酸奶的生产技术领域
本发明属于通过发酵进行酸奶生产的领域。发酵是用于使用释放酸的微生物的代
谢活性来生产酸奶的众所周知的技术。
背景技术
众所周知，释放酸的微生物可被使用在包括奶(milk)的进料(feed)培养物中，而
产生具有比奶更长的货架期的酸奶。用于使用在酸奶生产中的众所周知的释放酸的微生物
的示例是来自如下的属的微生物：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和
链球菌属(Streptococcus)。
在典型的酸奶发酵过程中，可以区分为三个阶段。当微生物与发酵进料(通常为基
于奶的进料)组合时，第一个阶段开始。微生物适应于它们的新环境，并且开始摄取营养物，
如肽、氨基酸、维生素和矿物质。在该阶段，微生物生成用于细胞分裂和生长，用于消耗能
量，以及用于制备储备物质，结构单元或营养物所需要的酶。然而，在该阶段，几乎没有微生
物生长，也没有表明发酵中任何事情正在发生的任何其他可见迹象。由于这个原因，该阶段
被称作延滞期。
延滞期的特征在于某些营养物的存在对于生长可能是限制因素。一个示例是这样
的系统，在所述系统中，肽的量不足以允许正常的微生物生长或者不足以维持正常的微生
物生长速率。只要肽的存在继续不足，生长就会继续受到肽浓度的限制。尽管似乎什么都没
有发生，但是该阶段对于发酵过程是非常重要的，因为微生物种群的健康决定了所得到的
酸奶的质量。
当微生物已经适应了它们的环境，第二个阶段启动。该阶段被称作指数期，其特征
在于非底物限制的微生物生长。在指数期期间，微生物开始通过细胞分裂来生长，并且因此
以指数方式繁殖。在该阶段，由于它们的代谢特性，除了别的以外，微生物还生成乳酸。
在指数期结束时，适合的营养物的量通常已经减少，从而发酵奶混合物不能再维
持指数生长。因此，生长放缓，而发酵进入静止期。在该阶段，尽管仍然发生细胞分裂，但是
生长不再是指数的，并且发酵混合物慢慢地在所有存在的化合物中达到平衡。如果所有情
况都是适合的，这会产生高质量的、具有均衡的风味和气味的酸奶产品。
这些阶段所需要的时间是高度可变的，并且取决于所使用的一种或多种微生物的
类型、发酵进料的类型、温度以及许多其他参数。考虑到这些不同的阶段，酸奶的生产通常
是分批式过程。如在分批式过程中常见的，成本方面的重要因素是完成产品所需要的时间。
生产时间的重要因素是延滞期。在该阶段，实际发酵过程准备妥当。除了为微生物
生长创造适当的条件之外，所述延滞期根本无助于感兴趣的产品的制作，并且正因如此，较
短的延滞期将对发酵过程的经济性具有很大的影响。然而，延滞期对于决定微生物种群的
健康是非常重要的，反过来，所述微生物种群的健康对于酸奶的质量是重要的。度过延滞期
且发酵过程到达指数期所需要的时间被称为延滞时间。
以前已进行尝试来减少延滞时间。一个选择是使用半连续式发酵过程，其中使微
生物适应于生产阶段，并且在指数期保持延长的一段时间。然而，这通常是不适合的，因为
静止期对于决定酸奶的最终味道和/或质量是重要的，而该阶段在这样的半连续式过程中
被绕过了。
同样，可能的是添加混合的微生物(被称作发酵起始剂(starter)培养物)，所述混
合的微生物已经适应于发酵的培养基条件。然而，这会产生不同的问题，因为在小规模预混
合微生物进料中，工业规模的发酵罐的环境很难复制。可能的是使用较大体积的预培养物
(接种物)，但是这对生产过程和预培养阶段的成本具有很大影响。因此，将优选的是用有限
量的发酵起始剂培养物以可靠的方式减少延滞时间，所述方式可能比用该技术更进一步地
减少延滞时间。
对于减少延滞时间，还可能的是向预混合物添加额外的容易运输的并且能量有益
的营养物，例如额外的肽。然而，这会产生附加的成本，以及例如异味和着色的问题。
发明内容
本发明涉及一种用于通过发酵制备酸奶的方法，包括以下步骤：在适合的培养基
中提供包括选定的微生物的发酵起始剂(fermentation starter)培养物，向所述培养基添
加植物蛋白蛋白酶抑制剂(优选地马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂)，在所述培养基中培养所述微
生物，以及收获所述酸奶。
已经发现，向发酵进料添加马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂显著地减少发酵的延滞时
间。所需要的马铃薯蛋白的量足够低而不会影响酸奶的味道，并且在分批式过程和在半连
续式过程两者中都出现延滞时间的减少。
附图说明
图1：用于酸奶生产的流程图。
图2：在不同浓度的PPII下，酸奶制造期间的时间依赖型pH降低；较高浓度的PPII
导致更快的pH降低。
图3：酸奶产品的照片
图4：在有和没有预发酵热处理的情况中，在不同浓度的PPII下，使用标准培养物
和3.5％的乳蛋白，在酸奶制造期间达到pH 5时的时间减少。
图5：在酸奶制造期间，在不同浓度的PPII下、使用添加至3.5％的乳蛋白的标准培
养物而制作的酸奶，达到pH 5.0、5.3和4.7时的发酵时间的生长曲线图。
图6：使用添加至3.5％的乳蛋白的标准培养物，在不同温度下，在有和没有预发酵
热处理的情况中，在不同浓度的PPII的存在下，获得用于发酵的目标pH 5.0时的时间减少。
图7：茄酸PPII蛋白对由经修饰的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)生成分枝放线
