聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法及应用.pdf

发明公开了一种聚谷氨酸包覆氧化铁纳米颗粒的磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤包括：反应制备PGA包裹的超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒；对SPIO-PGA纳米颗粒溶液进行纯化。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作，安全无污染；本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒粒径分布均匀、粒径较小，弛豫率高、造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和血液相容性，对生物体无不良影响，成本低廉，易于保存。包裹的有机物表面有大量的活性基团可用于进一步的修饰和深入开发，在磁共振成像诊断领域有潜在的应用价值。

权利要求书
1.  一种聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将三价 铁盐溶解于水中，搅拌，通入氮气，并逐滴加入聚谷氨酸PGA溶液，随后边搅 拌边逐滴加入亚硫酸钠Na2SO3水溶液，得到混合溶液，然后移入水浴中，边搅 拌边滴加NH3·H2O，反应20-30min，然后在室温条件下反应0.5-1.5h，离心， 透析，即得聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

2.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述三价铁盐为FeCl3·6H2O，该溶液的质量浓度不高于13mg/mL。

3.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述中聚谷氨酸PGA的重均分子量为100万。

4.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述通入氮气时间为5-15min；搅拌转速均为1000-5000转/分钟。

5.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述FeCl3·6H2O与Na2SO3的质量比为7∶1；FeCl3·6H2O与PGA的质 量比为7∶1；FeCl3·6H2O与质量分数为91％的NH3·H2O的质量比为4∶5。

6.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述步骤1)中FeCl3·6H2O溶液滴加Na2SO3后颜色从红棕色变为黄色 后再转移至水浴中滴加NH3·H2O。

7.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述水浴温度为50-65℃。

8.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述离心转速为5000-8000转/分钟。

9.  如权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，所述透析为采用截留分子量为8000-14000的透析袋，透析用水为蒸馏 水，透析三天，每天换水三次。

10.  一种权利要求1所述的聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒作为制备用于 肝脏和肿瘤模型的T2磁共振成像诊断的造影剂的应用。

