方法中的多种路径中的任一种获得，包括：生物文库、空间可寻址平行固相或溶液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一珠粒一化合物”文库方法、以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库路径限于肽文库，而其他四种路径可用于肽、非肽寡聚物、或化合物的小分子文库。用于合成分子文库的方法的实例可以在本领域中找到。化合物文库可以呈现在溶液中或在珠粒、细菌、孢子、质粒或噬菌体上。
本披露的筛选测定法特别适合于高通量的形式，从而提供一种手段，以筛选例如小有机分子、肽、核酸分子等的组合文库。
试剂盒
本披露还提供了用于上述方法的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒包括本披露的化合物以及任选地：(i)用于此类化合物的一种或多种递送系统：(ii)用于在上述方法中使用的二级试剂；以及(iii)用于使用该试剂盒的指示(例如用于向受试者给予的说明)。
在一个实施例中，包含在该试剂盒中的化合物是CFTR激活剂。在一个实施例中，该CFTR激活剂是CFTR增效剂。已知的CFTR激活剂和增效剂包括但不限于蒽-9-羧酸(9-蒽甲酸)、焰红染料B、苯并咪唑酮类似物NS004和NS1619、染料木黄酮、7-正丁基-6-(4-羟基苯基)[5H]吡咯并[2,3-b]吡嗪(aloisine A)、2-(2-(1H-吲哚-3-基)-N-甲基乙酰胺基)-N-(4-异丙基苯基)-2-苯基乙酰胺(PG01)、N-环庚基-6-(N-乙基-N-苯基氨磺酰基)-4-氧-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(SF01)，磺酰胺6-(N-乙基-N-苯基氨磺酰基)-N-(2-甲氧基苄基)-4-氧-1,4-二氢喹啉-3-甲酰胺(SF03)、辣椒素和姜黄素。在一个实施例中，该CFTR激活剂是具有式I或II的化合物。
在一个实施例中，该试剂盒包含一个标签，该标签指示该试剂盒的内容物，该试剂盒待被给予遭受以下各项的受试者：(i)一种神经肌肉疾病(例如但不限于肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩、ALS)；(ii)获得性解剖学问题，导致肌肉无力(其可与病症例如但不限于截瘫、四肢瘫痪和膈肌麻痹有关)；(iii)呼吸道感染发生率增加，归因于免疫缺陷；(iv)过量粘液产生(这可能与病症例如但不限于哮喘和哮喘持续状态有关)；或(v)不利 的环境因素(其可与病症例如但不限于吸烟或慢性阻塞性肺病有关)。
实例
实例1-CFTR激活剂增加CFBE41o细胞中的WT-CFTR活性
在这个实例中，就刺激WT-CFTR的阴离子通道活性的能力对CFTR激活剂进行了检查。最近，该CFTR增效剂艾维卡夫特被报道在体外和具有G551D-CFTR缺陷的CF受试者中显著增加编码门控突变G551D-CFTR的CFTR的cAMP介导的离子转运活性。艾维卡夫特改善CFTR活性的测量值，并且还增强具有G551D-CFTR的CF患者的肺功能。
选择该CFTR增效剂艾维卡夫特作为一种示例性的CFTR激活剂。在WT-CFTR表达细胞中进行艾维卡夫特的活性检查。艾维卡夫特强力诱导CFBE41o细胞(人正常支气管上皮细胞系)中阴离子转运的增加，辅以稳定的WT-CFTR表达；在没有可检测的CFTR表达的亲本细胞中没有观察到活性，建立WT-CFTR特异性(图1A)。
实例2-CFTR激活剂增加了最初的人支气管上皮细胞中的WT-CFTR活性
在最初的非CF、人支气管上皮(HBE)细胞中，在用100nM毛喉素预刺激之后，艾维卡夫特还增加了CFTR依赖性阴离子转运活性，与被毛喉素单独刺激的相比，所选择的剂量诱导cAMP水平匹配CSE暴露细胞，增加CFTR依赖性短路电流(Isc)(图1B)。
实例3-在最初的人支气管上皮细胞中的CFTR激活剂ASL深度和MCT