菌过氧化物酶(ArP)(Arthomyces ramous Peroxidase)的冻干组分的蛋白酶抑制。
图8a：马铃薯蛋白酶抑制剂分离物、大豆蛋白酶抑制剂和豌豆蛋白酶抑制剂对酸
奶生产时间上的剂量依赖型时间减少。
图8b：在有和没有预发酵热处理(80℃，30分钟)的情况中，使用标准发酵起始剂培
养物并且使用PPII、豌豆蛋白和大豆粉时，在酸奶制造期间达到pH 5时的剂量依赖型时间
减少。
图9：使用六种不同的酸奶起始培养物，在酸奶制造中达到pH 5时的剂量依赖型时
间减少。
图10a：当通过OD600观察时，在增加的肽浓度下，微生物随时间的生长。当向培养
基添加肽时，观察到生长方面的明显优点。在该具体情况中，用该发酵起始剂培养物，在超
过75％的肽的肽浓度下，该培养基不再表现为肽限制的(peptide-limited)。
图10b：通过OD600nm的评估，在添加PPII后，针对不同的肽浓度的剂量依赖型时间
减少。在该具体实施例中，在具有超过75％(酵母提取物和酪蛋白胨)的肽浓度的培养基中，
针对PPII没有观察到延滞时间减少。在具有低于75％(YE和CP)的肽浓度的培养基中，示出
对于该发酵通过PPII获得的剂量依赖型时间减少。
具体实施方式
本发明涉及一种用于制备酸奶的方法，包括以下步骤：在适合的培养基中提供包
括选定的微生物的发酵起始剂培养物，向所述培养基添加植物蛋白蛋白酶抑制剂(优选地
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂)，在所述培养基中培养所述微生物，以及收获所述酸奶。
已经发现，向发酵进料添加少量的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂(如马铃薯蛋白酶抑
制剂分离物(“PPII”))显著地减少发酵的延滞时间，这在酸奶的生产中具有经济上的益处。
所需要的马铃薯蛋白的量足够低而不会影响酸奶的味道，并且在分批式过程和在半连续式
过程两者中都出现延滞时间的减少。在本发明的上下文中，延滞时间减少还可以被称作“刺
激活性”(SA)。
同样，本发明可以应用在宽的pH范围和温度范围内。
本方法针对用于酸奶的生产的发酵过程。优选地，本发明应用在其中微生物的生
长是肽限制的发酵过程中。针对本发明的范围，肽是由5-30个氨基酸组成的小的蛋白质片
段；这样的片段还被称作“营养肽”。
肽限制的发酵是这样的发酵，其中游离的营养肽的浓度受到限制，而其中其他必
需的营养物(如(痕量)矿物质、碳水化合物和蛋白质)是可自由获得的。当由蛋白酶/肽酶将
营养肽降解为氨基酸的速率高于从蛋白质形成营养肽的速率时，出现这种肽的限制。可以
通过观察少量的肽的添加对生长和延滞时间的作用，来检验发酵是否是肽限制的。当营养
肽的添加不导致实质上更快的发酵时，那么发酵不是肽限制的。当营养肽的添加的确导致
更快的发酵时，那么发酵可以被称作肽限制的。
这意味发酵速率依赖于可获得的营养肽的浓度。在肽限制的发酵的情况中，营养
肽不足以维持或者适应于微生物的指数生长。这导致延滞时间的增加。
在本发明的方法中，特别是对于肽限制的发酵，并且特别是在可获得足够的蛋白
质的情况中，发现添加相对少量的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂减少延滞时间。
意想不到的是，特别是在包含肽限制的发酵的方法中，延滞时间被减少了。众所周
知，在决定发酵的延滞时间方面的重要因素是蛋白质在培养基中降解为5-30个氨基酸的小
的营养肽。该转变受到各种各样的蛋白酶的影响。蛋白酶抑制剂的众所周知的功能是抑制
蛋白酶，有效地抑制负责将蛋白质降解为营养肽的蛋白酶。同样，将预期的是，任何来源的
蛋白酶抑制剂的添加将会由于较慢的蛋白质的酶促降解以及相关联的较慢的营养肽的形
成，而导致增加的延滞时间。然而，现在发现事实上情况恰恰相反，马铃薯蛋白蛋白酶抑制
剂的添加导致减少的，而非增加的延滞时间。
在本发明上下文中，延滞时间被定义为微生物适应新环境(培养基)所需要的持续
时间。这是延滞期所需要的持续时间。
可以经由各种适合的代谢输出参数来监控酸奶发酵过程。例如，pH可能是适合的
代谢输出参数。可替换地，光密度(在600nm处的OD，OD600)可能提供适合的输出参数，以提
供对所存在的微生物的量的量化。然而，技术人员可以想到许多方式来确定发酵的进程，并
且确定酸奶生产中延滞期所需要的时间。
如本领域众所周知的，发酵一般通过以输出参数(如光密度或pH)表示的S形曲线
进行。在本发明中，达到指数曲线的中间点的时间通过计算来自其二次导数的平滑的S曲线
中的拐点来获得。可替换地，当使用pH作为代谢进程的指标时，人们采取指数曲线的中点pH
值，并且记录直至达到该pH的时间。在酸奶生产中，可以使用pH 5.0和pH 5.5之间的任何
pH，只要始终应用该值，以允许适当的比较。可以通过比较没有添加马铃薯蛋白酶抑制剂的
发酵与其中添加了适当量的马铃薯蛋白酶抑制剂的相同的发酵的延滞时间，来确定延滞时
间的减少。一般地，绝对延滞时间减少被量化为减少的小时，而相对延滞时间减少被量化为
“％”。
天然马铃薯蛋白可以暂且被分成三类：(i)马铃薯糖蛋白家族，高度同源的酸性的
43kDa的糖蛋白(马铃薯蛋白的40wt.％-50wt.％)；(ii)碱性的5-25kDa的蛋白酶抑制剂(马