说明书聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法及应用
技术领域
本发明属于磁共振造影剂的制备技术领域，具体涉及一种聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法及应用。
背景技术
磁共振成像(MRI)技术是一种分辨率高的成像技术，具有较高的空间和断层成像能力，MRI没有放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息，具有其他医学成像无可比拟的优点。磁共振成像技术在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。但MRI的弱点是其敏感性较低，而且不同器官或肿瘤组织的弛豫时间相互重叠使MRI诊断困难。近年来，通过注射MRI造影剂的方法可以有效解决MRI敏感性较低的问题。因此选择合适的MRI造影剂就显得尤为重要。
超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒(SPIO)近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用，尤其是在磁共振成像造影剂方面的应用更是受到了普遍的关注。SPIO纳米颗粒具有独特的磁学性质以及较高的信号强度、较低的使用剂量、良好的生物相容性和较低的制造成本等特点。目前已有商业化SPIO纳米颗粒作为MRI造影剂应用于临床疾病诊断。然而，这些商业化的SPIO造影剂用于肿瘤分子影像领域时，还存在着诸多挑战。例如，商业化SPIO造影剂往往弛豫率较低，不能达到对疫病灵敏检测的目的。
本课题组之前采用温和还原法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)的结果表明，通过温和还原法制备的四氧化三铁纳米颗粒尺寸较小，粒径均匀，并且表现出极高的r2弛豫率(沈明武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号：201410182821.1，申请日期：2014-4-30)。但是上述方法主要采用携带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)作为稳定剂，需要进一步的功能化才可以用于细胞或肿瘤MR成像。为了解决PEI表面正电荷所产生的细胞毒性和细胞非特异性吞噬问题，发明人采用在还原法制备纳米颗粒的过程中，向反应溶液中加入聚谷氨酸(PGA)，从而制备PGA包覆的SPIO纳米颗粒(SPIO-PGA)。PGA具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，可降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环 保型高分子材料。PGA分子链上丰富的-COOH使其具有良好的生物相容性，在水溶液中呈负电性，不需要进一步修饰就可以进行生物应用，减少了工作量，同时降低了生产成本。丰富的-COOH也可进一步修饰功能化基团，为本发明的进一步深入研究开发提供了很大的空间。表征数据表明，制备的SPIO-PGA具有良好的水溶性和胶体稳定性，经过一系列生物学实验考察，本发明制备的SPIO-PGA具有良好的生物相容性和血液相容性，而且其r2的弛豫率高达333.7mM-1s-1，具有显著的T2加权的MRI成像效果，有望作为MRI造影剂应用于临床疾病诊断。
检索国内外文献，尚没有发现关于用温和还原法制备PGA包覆的SPIO纳米颗粒作为MRI造影剂研究的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有SPIO纳米颗粒不能长时间稳定分散于水溶液中，容易出现团聚现象。
为了解决上述问题，一种聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将三价铁盐溶解于水中，搅拌，通入氮气，并逐滴加入聚谷氨酸PGA溶液，随后边搅拌边逐滴加入亚硫酸钠Na2SO3水溶液，得到混合溶液，然后移入水浴中，边搅拌边滴加NH3·H2O，反应20-30min，然后在室温条件下反应0.5-1.5h，离心，透析，即得聚谷氨酸PGA包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
优选地，所述三价铁盐为FeCl3·6H2O，该溶液的质量浓度不高于13mg/mL。
优选地，所述中聚谷氨酸PGA的重均分子量为100万。
优选地，所述通入氮气时间为5-15min；搅拌转速均为1000-5000转/分钟。
优选地，所述FeCl3·6H2O与Na2SO3的质量比为7∶1；FeCl3·6H2O与PGA的质量比为7∶1；FeCl3·6H2O与质量分数为91％的NH3·H2O的质量比为4∶5。
优选地，所述步骤1)中FeCl3·6H2O溶液滴加Na2SO3后颜色从红棕色变为黄色后再转移至水浴中滴加NH3·H2O。
优选地，所述水浴温度为50-65℃。
优选地，所述离心转速为5000-8000转/分钟。
优选地，所述透析为采用截留分子量为8000-14000的透析袋，透析用水为蒸馏水，透析三天，每天换水三次。
本发明还提供了上述聚谷氨酸PGA包覆的氧化铁纳米颗粒作为制备用于肝 脏和肿瘤模型的T2磁共振成像诊断的造影剂的应用。