由于CFTR调节ASL深度，从而允许有效的粘液纤毛清除，接着在支气管上皮细胞中通过艾维卡夫特，WT-CFTR阴离子分泌的增强也会增加ASL深度，导致与未刺激的(静止)的情况相比的增强的粘液转运。
在图2A和B中，添加艾维卡夫特(10μM)加强HBE单层(HBE细胞中含有WT-CFTR)中的ASL深度。此外，与对照相比，在艾维卡夫特的存在下粘液转运(MCT)显著增加高于基线，表明该粘液纤毛清除器官改变健康WT单层中的阴离子转运和粘液产生平衡的高响应性(图2C)。 显示于图2(C)中的这些结果进一步由吸入的高渗盐水增强健康个体中的MCT的报道支持。这些变化通过μOCT监测是显而易见的并指示艾维卡夫特强力增强WT上皮细胞中的MCT(图2D)。
实例4-CFTR激活剂增加正常移植的人气管中的WT-CFTR活性
艾维卡夫特也增效正常移植的人气管中的CFTR依赖性电流(在电压钳位条件下检查)(图3A和B)。
实例5-CFTR激活剂增加最初的人支气管上皮细胞中的粘液纤毛转运(如使用μOCT评价的)
如上面所讨论的，用于评价该粘液纤毛器官的相关度量包括气道表面液体(ASL)的深度、围绕纤毛的液体薄层的厚度(称为顶侧纤毛液体(PCL)深度)、纤毛摆动频率(CBF)、以及粘液纤毛转运(MCT)的速度。μOCT成像在没有外源标签或直接接触下允许直接和同时测量ASL、PCL、MCT、纤毛摆动模式和CBF，提供了新的工具来以无与伦比的分辨率查询呼吸道上皮细胞的功能性显微解剖学。
使用μOCT成像在HBE细胞中评价CFTR激活剂的效果(图4)。上皮单层和纤毛可被可视化，其分辨率与中等功率的组织学相当。一起包括气道表面液体(ASL)层的粘液和PCL层也可以清楚地看到。如图4所示，从顶部至底部，该空气没有μOCT信号，而该粘液层出现高μOCT信号强度的多相。该PCL凝胶与粘液和单层比较具有低μOCT信号强度，并包括纤毛结构。该空气-液体界面、粘液-PCL界面、以及顶端细胞表面被清楚地定义，使得可以按亚微米分辨率直接测量ASL和PCL高度。除了这些不同的层，纤毛尖端可以通过μOCT容易地检测，因为它们比周围的PCL和粘液更亮。该尖端保持与粘液覆盖层的深面接触并在有效摆动中将附近的粘液提起几百纳米。
在图4中所说明的该实例中的结果中，确认上面显示的结果，CFTR激活剂增加WT-CFTR的活性。在图4中的每个小图中，一起使用包含缺陷型CFTR(指定对照，CF)的对照HBE细胞与包含WT-CFTR(指定对照和VX-770，野生型)的HBE细胞。对照细胞仅接受运载体(0.2％DMSO)； 在所有情况下以10μM使用艾维卡夫特。在小图A中，艾维卡夫特增加ASL深度显著高于对照野生型和对照CF HBE细胞中的对照。相比于对照野生型，通过添加艾维卡夫特，PCL深度和CBF没有以统计学上显著方式增加，但相比于对照CF HBE细胞增加(小图B和C)。在PCL深度方面，该PCL仅延伸约700微米(对应于全长纤毛的深度)；进一步的增加难以检测。对于CBF，CBF的速率未必是所有情况中限制的速率。例如，如果该纤毛正朝着厚的粘液摆动(由例如粘液过量产生或无法正常清除粘液引起)，该CBF会比较慢。然而，在这些测定中，CBF的确定是相对进行的正常对照进行的，意味着CBF的增加未必在所有情况下都可检测到。重要的是，相比较于对照野生型和对照CF细胞，在艾维卡夫特处理的细胞中整体的MCT显著增加。
图5示出使用含有WT-CFTR的HBE细胞相似的结果，并进一步示出CFTR激活剂在环境刺激(在本实例中，香烟烟雾提取物，CSE)存在下增加CFTR活性的能力。图5中的数据来源于每孔5个测量以及3孔每种条件。在图5中，所有细胞含有WT-CFTR；对照细胞接受DMSO运载体(2.2％DMSO)，CSE表示细胞接受顶部给予的2％CSE提取物：CSE表示细胞接受顶部给予的2％CSE提取物和基底外侧给予的10μM艾维卡夫特；VX-770表示细胞接受基底外侧给予的10μM艾维卡夫特。所有数据均来源于μOCT，如此处所述的。