铃薯蛋白蛋白酶抑制剂)，当被分离时，所述蛋白酶抑制剂被称为马铃薯蛋白酶抑制剂分离
物或“PPII”(马铃薯蛋白的30wt.％-40wt.％)；以及(iii)其他蛋白质，大部分为高分子量
蛋白质(马铃薯蛋白的10wt.％-20wt.％)(Pots等,J.Sci.Food.Agric.1999,79,1557-
1564)。
PPII可以基于它们的分子量被分成不同的组。不同组的蛋白酶抑制剂被确认为蛋
白酶抑制剂I(约39kDa的分子量)、羧肽酶抑制剂(约4100Da的分子量)、蛋白酶抑制剂IIa和
IIb(约20.7kDa的分子量)，以及蛋白酶抑制剂A5(约26kDa的分子量)。这些不同组的蛋白酶
抑制剂在总的马铃薯蛋白中的比率取决于马铃薯的品种。
针对本发明的范围，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂包括任何马铃薯蛋白蛋白酶抑制
剂，或者不同的马铃薯蛋白的任何混合物，所述混合物包括如上文限定的一种或更多种马
铃薯蛋白蛋白酶抑制剂或者抑制剂组。马铃薯蛋白酶抑制剂分离物(PPII)是包括马铃薯蛋
白蛋白酶抑制剂的分离物。PPII可以以任何已知的方式获得，如通过(例如)沉淀、在60℃-
80℃下热分级分离、膜分离、用硫酸铵或饱和脂肪酸或其他组分沉淀、过滤技术如超滤或凝
胶过滤。
优选地，在本发明中使用PPII。可以如WO2008/069650中描述的获得所述PPII，所
述专利的内容通过引用被并入本文，其中描述了对来自马铃薯果汁(PFJ)或马铃薯果味水
(potato fruit water)(PFW)的蛋白酶抑制剂的分离物的详尽描述。
该过程需要使马铃薯果汁在7-9的pH下经受二价金属阳离子的絮凝作用，并且将
絮凝的马铃薯果汁离心，由此形成上清液。随后，使上清液经历扩张床吸附层析(所述扩张
床吸附层析是使用能够结合马铃薯蛋白的吸附剂、在小于11的pH以及5℃-35℃的温度下操
作的)，由此将天然的马铃薯蛋白吸附到吸附剂。结合一定量的天然马铃薯蛋白的柱材料包
括混合模式的吸附剂(adsorbentia)，如(例如)Amersham StreamlineTM Direct CST I(GE
医疗)、Fastline吸附剂(Upfront Chromatography A/S)，大孔吸附剂如AmberliteTM
XAD7HP(&Haas公司)以及离子交换吸附剂。可替换地，高度优选包括如欧洲专利申请
12175944.3中公开的包括配体的吸附剂来分离适合于使用在本发明中的PPII。
最后，用洗脱液从吸附剂上洗脱至少一种天然马铃薯蛋白分离物。除了其他以外，
该方法还获得了具有存在最少的变性蛋白并且以稳定的溶解性为特征的高纯度的PPII。因
此，该方法获得天然PPII。在本发明的方法中，天然PPII一般是优选的。
根据在Spelbrink等人，The Open Food Science Journal 2011(5)p42-46
“Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices
(以复矩阵定量测定胰蛋白酶的抑制活性)”或者在ISO 14902:2001E“Animal Feed
Stuffs-Determination of soya products(动物饲料——大豆产品的测定)”中描述的方
法，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的数量可以通过测量针对胰蛋白酶的抑制效果来确定。
作为使用马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的替换方案，如在PPII中，可能的是使用从
PPII中分离的进一步纯化的蛋白质组分。优选的蛋白质组分
ο在pH 8下是可溶的
οpKa<8
ο具有TIA和CTIA两种活性，但是任一种活性都不能经受住在80℃下热处理30分
钟。尽管如此，延滞时间减少的能力直至至少90℃仍保持为不受影响。
ο具有在17.5kDa和18.2kDa之间的分子量。
根据在Spelbrink等人，The Open Food Science Journal 2011(5)p42-46
“Quantitative Determination Trypsin Inhibitory Activity in Complex Matrices
(以复矩阵定量测定胰蛋白酶的抑制活性)”或者在ISO 14902:2001E“Animal Feed
Stuffs-Determination of soya products(动物饲料——大豆产品的测定)”中描述的方
法，TIA活性通过测量蛋白质针对胰蛋白酶的抑制效果来确定。
CTIA活性通过测量蛋白质针对糜蛋白酶的抑制效果来确定。要使用的方法本质上
与针对TIA描述的方法相同，但是需要更高的酶剂量来补偿糜蛋白酶较低的比活。
使用马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的优点在于大多数是非常热稳定的。马铃薯蛋白蛋
白酶抑制剂分离物中负责延滞时间减少的活性部分直至60℃、优选地70℃、更优选地80℃，
并且最优选地90℃的温度仍能使它的天然状态保持至少15min、优选地至少90min。这允许