本发明采用温和还原法制备PGA包裹的磁性氧化铁纳米颗粒，并通过离心和透析对制备的纳米颗粒溶液进行纯化。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性、血液相容性和生物相容性。经过裸鼠体内成像造影实验，本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒具有显著的造影效果，在磁共振成像造影剂领域有潜在的应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用温和还原法制备SPIO-PGA用于MR成像造影剂，制备方法简单，反应条件温和，易于操作处理，所用的稳定剂为廉价和环境友好型的聚谷氨酸，具有产业化实施的前景。
(2)本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒晶型良好，大小均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性、血液相容性和良好的T2造影效果，在磁共振成像领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备的SPIO-PGA纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图；
图2为实施例1制备的SPIO-PGA纳米颗粒的粒径分布直方图；
图3为实施例1中SPIO-PGA纳米颗粒和裸露的四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒的X射线衍射图谱的比较图(从上至下依次为SPIO-PGA纳米颗粒和裸露的四氧化三铁纳米颗粒)；
图4为实施例1中裸露的四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)、聚谷氨酸(PGA)、SPIO-PGA纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱(FTIR)的比较图(从上到下依次为裸露的四氧化三铁纳米颗粒、聚谷氨酸、SPIO-PGA纳米颗粒)；
图5为实施例1中裸露的四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)、SPIO-PGA、聚谷氨酸(PGA)的热重分析(TGA)图谱的比较图(从上到下依次为裸露的四氧化三铁纳米颗粒、SPIO-PGA、聚谷氨酸)；
图6为实施例2中SPIO-PGA纳米颗粒的MR成像图；
图7为实施例2中SPIO-PGA纳米颗粒的r2弛豫率测试曲线；
图8为实施例3中MTT法测试的经过裸露的四氧化三铁纳米颗粒(对照组) 和SPIO-PGA纳米颗粒(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)处理24小时后的HeLa细胞的细胞活力示意图；
图9为实施例3中HeLa细胞经过生理盐水(对照)和SPIO-PGA纳米颗粒(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)处理24小时后，相差显微镜观察到的细胞形貌图的比较图(从a到f依次为参照物生理盐水和Fe浓度分别为50、150、250、350、450μg/mL处理后的细胞形貌)；
图10为实施例4中SPIO-PGA纳米颗粒溶血实验的紫外光谱图；
图11为实施例5中经过SPIO-PGA纳米颗粒(Fe浓度为0、10、100μg/mL)处理4小时后巨噬细胞吞噬情况的示意图；
图12为实施例6中裸鼠尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒(100μL，1000μg/mL)前和注射后不同时间点(2、4、6小时)磁共振成像图片的比较图；
图13为实施例6中裸鼠尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒(100μL，1000μg/mL)前和注射后不同时间点(2、4、6小时)裸鼠的肝脏和肿瘤部位信号强度的变化情况(其中纵坐标代表信号强度(a)为肝脏，(b)为肿瘤)；
图14为实施例7中裸鼠尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒(100μL，1000g/L)前和注射后不同时间点(2、4、6小时)各个器官中Fe元素浓度分布和代谢情况的示意图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
将640mg六水合三氯化铁溶于50mL超纯水中，通入氮气10分钟并充分搅拌。将90mg PGA溶于20mL超纯水中，逐滴加入上述溶液。搅拌均匀后逐滴加入9mg/mL亚硫酸钠溶液。将混合溶液转移至60℃水浴中，加入1mL氨水，充分反应30分钟。将混合溶液移至室温，继续反应1.5小时。对制备的溶液进行离心，以8000转/分钟的转速离心10分钟后，弃掉离心沉淀，取上层溶液。用截留分子量为8000-14000的透析袋透析。透析用水为蒸馏水，透析三天，每天换水三次。
将上述制备的聚谷氨酸包覆的四氧化三铁纳米颗粒通过透射电子显微镜观察，结果表明形成的SPIO纳米颗粒形貌均匀，平均粒径为5.3nm，标准偏差为2.6nm，分布在较窄的粒径范围内(如图1和图2所示)。Zeta电势结果显示SPIO-PGA纳米颗粒的表面电势为-38.6mV，动态光散射测定的水动力直径表明：其水合粒径为217.5±3.75nm。X射线衍射图谱证明反应制备得到了晶型良好的四氧化三铁晶体(如图3所示)。傅里叶变换红外光谱吸收峰的增强，说明聚谷氨酸包覆在四氧化三铁纳米颗粒上，形成包覆的纳米结构(如图4所示)。通过热重分析得出，SPIO-PGA纳米颗粒中四氧化三铁的含量为75.6％，聚谷氨酸的上载量达到了24.4％(如图5所示)。