小图A显示每种条件下的μOCT图像；ASL深度由暗条指示(白色条带是用于给出比例并等于10微米)。小图B、C和D分别显示4种条件下的ASL深度、CBF和MCT。如小图B中所示，暴露于CSE的HBE细胞相比于对照细胞具有减少的ASL深度；添加艾维卡夫特显著增加ASL深度。此外，与对照相比，单独添加艾维卡夫特也显著增加ASL深度。类似的趋势同样在CBF上看到(小图C)。MCT示于小图D。相比于对照细胞，添加CSE降低MCT至几乎检测不到的水平；另外，添加艾维卡夫特增加MCT到在对照细胞中看到的。与对照相比，单独添加艾维卡夫特也显著增加MCT。
实例6-CFTR激活剂增加人支气管组织中的粘液纤毛转运(如使用μOCT评价的)
为了进一步研究CFTR激活剂在调节气道上皮细胞功能中的作用，与来自不健康供体的人支气管组织组合，对CFTR激活剂进行了研究。获得人支气管组织并如本文所述保持。将人支气管组织仅暴露于DMSO对照(0.2％)进行对照实验并与艾维卡夫特处理相对比。这些结果显示于图6中。小图A-C分别显示ASL深度、CBF和MCT。如在图6小图A中所示，艾维卡夫特(10UM)处理显著增加ASL深度。在对照细胞中，ASL深度约为10微米；艾维卡夫特处理将ASL深度增加到约30微米。同样，在艾维卡夫特的存在下，CBF频率也被显著增加(10μM)(图6，小图B)。最后，在艾维卡夫特处理后，MCT也被显著增加(10μM)(形成小于0.01mm/min到几乎0.04mm/min的对照值)。
实例7-CFTR激活剂增加猪气管中的粘液纤毛转运(如使用μOCT评价的)
为了进一步研究CFTR激活剂在调节气道上皮细胞功能中的作用，与猪气管组合，对CFTR激活剂进行了研究。在本实例中，对来自具有突变的CFTR(CFTR(-/-)的动物和来自具有WT-CFTR(CFTR+/+)的动物的猪气管针对ASL深度、PCL深度、CBF和MCT进行了评价。这些结果显示于图7中。
小图A和B显示CFTR-/-(小图A)和CFTR+/+(小图B)动物的代表性的μOCT图像：ASL深度通过暗条指示，光条表示10微米的比例尺。小图C-F分别显示来源于来自CFTR-/-和CFTR+/+动物的μOCT图片的ASL深度、PCL深度、CBF和MCT测量。如可以看到的，与CFTR+/+动物相比，CFTR-/-动物中的ASL和PCL深度显著降低。此外，与CFTR+/+动物相比，CFTR-/-动物中的CBF频率和MCT也显著降低。
小图G和H显示上皮功能参数，即响应于艾维卡夫特(10μM)、毛喉素(100nM)和乙酰胆碱(100μM)的连续药物干预的CFTR-/-和CFTR+/+动物的ASL深度、CBF和MCT；在该实验中，乙酰胆碱充当阳性对照以诱导CF组织中的腺挤出)。在这些实验中，将激动剂添加到浴溶液中，并在生理条件(37℃和100％湿度)下进行所有实验。如在小图G中可以 看到的，在ASL深度、CBF或MCT方面没有观察到任何对艾维卡夫特或毛喉素处理的响应；在该组织中观察到对乙酰胆碱的阳性响应，如所预期的。与小图G形成对照，在CFTR+/+动物中响应艾维卡夫特处理，ASL深度、CBF和MCT都增加，与上述的针对人体组织的结果一致。
材料和方法
最初的气道上皮细胞的获得与生长
人体细胞和组织的使用受到UAB机构审查委员会批准。最初的人支气管上皮(HBE)细胞来源于肺外植体，在从通过如前所述的方法证实了CFTR遗传学的CF和非CF受试者获得书面知情同意书之后。简单地说，在手术切除之后立即清除组织，将组织在最小必需培养基(MEM)中用0.5mg/ml DTT(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，MO)和25U/ml DNA酶I(罗氏公司(Roche)，巴塞尔，瑞士)洗涤两次，并且然后在4℃置于含有MEM、2.5U/ml DNA酶I，100μg/ml头孢他啶，80μg/ml妥布霉素，1.25μg/ml两性霉素B，以及4.4U/ml的链霉蛋白酶(西格玛-奥德里奇公司)中24-36h。然后将放松的气道上皮细胞扩展于含有BEGM(龙沙公司(LONZA)，巴塞尔，瑞士)、补充有额外的10nM的所有反式视黄酸(西格玛-奥德里奇公司)的生长介质中，每24h将其进行交换。在扩展之后，将第一或第二通道细胞接种于可渗透支撑件上用于研究。