在发酵过程中的不同点处添加马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂。可以在添加发酵起始剂培养物之
前、之后或者期间，将所述马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂添加到培养基中，或者可以将它添加到
发酵起始剂培养物本身中。
同样，可以在发酵之前加热发酵进料的过程中，将所述马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂
添加到发酵进料中。例如在发酵之前需要巴氏灭菌或灭菌(常见于许多酸奶生产过程中)的
过程中就是这样。
本发明的另外的优点在于，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂在非常低的浓度下在所描述
的发酵过程中也是起作用的。具体是，添加小于1g/l、优选地小于0.5g/l、更优选地小于
0.1g/l、甚至更优选地小于0.05g/l的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂足以减少根据本发明的发
酵过程中的延滞时间。需要至少0.01g/l、优选地0.005g/l、更优选地0.001g/l的最少量的
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂来减少根据本发明的发酵的延滞时间。
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的优选浓度在例如5g/l和0.001g/l之间，优选地在5g/l
和0.05g/l之间，更优选地在5g/l和0.01g/l之间，如在1g/l和0.01g/l之间。在本文上下文
中，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的浓度被表示为每升培养基中马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的g
数。
在这些浓度下，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂不会赋予酸奶任何味道，这是附加的优
点。而且另外，这些低浓度的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂对于酸奶的感官特性没有可检测的
影响。然而，大于0.5％直至2％的较高浓度的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂改善最终酸奶产品
的结构和感官特性，例如柔滑度(smoothness)。
在发酵过程中，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂在宽的pH范围内起到作用也是本发明的
优点。具体地，培养基中的pH可以为直至6.7、优选地8.0、更优选地直至10.0。同样，pH可以
低至4、优选地低至3、更优选地低至2。马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂在宽的pH范围内的稳定性
是有利的，因为它允许通过发酵来加工具有各种pH的培养基。另外，它允许酸奶发酵在整个
发酵过程中从马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的添加中受益。
此外，本发明的独特优点在于马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂是不引起过敏的。这意味
它可以被使用在由对其他蛋白质过敏的人操作的酸奶发酵过程中。同样，这意味它可以被
使用于这样的酸奶的发酵，其中所述酸奶可以被具有过敏症的人食用，而不会有过敏性休
克风险。
另外，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的优点在于该蛋白质的溶液，优选地水性溶液，在
直至至少10g/L、优选地50g/L、更优选地250g/L的浓度下，是澄清的，或者至少是基本上非
浑浊的。这些浓度优选地是在2至5、优选地2-4、更优选地2.5-3.5的溶液pH下达到的。澄清
的或者基本上非浑浊的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂溶液允许方便的过滤灭菌以及酸奶的诱
人外观。
在马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂与来自其他来源的蛋白酶抑制剂的比较中，发现与马
铃薯蛋白蛋白酶抑制剂相反，鸡蛋蛋白蛋白酶抑制剂在可比较的剂量下并没有表现出延滞
时间的减少。同样，乳清蛋白分离物(WPI)和羧肽酶抑制剂(CPI)在可比较的剂量下也没有
表现出延滞时间的减少。
然而，当添加到适合的培养基(如包括奶的一种培养基)中时，大豆蛋白蛋白酶抑
制剂和豌豆蛋白蛋白酶抑制剂可以显示出延滞时间的减少。然而，需要更高剂量的大豆蛋
白蛋白酶抑制剂或豌豆蛋白蛋白酶抑制剂，因为对于豌豆和大豆蛋白，在相同剂量下的延
滞时间减少显著低于马铃薯蛋白(参见图8a)。
目前针对马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂在具有减少的延滞时间的发酵方法中的使用