对比例1
在三氯化铁溶液中，加入亚硫酸钠溶液，转移至60℃水浴条件下向反应溶液加入氨水，反应30分钟，最后置于室温反应1.5小时。反应结束后，将所得到的黑色沉淀磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯水洗涤三次，以除去杂质，然后重新分散于超纯水中，真空冷冻干燥，用于X射线衍射检测和MTT细胞毒性实验。通过X射线衍射测试证明，反应制得了晶型良好的四氧化三铁晶体(如图3所示)。
实施例2
通过ICP-OES测试法测定实施例1制备的SPIO-PGA纳米颗粒溶液中Fe元素的浓度。分别配制Fe浓度为0.004、0.008、0.016、0.032、0.064mM的SPIO-PGA纳米颗粒水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe浓度下的T2弛豫效应(如图6和图7所示)。弛豫率测试结果表明SPIO纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.004～0.064mM浓度范围内)具有良好的线性关系。通过计算可得本发明制备的SPIO-PGA的r2弛豫率高达333.7mM-1s-1。因此，本发明所制备的SPIO-PGA可以作为优良T2信号衰减造影剂。
实施例3
以HeLa细胞为模型细胞评价本发明制备SPIO-PGA纳米颗粒对细胞活力的 影响。以对比例1制备的裸露的Fe3O4纳米颗粒作为对照。将实施例1得到的溶液依次配制Fe元素浓度为50、150、250、350、450μg/mL SPIO-PGA纳米颗粒的生理盐水溶液(氯化钠含量0.9％)。将HeLa细胞种植于96孔板中，每种浓度设定5个平行样，将细胞培养板置于CO2浓度为5％和温度为37℃下共培养24小时。经MTT处理后在酶标仪上检测各孔在λ＝570nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以生理盐水处理的细胞为空白对照，细胞活力记为100％。与对照组裸露的Fe3O4相比，在各个浓度下，SPIO-PGA处理的细胞均具有良好的细胞活力(如图8所示)。与空白对照组相比，各个浓度SPIO-PGA溶液处理的细胞的活力均优于空白对照组，进一步表明本发明具有良好的生物相容性。这一结果通过相差显微镜观察的细胞形貌(如图9所示)得到了进一步验证。
实施例4
将实施例1制备的SPIO-PGA纳米颗粒生理盐水溶液(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)与新鲜的人血红细胞在室温下经过1小时孵育，离心观察溶血情况。相应的，以去离子水作为阳性对照组，生理盐水作为阴性对照组，样品的溶血程度通过紫外可见分光光度仪在541nm处的吸收值进行量化表征。实验结果表明，SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的血液相容性。各浓度样品溶血率均小于5％，铁离子浓度为450μg/mL时，SPIO-PGA纳米颗粒的溶血率为3.42％，随着样品浓度的降低溶血率随之降低(如图10所示)。由图10可知，本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的血液相容性。
实施例5
为考察SPIO-PGA纳米颗粒被巨噬细胞吞噬的情况，将Raw 264.7细胞与实施例1制备的SPIO-PGA纳米颗粒(Fe浓度分别为10和100μg/mL)共同培养4小时，以对比例1制备的裸露的Fe3O4纳米粒作为对照。清洗细胞之后，通过ICP-OES测量被巨噬细胞吞噬的材料的Fe元素浓度。相比表面未经PGA修饰的裸露的四氧化三铁纳米颗粒而言，在Fe浓度同为100μg/mL时，SPIO-PGA纳米颗粒的细胞吞噬量明显较少(如图11所示)。因此本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒在进入生物体内后有望避免被巨噬细胞吞噬，从而获得理想的造影效 果。
实施例6
为了验证本发明材料在动物体内实际的成像效果，发明人在裸鼠体内构建HeLa移植瘤模型，通过尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒生理盐水溶液（100 μL，1000 μg/mL）来评价器官和肿瘤部位磁共振成像效果。
如图12和13所示，与注射前裸鼠的磁共振图像相比，注射SPIO-PGA纳米颗粒2 小时后，裸鼠各个主要器官均不同程度变暗，肝和脾脏部位明显变暗，肝脏部位信号强度有明显减弱（如图12和图13中（a）部分所示，脾脏面积过小无法准确测定信号值），肿瘤部位的信号强度有了一定的减弱（如图12和图13中（b）部分所示），表明注射的纳米颗粒首先大量进入了肝脏，减弱了肝脏部位的信号强度，少部分材料被肿瘤吞噬。4 小时后，脾脏部位进一步变暗，这是由于纳米颗粒注射入裸鼠体内后首先进入肝部，然后经过脾脏进行代谢。肿瘤部位的信号强度在2小时最弱，表明这时纳米材料在肿瘤部位的聚集量达到最大。6小时后扫描图像显示，肿瘤部位的信号强度已经恢复接近注射前的水平，表明多数材料已经被代谢排出体外。