一旦80％-90％融合，用NIH 3T3纤维原细胞条件培养基涂布后，将细胞接种于Snapwell 1.13cm2可渗透支撑件(1×106细胞/过滤器；拜耳公司，匹兹堡，PN)或Costar 0.4μm可渗透支撑件(5×105细胞/过滤器，贝塞斯达，MD)上，并使其生长于含有DMEM/F12(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、2％Ultroser-G(帕尔公司(Pall)，纽约，NY)、2％胎儿克隆II(Hyclone公司，洛根，UT)、2.5μg/ml胰岛素(西格玛-奥德里奇公司)、0.25％牛脑提取物(龙沙公司)，20nM氢化可的松(西格玛-奥德里奇公司)、500nM三碘甲状腺原氨酸(西格玛-奥德里奇公司)，2.5μg/ml转铁蛋白(英杰公司)、250nM乙醇胺(西格玛-奥德里奇公司)、1.5μM肾上腺素(西格玛-奥德里奇公司)、250nm磷酸乙醇胺 (西格玛-奥德里奇公司)，和10nM全反式视黄酸的分化培养基中，直到终末分化，如先前所述(1，2)。
正常仔猪气管的获得与生长
普通仔猪气管是从标本遗传学(苏中心(Sioux Center)，爱荷华州)获得。组织是从一日龄仔猪上切割的并在DMEM中在湿冰上运输。采用了基于巴拉德(Ballard)等人开发的气道组织处理和制备方法的改进方案(美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol)298：L270-276，2010)。在室温下，将气管浸没在80ml林格碳酸氢盐溶液(KRB)浴中，并慢慢地加温到37℃。在4小时预处理后，将气管从KRB移出。从气道管腔抽吸可得的粘液和液体并将气管末端插管使得浆膜表面沐浴在KRB[29]中而不与粘膜表面接触，如先前所述(巴拉德等人，美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学298；L270-276，2010：马腾(Martens)等人，美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学301：L236-246，2011)。在37℃允许气管平衡于KRB中，用95％O2和5％CO2吹泡，并在mOCT成像之前，在100％的湿度下，将该腔侧暴露于调节的空气2h(斯莱(Sleigh)等人，生物化学和生理学部分A-分子和综合生理学(Comp Biochem Physiol A Comp Physiol)94：359-364，1989)。
正常人气管生长的获得与生长
人气管组织样本是从没有入选肺移植的正常的供体外植体器官获得。肺、主支气管、和气管被整块切除，转移到湿冰上并切除大气道。然后将气道组织浸入冰冷的DMEM中，接着切除用于转移，然后在mOCT成像前允许其平衡至室温。
微光学相干断层扫描(μOCT)研究
该μOCT系统是具有对标准OCT的一些改善的谱域OCT实现，其在横向和轴向上都产生高分辨率。已对总体布局和轴向分辨率特征进行了描述(刘(Liu)等人，PLOSOne，8(1)，E54473-2013)。超连续源(Fianium SC450)提供了高带宽短相干长度的光，这是高轴向分辨率(1.3mm)所需要的。一个典型的OCT系统包括在分束器处具有参照和样品臂的干涉 仪。在μOCT中，用45度杆镜代替该分束器，其通过将循环遮蔽引入中心实现良好的横向分辨率(2μm)和长的聚焦深度(0.2mm)的平衡而将样品光束阳极化处理。采用定制软件来控制检流计扫描电动机同时从线阵照相机获得光谱数据。该系统以用户可配置的线和帧速率和可定制扫描几何运行；典型的设置是每秒32或40帧，在线性扫描中每帧512A-线，和0.5mm乘0.5mm(X乘Z)的横截面图像。各横截面的有效厚度等于该μOCT光斑尺寸(2μm)。