所描述的所有参数也都适用于豌豆蛋白和大豆蛋白蛋白酶抑制剂，并且针对马铃薯蛋白蛋
白酶抑制剂所描述的任何参数或参数的组合也都被认为对于豌豆蛋白蛋白酶抑制剂和大
豆蛋白蛋白酶抑制剂是有效的。因此，植物蛋白蛋白酶抑制剂(如来源于被子植物(开花植
物)或烹饪用蔬菜的那些植物蛋白蛋白酶抑制剂，优选地豌豆、大豆和马铃薯蛋白蛋白酶抑
制剂)可以类似地被使用在根据本发明的具有减少的延滞时间的酸奶发酵方法中。
然而，并非马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的所有优点都能类似地应用于其他植物蛋白
蛋白酶抑制剂。具体地，大豆粉没有表现出马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的热稳定性。因此，大
豆粉不能被使用在其中在发酵之前大豆粉与培养基一起加热的发酵方法中(如在灭菌之前
包括巴氏灭菌或(过滤/加热)灭菌步骤的方法中)来减少延滞时间。这是马铃薯蛋白蛋白酶
抑制剂优于大豆粉中的大豆蛋白蛋白酶抑制剂的优点。
分离的豌豆和大豆蛋白蛋白酶抑制剂表现出热稳定性。当用PPII执行根据本发明
的发酵时，热处理步骤之后的延滞时间减少与没有之前的热处理步骤的情况下观察到的延
滞时间减少差不多相同。这对于分离的豌豆和大豆蛋白是类似的，所述豌豆和大豆蛋白的
活性与没有之前的热处理步骤的情况差不多相同，尽管如上文描述的，按绝对值计，豌豆和
大豆蛋白的延滞时间减少低于马铃薯蛋白。
相对于使用马铃薯蛋白，使用豌豆和大豆蛋白的另外的缺点是延滞时间减少上的
较低活性使得需要更高的浓度。这导致所添加的蛋白质赋予酸奶味道的增加的风险，这就
是缺点。
另外，豌豆和大豆蛋白蛋白酶抑制剂都是引起过敏的蛋白质，所述豌豆和大豆蛋
白蛋白酶抑制剂由于相对于马铃薯蛋白增强的风险和规范而对于应用在一般的食物生产
过程中是难处理的。
因此，关于在发酵中的热稳定性、延滞时间减少和一般工业适用性方面，马铃薯蛋
白蛋白酶抑制剂优于来自其他来源的蛋白酶抑制剂。然而，任何植物蛋白蛋白酶抑制剂(如
来源于被子植物(开花植物)或烹饪用蔬菜的那些植物蛋白蛋白酶抑制剂，优选地豌豆、大
豆和马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂)在添加到酸奶发酵进料后都表现出延滞时间的减少。
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的所有上述优点也都适用于PPII，其中所述PPII被用作
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂。
具体地，在PPII的情况中，优点在于PPII包括高量的热稳定部分，所述热稳定部分
类似地允许根据本发明的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂使用在发酵之前加热发酵进料的过程
中。一般地，PPII包括在20wt.％和80wt.％之间，优选地在40wt.％和60wt.％之间的热稳定
的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂，从而仅低量的PPII的添加导致减少的延滞时间。同样在该情
况中，不会向最终产品赋予味道。
可替换地，在将马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂应用在发酵过程之前，可以从PPII分离
PPII的热稳定部分。这可以通过热沉淀和之后对PPII中非热稳定的蛋白质的过滤来完成，
于是PPII的热稳定部分被分离为热稳定的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的溶液，所述溶液可以
可选地例如通过冻干被分离为粉末。可替换地，可以通过对PPII的分级分离，如通过离子交
换层析法(通过在对应于热稳定的蛋白酶抑制剂中的大多数的pH下进行洗脱)，并且还通过
吸附过程、膜过滤、凝胶过滤或选择性沉淀，来获得热稳定的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂。
用于通过发酵制备酸奶的方法的微生物是适合于生产酸奶的那些微生物。适合的
微生物包括(例如)来自乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和双歧
杆菌属(Bifidobacterium)的微生物。
发酵起始剂培养物，在本发明上下文中，是包括适合于获得酸奶的一种或更多种
微生物的培养物。发酵起始剂培养物可以包括单个微生物类型，或者它可以包括两种或更
多种微生物。适合的发酵起始剂培养物包括存在于克非尔(Kefir)中的生物体，如乳酸菌和
酵母，以及乳杆菌属、乳球菌属、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)、肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸乳
球菌(Lactococcus lactis)、乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)，例如双醋酸乳球菌