实施例7
为了研究本发明SPIO-PGA纳米颗粒在生物体内各组织的分布和代谢情况，发明人在构建了HeLa移植瘤模型的裸鼠体内通过尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒生理盐水溶液(100μL，1000μg/mL)。然后用ICP-OES测量注射前和注射后不同时间点(2、4、6小时)各个重要器官和肿瘤中Fe浓度的含量(如图14)，并设置空白裸鼠作为参考对照。从图中可以看出，与对照组相比，Fe浓度主要分布在脾脏处，并随着时间的变化，聚集量发生变化。注射后2小时，肝脏中Fe浓度达到最高，随着时间的延长，Fe浓度明显降低，表明Fe元素被肝脏慢慢代谢掉，这与体内MR成像结果相符合；在4小时，脾脏中Fe浓度达到最高，且高于肝脏中Fe浓度，然后随着时间的推移，Fe浓度明显降低，表明Fe元素被脾脏慢慢代谢掉，这也与体内MR成像结果吻合。在注射本发明材料6小时后，裸鼠各个器官中Fe浓度都有明显的降低，接近对照鼠体内Fe浓度。肿瘤部 位Fe浓度在2小时最高，随后逐渐代谢出去。此结果表明材料能够在裸鼠体内正常的代谢清除，能进入肿瘤部位，允许肿瘤的MR显像。
综上，本发明使用透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射分析(XRD)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、傅里叶转换红外光谱分析(FTIR)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)和磁共振分析(MR)等手段表征制备的SPIO-PGA纳米颗粒。然后利用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性，并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌；通过溶血实验评价本发明的血液相容性。最后进行体外细胞和裸鼠体内肿瘤模型的磁共振成像实验，考察SPIO-PGA纳米颗粒的体外细胞和体内肿瘤模型的MR成像效果。此外，通过组织分布实验研究SPIO-PGA纳米颗粒在生物体内的代谢过程。具体测试结果如下：
(1)透射电子显微镜(TEM)测试结果
本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒的TEM图片和粒度分布直方图(参见附图1-2)表明：所形成的SPIO纳米颗粒的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集，经统计分析得出颗粒直径大小为5.3±2.6nm，粒径分布在较窄的范围内。
(2)X射线衍射分析(XRD)测试结果
本方法制备的PGA包裹的SPIO纳米颗粒的XRD图谱(参见附图3)表明：所制备材料的衍射峰在位点220、311、400、422、511和440处与四氧化三铁纳米颗粒的衍射峰位点非常吻合。衍射峰峰型尖锐，说明反应制得了晶型良好的四氧化三铁晶体。
(3)Zeta电势和动态光散射仪(DLS)测试结果
Zeta电势结果显示SPIO-PGA纳米颗粒的表面电势为-38.6mV，水动力学直径为217.5±3.75nm。
(4)傅里叶变换红外光谱(FTIR)测试结果
本方法制备的PGA包裹的SPIO纳米颗粒的FTIR图谱(参见附图4)表明：在1080cm-1(C-O)、1410cm-1(O-H)、1637cm-1(C＝O)三处，相比于裸露的四氧化三铁纳米颗粒，吸收峰强度明显增加。这说明PGA很好的包裹在了SPIO 纳米颗粒上，形成包覆的纳米结构。
(5)热重分析仪(TGA)测试结果
本方法制备的SPIO-PGA纳米颗粒的TGA分析结果(参见附图5)表明SPIO-PGA纳米颗粒中四氧化三铁含量约为75.6％，PGA的上载量达到了24.4％。
(6)磁共振(MR)分析结果
r2弛豫率反映SPIO纳米粒子作为MRI造影剂的成像效率，单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间(T1或T2)的倒数拟合计算得到。通过本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种SPIO-PGA纳米颗粒的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加，具有良好的线性关系。随着Fe浓度的增高，其MR信号强度明显减弱。不同浓度样品的磁共振成像可以看出纳米颗粒具有良好的体外成像效果。通过计算得出SPIO-PGA纳米颗粒的r2值为333.7mM-1s-1(参见附图6-7)。
(7)MTT细胞活力和相差显微镜观察结果