各种细胞培养物的μOCT成像是在细胞的顶侧上入射照明进行。该成像光学部件的轴线典型地放置在垂直于细胞平面的10度内，以最小化几何测量误差。以对液体(n＝1.33)中的折射指数应用的修正，直接从该图像中的可见图层的厚度测量ASL和PCI。以图像的5个均等分布的区域评价ASL和PCL。从时间序列的图像确定CBF和MCT。通过找到呈现振荡行为的区域的时间傅立叶变换中的峰值振幅的频率测量CBF。针对CBF，每个图像序列评估高达10个区域的纤毛活性。通过定时测量粘液中的5至10个可见内含物的位移计算MCI。所有图像分析是用ImageJ和Matlab进行的。以类似的方式对各种组织外植体进行分析。
在尤斯室中的电压钳研究
用MC8电压钳和P2300尤斯室在电压钳位条件下测量短路电流(Isc)(生理仪器公司(Physiologic Instruments)，圣地亚哥，CA)，如前所述(2)。首先用含(以mM计)115NaCl、25NaHCO3、2.4KH2PO4、1.24K2HPO4、1.2CaCl2、1.2MgCl2、10D-葡萄糖(pH 7.4)的相同的林格溶液沐浴单层的两侧。剧烈搅拌沐浴溶液，并用95％O2：5％CO2供应气体。使用上皮电压钳(生理仪器公司)获得短路电流测量。每10秒强加一秒钟3mV脉冲来监测使用欧姆定律计算的电阻。其中指出，该粘膜沐浴溶液被更换为含有1.2NaCl和115Na+葡糖酸盐的低Cl溶液，并且所有其他组分如上。添加阿米洛利(100μM)以阻塞残余的Na+流，随后添加激动剂毛喉素、艾维卡夫特、和ATP，如所示的(每个浓度最少观察5min)。在实验结束时将CFTRInh-172(10μM)添加到粘膜沐浴溶液中，以阻塞CFTR依赖性Isc。将所有室保持在37℃，并在放置入腔的15min内发动激动剂刺激。 粘液转运研究
在添加PEG珠前，将HBE细胞用无菌PBS 1-2天洗涤两次。将五十(50)μl的二胺聚乙二醇(PEG)包被的荧光珠(1μm，分子探针公司(Molecular Probes)，尤金，OR，1：500稀释于PBS中)通过使用微喷头烟雾器(佩恩-世纪公司(Penn-Century Inc)型号IA-1B，温德摩(Wyndmoor)，PA)添加到顶面。在孵育24h之后，获得基线图像并且然将测试化合物添加到基底外侧隔室。使用倒置荧光显微镜(尼康Diaphot，梅尔文，NY；488nm激发/519nm发射)，通过时间推移荧光成像，在感兴趣的四个区域/孔(在离该孔的周围1mm处以及在每个象限处)捕获纤毛转运(MCT)图像。通过分析每个区域的10-15个粒子使用Metamoph 7.0计算线性转运速率(7)。
通过共聚焦显微镜测量气道表面液体(ASL)深度
将HBE细胞的顶表面洗涤三次，并且然后在标记之前24h将测试化合物添加到基底外侧隔室。将细胞在细胞培养基中用CMFDA(100μM)染色1小时。顶上地添加德克萨斯红染料(25μl，在Fc7Q中2mg/ml)并允许细胞在37℃平衡2h。将侵袭小室膜(transwell membrane)放置在用MEM涂布的无菌玻璃底培养皿中，并用卡尔蔡司(皮博迪(Peabody)，MA)共聚焦显微镜使用20X(数值孔径0.88，工作距离0.55mm)空气物镜成像。在发起荧光显微镜法之前，将细胞用DIC光学可视化以评价细胞形态。随后从ASL的顶部通过该细胞表面的顶部获得Zscan共聚焦荧光显微镜图像。使用Zen2008软件以四ROI/孔(每个位于离该过滤器外周1mm和每个象限处)分析XZ扫描；取同样分散于每个ROI的ASL深度的5个估计值(7，9)。
统计
用学生t检验或ANOVA(如适用)比较描述性统计(平均值，SD，和SEM)。在ANOVA后采用费希尔最小显著差(Fisher’s least significant difference)计算多重比较的事后检验。所有统计检验为双侧的并以5％显着性水平(即α＝0.05)，使用绘制医学图表(GraphPad Prism)(拉霍亚(La  Jolla)，CA)进行。误差棒指定SEM，除非另有说明。用SPSS(IBM公司，阿蒙克(Armonk)，NY)进行相关性分析。