(Lactococcus diacetylactis)和乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)的混合物。
培养基必须是适合于酸奶发酵的。适合的培养基包括奶，如(例如)奶牛奶、山羊
奶、绵羊奶、牦牛奶、马奶、驯鹿奶、驼鹿奶、水牛奶、驴奶和/或骆驼奶，优选地奶牛奶。
发酵期间的培养条件可以是已知用于酸奶发酵的那些培养条件。培养条件可以是
需氧的或厌氧的，并且如果是需氧的，可以包含低的、正常的或高的充气量。培养可以是固
态或液态培养，并且可以在分批式或半连续式加工方法中以任何规模完成。氧气水平可以
从无(厌氧发酵)到有(需氧发酵)变化。加工可以是搅拌以及静态两种。
发酵期间的温度可以从-10℃至+60℃，优选地从13℃-45℃变化。优选地，温度保
持恒定。pH可以从pH 2-10，优选地4–6.7变化。培养时间是高度可变的，并且取决于培养物
的类型。技术人员清楚知道对于酸奶适合的培养时间。因此，培养时间可以在0.5hr和10年
或以上之间变化，或者其间的任何时间。
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的添加可以发生在发酵之前的任何时间。这样的添加可
以通过将马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂与培养基组合为经过滤或巴氏灭菌的蛋白质浓缩溶液，
并且随后添加发酵起始剂培养物来完成，或者可替换地，通过将发酵起始剂培养物与天然
马铃薯蛋白组合，并且将该混合物与培养基组合来完成。可替换地，根据具体情况，可以单
独地添加所有组分，或者与培养基的其他成分组合添加所有组分。这样的培养基的其他成
分可以包括例如碳水化合物、痕量矿物质、大量矿物质(bulk minerals)、蛋白质、肽。
在非常优选的实施方案中，可以在加热步骤之前，将马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂添
加到培养基中。当在添加发酵起始剂培养物之前，如为了巴氏灭菌或灭菌要加热培养基时，
这是有利的。由于马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的有利的热稳定性，即使在这样的加热之后，马
铃薯蛋白蛋白酶抑制剂仍能保持它的天然状态，从而甚至在加热之后，仍保留它的天然生
化功能，而减少发酵的延滞时间。
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂(优选地，处于天然状态)的添加具有减少发酵的延滞时
间的效果。取决于培养物和培养基，相对于其中不添加马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的相同的
发酵方法，延滞时间被显著地减少了如至少10％、优选地至少25％、更优选地至少50％、更
优选地至少60％并且最优选地至少90％。
可以采取本领域已知的用于发酵后分离酸奶的任何形式来收获酸奶。具体地，可
以通过监控适合的代谢输出参数(如pH或光密度)、确定发酵终点以及分离酸奶来获得酸
奶。
现在将通过以下非限制性实施例进一步阐明本发明。
实施例
实施例1：酸奶的生产
PPI-分离物是马铃薯蛋白酶抑制剂分离物，并且可以被缩写为PPII。PPI-分离物
已在过程中2个不同的点处被添加到发酵混合物，即1)在巴氏灭菌之前添加到奶中，以及2)
在巴氏灭菌之后与发酵起始剂培养物一起添加到奶中。第三个选择是在发酵起始剂培养物
的生产期间添加PPII，记住PPII在奶/酸奶中的最终浓度。
图1中图示地给出过程。通过巴氏灭菌奶(除非另有说明，在80℃下，30min)并且冷
却至40℃-42℃来制备新鲜的酸奶。该图中示出可以添加PPI-分离物的可能的过程步骤。注
意到，当以更高的剂量添加PPII时，pH降低。因此，建议的是，用例如NaOH将pH重新调节至pH
6.7，因为较低的pH会影响酸奶的质地。
为了制备酸奶，将奶与2％(w/w)的商业酸奶或者来自例如CSK Food Enrichment
B.V.(1单位/10L≈0.02％(m/m))或来自DSM、CY(5单位/1000L)的建议量的发
酵起始剂培养物接种，并且发酵4h-7h，以达到4.5的pH。所使用的标准酸奶培养物(
-Star Y200)包含乳酸菌嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus
bulgaricus)。小规模(25-50mL)进行实验，并且接种之后立即在40℃-42℃的水浴中培育样
品。
一旦pH达到pH 4.5，就停止所有实验。在发酵期间以2-15分钟的间隔自动记录pH
(WTW,德国)。
图2中示出用2％的酸奶剂量作为接种物时，发酵期间的酸化曲线。具有0％的PPII
的参照酸奶在5:45h后达到pH 5.0。具有0.025％的PPII的酸奶在3h后达到pH 5.0。以PPII
制作的酸奶的发酵时间显著地短于空白酸奶的发酵时间。可以达到的时间减少很大程度上
取决于接种物的生存力和生长期。当接种物中的细胞处于静止期时(例如，当使用2％的酸
奶作为接种物时)，空白/参照酸奶的延滞时间非常大，并且因此可能的时间减少非常高。
实施例2：酸奶生产中的延滞时间减少的PPII依赖性
根据实施例1，用范围为从0.005％(w/w)至0.025％(w/w)的不同的PPII剂量制备