通过MTT比色法测定HeLa细胞的活力来评价本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒的细胞相容性(参见附图8)。将HeLa细胞种植于96孔板中，每种浓度设定5个平行样(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)。细胞培养板置于CO2浓度为5％和温度为37℃的环境中共培养24小时。经MTT处理后在酶标仪上检测各孔在λ＝570nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以生理盐水处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。与空白对照组相比，经SPIO-PGA纳米颗粒处理过的HeLa细胞在Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL下均具有更高的细胞活力，并随着纳米颗粒浓度的增加细胞的活力随之相应增加。这是因为PGA是一种具有良好生物相容性的生物高分子，对细胞的分化和增殖有着促进作用。与此相反，作为对比的裸露的四氧化三铁纳米颗粒组在相同浓度下，细胞活力明显低于生理盐水处理的细胞对照组，且随着浓度的增加，细胞活性逐渐降低。两组对比表明SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的细胞相容性。同时，发明人还通过相差显微镜观察法进一步验证了SPIO-PGA纳米颗粒对细胞形貌的影响。结果表明不同浓度的纳米颗粒(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)在37℃下与细胞共培养24小时后，细胞形貌没有明显的变化(参见附图9)。进一步说明了SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的细胞相容性。
(8)血液相容性 
本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒在进行动物实验之前需要评价其血液相容性。发明人通过溶血实验对材料血液相容性进行了评价。将新鲜的人血红细胞与纳米颗粒生理盐水溶液(Fe浓度为50、150、250、350、450μg/mL)在室温下经过1小时孵育之后，离心观察溶血情况。以去离子水作为阳性对照组，生理盐水作为阴性对照组，样品的溶血程度通过紫外可见吸收光谱在541nm处的吸收值进行量化表征。实验结果表明：在铁离子浓度达到450μg/mL时，SPIO-PGA纳米颗粒的溶血率为3.42％，随着样品浓度的降低溶血率随之降低，各样品溶血率均低于5％(参见附图10-11)。说明本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒具有良好的血液相容性。
(9)细胞吞噬实验 
对于生物医学应用，减少纳米颗粒被巨噬细胞吞噬至关重要。因此需要对SPIO-PGA纳米颗粒被巨噬细胞的吞噬情况进行评价。Raw 264.7细胞与SPIO-PGA纳米颗粒(Fe浓度为10、100μg/mL)在CO2浓度为5％和温度为37℃下共培养4小时，以生理盐水培养作为空白对照组。清洗细胞之后，通过ICP-OES测量细胞吞噬的Fe浓度。在Fe浓度为100μg/mL时，相比表面未经PGA修饰的裸露的四氧化三铁纳米颗粒而言，SPIO-PGA纳米颗粒的细胞吞噬量明显较少(参见附图11)。因此本发明材料在进入生物体内后有望能避免被巨噬细胞吞噬，从而获得理想的造影效果。
(10)体内MR成像结果
在裸鼠体内构建HeLa移植瘤模型，通过尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒生理盐水溶液(100μL 1000μg/mL)来评价主要器官和肿瘤部位磁共振成像效果(参见附图12-14)。与注射前的磁共振图像相比，注射SPIO-PGA纳米颗粒2小时后，裸鼠肝脏和脾脏部位明显变暗，信号强度明显减弱(参见附图13a，脾脏面积过小无法准确测定信号值)。肿瘤部位的信号强度有一定程度减弱(参见附图13b)。这表明注射的纳米颗粒可以部分逃脱网状内皮系统(肝脏和脾脏部位)的吞噬，通过肿瘤部位的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)纳米颗粒被动靶向进入肿瘤部位。随着时间的延长，裸鼠肿瘤部位的MR信号强度逐渐恢复，说明SPIO-PGA纳米颗粒在体内开始代谢。MR成像 结果表明本发明制备的SPIO-PGA纳米颗粒能够用于体内主要器官和肿瘤模型的MR成像。
(11)组织分布
为了研究本发明SPIO-PGA纳米颗粒在生物体内各组织的分布代谢情况，发明人在构建了HeLa移植瘤模型的裸鼠体内通过尾静脉注射SPIO-PGA纳米颗粒生理盐水溶液(100μL，1000μg/mL)。用ICP-OES测量注射后不同时间点(2、4、6小时)Fe元素在各重要器官中的含量(参见附图14)，并设置空白裸鼠作为参考对照。从图中可以看出，与对照组相比，Fe浓度主要分布在肝脏和脾脏处，并随着时间的变化，聚集量发生变化。在2小时，肝脏中Fe浓度达到最高，随着时间的推移，Fe浓度明显降低，表明Fe元素被肝脏慢慢代谢，这与体内MR成像结果相符合；在4小时，脾脏中Fe浓度达到最高，且高于肝脏中Fe浓度，随着时间延长，Fe浓度明显降低，表明Fe元素被脾脏缓慢代谢，这与体内MR成像结果吻合。注射本发明材料6小时后，裸鼠各个器官中Fe浓度都有明显的下降。而其他器官(心、肺、肾)，Fe的聚集明显较少，在这些器官中Fe最后也被慢慢代谢。此结果表明材料能够在裸鼠体内正常的代谢清除，能进入肿瘤部位，允许肿瘤的MR显像。