酸奶。针对PPII的剂量浓度标绘出通过添加PPII所获得的时间减少。使用发酵达到pH 5.0
需要的时间来比较各种剂量的PPII对于延滞时间的效果。如图2中示出的，随着增加的量的
马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂分离物，发酵时间显著地减少。
实施例3：马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂分离物的热稳定性
在巴氏灭菌之前或之后添加PPII都会产生可比较的剂量依赖型时间减少曲线(图
4和6)。如先前两个实施例描述的，使用预先限定的发酵起始剂培养物来制备酸奶。在巴氏
灭菌之前将PPII添加到奶中。奶-PPII预混合物没有经过巴氏灭菌(室温，RT)，或者在3个不
同的温度，80℃、85℃和90℃下进行巴氏灭菌30分钟。对于所有样品，所获得的(绝对和相
对)时间减少都取决于PPII的剂量，并且在不同的热处理之间没有观察到显著的区别。在该
实验中发现最佳的PPII剂量为0.1％的PPII，而该剂量产生了显著的相对时间减少(≈
20％)。
实施例4：用于使用在本发明中的马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂可以是天然的
通过在50℃下将蛋白质溶解在包含5mM的CaCl2的100mM、pH 5.0的柠檬酸盐缓冲
液中(SigmaAldrich,C3881)并且冷却回37℃，来制备30g/L的偶氮酪蛋白(SigmaAldrich,
A2765)储备溶液。将包含蛋白酶活性的冻干的真菌溶解产物溶解在1mM的HCl溶液中。将
PPII溶解在pH 3.0的醋酸盐溶液中。
以这样的方式由PPII溶液制备一系列稀释液，从而在针对最高样品浓度培育后导
致～50％的信号损失。从每种稀释液取125μL与25μL的真菌蛋白酶溶液在艾本德杯
(eppendorf cup)中混合，或者作为对照，与25μL的软化水混合。针对蛋白水解反应的阳性
和阴性对照使用125μL的软化水而非样品材料。向这些混合物添加225μL的温的偶氮酪蛋
白，接着在37℃、0℃下培育30分钟。随后通过添加150μL15％w:v的TCA溶液淬灭反应。添加
偶氮酪蛋白的顺序与添加TCA的顺序相同，以确保对于所有样品具有相等的培育时间。(参
见图7)
使用Thermo Scientific转子，在Heraeus Multifuge 1SR中，通过在40℃下15,
000g离心10分钟除去未水解的偶氮酪蛋白和其他不溶物。将100μL的上清液通过小心的移
液转移到微量滴定板，并且补充100μL的1.5M的NaOH溶液。随后在BioRad Model 680酶标仪
上分析所述板在450nm处的吸光度。
针对板中样品材料的量标绘吸光度。使用最小二乘法经由线性回归获得所得到的
线的斜率，并且所述斜率表示每单位数量的样品材料所损失的吸光度的量。在没有样品时，
阳性对照表示由已知量的蛋白酶溶液造成的最大吸光度。因此，通过斜率除以阳性对照的
吸光度，获得胰蛋白酶抑制活性，所述胰蛋白酶抑制活性被表示为每单位量的样品材料所
抑制的蛋白酶的量。
由此得出结论，本实验所使用的PPII可以是天然的。
实施例5：与来自其他来源而非马铃薯的蛋白酶抑制剂蛋白质的比较
针对它们减少酸奶发酵中的延滞时间的能力，检验来自两种植物来源，豌豆和大
豆的蛋白酶抑制剂，因为对于大规模商业加工来说，这些蛋白是最容易获得的。此外，检验
鸡蛋蛋白，因为这代表动物来源的饮食蛋白酶抑制剂的主要来源。
检验两种类型的豌豆蛋白，来自Cosucra的C9和F9。同样，使用生
的大豆粉(SigmaAldrich)和大豆蛋白(Profam,ADM)，以及鸡蛋蛋白和PPII。图8a示出在使
用CSK Food Enrichment B.V.的Y200的发酵中，针对大豆和豌豆蛋白两者
的剂量依赖型时间减少，其中，蛋白质不经历发酵前的热处理。鸡蛋蛋白仅表现出较小的延
滞时间减少(未示出)。生的大豆粉表现出比豌豆蛋白更高的延滞时间减少，但是在蛋白最
终浓度时剂量已被耗尽，这意味需要非常高剂量的大豆粉。然而，如通过使用PPII例证的，
使用大豆蛋白的延滞时间减少明显地小于使用马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂的延滞时间减少。
对于豌豆蛋白，使用C9和F9两者。如通过使用PPII例证的，两种
类型给出相同的延滞时间减少，这远小于针对马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂观察到的延滞时间
减少。
如可以从图8a中看到的，针对酸奶发酵，PPII表现为具有最高的延滞时间减少，并
且优于豌豆和大豆蛋白两者，产生更短的发酵时间。
马铃薯蛋白、分离的大豆蛋白和分离的豌豆蛋白表现为耐热的。针对这些蛋白，在
剂量依赖型酸奶延滞时间减少方面，在热处理(80℃，持续30分钟)之前和之后这两点之间
没有观察到显著变化。然而，生的大豆粉的延滞时间减少没能经受住热处理(图8b)。
图6：在各种发酵系统中的延滞时间减少，第一例
为了证实不同的酸奶系统中的PPII的延滞时间减少，检验了不同的商业发酵起始
剂培养物。选择发酵起始剂培养物，从而可以按照最终酸奶的粘度和后酸化的次序评估最
大变化。所检验的发酵起始剂培养物是CSK Food Enrichment B.V.的酸奶培
养物Y200、Y700、Y900、Y104和Y508(嗜热链球菌(St.thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚
乳杆菌亚种(Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus)的各种混合物)，以及B193(嗜热链球菌、
德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种、嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)和双歧杆菌的混合物)。
在所检验的6种发酵起始剂培养物中，在以0.05％-0.20％的PPII剂量添加PPII
后，所有6种都表现出显著的延滞时间减少(图9a)，导致减少的酸奶生产时间。
实施例7：确定发酵系统是否为肽限制的
可以执行剂量响应检验来评估系统是否为肽限制的。此处以模型系统示出原理，
其中在发酵期间可获得的肽的浓度是变化的。在酸奶发酵系统中，肽浓度可以类似地变化，
以确定酸奶发酵是否为肽限制的。
该检验中使用的培养基是被标记的培养基A-H，并且发酵起始剂培养物是根据实
施例1的。通过在600nm处的光密度(OD600)监控发酵进程。
按如下制备所有的培养基A-H，在pH 6.2-6.5时，向1000ml的水中添加：20g的葡萄
糖(Merck 1.08342)，1g的tween-80(Merck 822187)，2g的K2HPO4(Merck 1.05104)，5g的醋
酸钠(Merck 1.06267)，2g的柠檬酸铵(SigmaAldrich 09833)，0.2g的MgSO4-7H2O
(SigmaAldrich M5921)，0.05g的MnSO4-H2O(SigmaAldrich M7634)，以及10g的肉提取物
(Fluka 70164)。另外，如表1中示出的，培养基包含许多酵母提取物(“YE”，Fluka 92144)和
酪蛋白胨胰蛋白酶消化物(“CP”，肽源，Fluka 70172)。
表1用于培养基A-H的配方
培养基
酵母提取物，YE[g]
酪蛋白胨胰蛋白酶消化物，CP[g]
A
0
0
B
0.5(10％)
0.1(10％)
C
1.25(25％)
2.5(25％)
D
2.5(50％)
5(50％)
E
3.75(75％)
7.5(75％)
F
5(100％)
10(100％)
G
7.5(150％)
15(150％)
H
10(200％)
20(200％)
图10a清楚地示出增加量的肽对于酸奶发酵起始剂培养物的生长的作用。配方
“E”、“F”、“G”和“H”示出差不多相同的结果，表明没能达到延滞时间的进一步减少。这意味
配方“E”(75％的YE和CP)是用于该发酵起始剂培养物的最佳培养基。相对于最小培养基
“A”，在生长方面明显的优势是针对“B”观察到的。对于培养基“C”和“D”，结果相同。这意味，
在这些情况中，用于该发酵起始剂培养物的培养基是肽限制的，导致显著的延滞时间减少。
图10b示出PPII添加到具有不同剂量的肽(YE和CP)的培养基的效果。在该具体实
施例中，在具有直至75％的酵母提取物和酪蛋白胨的肽浓度的培养基中，针对PPII的添加
可以观察到延滞时间减少。在具有75％和以下的YE和CP的肽浓度的培养基中，示出通过
PPII对该发酵的剂量依赖型时间减少。
实施例8：刺激剂(stimulating agent)的纯化和表征
基本上根据Pouvreau的方法(Pouvreau 2001)分级分离马铃薯蛋白。
用除盐水将马铃薯蛋白浓度(AVEBE)稀释为1％的蛋白质溶液，并且将pH设置为
8.0。通过在环境温度下5000g离心10分钟除去不溶物。将上清液装到包含Source30Q树脂
(GE医疗)的15×2.6cm的柱上，并且用0至0.6M的线性NaCl梯度洗脱。这产生被标记为F1至
F8的8个分离的蛋白质组分。
根据实施例1中的方法，针对延滞时间减少检验了所有组分。这显示组分F1和F6包
含强的延滞时间减少，表明这些组分中存在有效成分，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂。根据这些
实验，组分F2、F3、F4、F7和F8具有中等的延滞时间减少，而F5根本没有表现出延滞时间减
少。因此，F5中不存在有效成分，马铃薯蛋白蛋白酶抑制剂。在实验条件下活性成分结合到
柱的事实显示，所述活性成分在pH 8.0时是水溶的，并且具有8.0或更低的等电点。
在变性、还原条件下，根据生产商的说明在Experion自动化电泳系统(BioRad)上
测定组分的分子量。包含强的延滞时间减少的组分F1和F6具有共同的若干MW条带，但是这
些中只有一个不存在于组分F5中：出现在17.5kDa和18.2kDa之间的条带(表2)。因此，由此
得出结论，该条带的存在表示强的延滞时间减少。
表2
根据本方法对蛋白酶抑制活性进行的测定明确显示，蛋白质组分F1和F6包含胰蛋
白酶抑制活性和糜蛋白酶抑制活性两者，但是任一种活性都不能经受住在80℃下热处理30
分钟。尽管如此，如实施例3中示出的，延滞时间减少直至至少90℃仍保持为不受影响。这证
明，TIA或CTIA都不是延滞时间减少的绝对要求。