一种重组腺病毒技术领域
本发明涉及一种生物医药，特别是一种重组腺病毒。
背景技术
骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长
是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。目前常见的治疗方法有手
术和放射，但手术治疗无法彻底根除肿瘤细胞，放射治疗对自身的健康细胞也会造成不可
逆转的损伤；由于成骨肉瘤对化学药物的敏感性不高，目前没有有效的化学药物。p53基因
是与人类肿瘤高度相关的抑癌基因之一，其中成骨肉瘤患者即存在着p53基因突变，失去了
有功能的p53蛋白。野生型p53基因突变后产生的突变型p53蛋白石一种肿瘤促进因子，该蛋
白可导致细胞失去DNA修复和控制分裂的能力，还可以抑制正常p53蛋白的功能，但是直接
向肿瘤细胞内转导野生型p53基因的抑癌效果有限，无法达到抑制p53蛋白降解，基因治疗
癌症的目的。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种构建编码融合基因嵌合
肽的重组腺病毒，并对其进行修饰，通过载体搭载重组腺病毒，对成骨肉瘤肿瘤细胞的增殖
具有抑制作用，进一步能够促使成骨肉瘤肿瘤细胞凋亡的重组腺病毒。
本发明采用的技术方案如下：
本发明的一种重组腺病毒，下述方法构建，
步骤一，设计正向引物为F5’-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAA
GGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，并向正引物的5’端加入保护碱基和Nae I酶位
点；设计负向引物为R5’-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCAC
TTCTTAAG，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamH I酶切位点；
步骤二，经PCR反应体系扩增目的基因，连接于pGEM-T-easy质粒，转化入大肠杆菌
E.Coli DH5α，经过克隆筛选、酶切鉴定、测序正确后，制备p53(C22)Ant片段，得到重组质粒
pGEM-T/p53(C22)Ant；
步骤三，通过Nae I和Bam H I先后消化重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA连接酶连
入带有相同末端的已线性化的pBV220-NT4质粒，连接产物转化入大肠杆菌E.Coli DH5α，接
种在含氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养过夜后挑选已转化的菌落，提取质粒、
筛选并鉴定阳性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；
步骤四，通过EcoR I和BamH I双酶切腺病毒穿梭质粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53
(C22)Ant，凝胶回收354b NT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA连接酶连接，转入
大肠杆菌E.Coli DH5α，挑选转化的菌落，提取质粒筛选并鉴定阳性克隆。
由于采用了上述技术方案，p53羧基端肽的盘绕结构能够穿过细胞膜，捆绑在细胞
内的靶点上，导致细胞凋亡，为选择性地诱导肿瘤细胞死亡，对正常或非肿瘤细胞无作用，
并对p53变异型的肿瘤细胞作用更强，尤其是当p53羧基端肽和膜渗透肽嵌合后可以有效增
强抗肿瘤作用。在表达盒中设计Ant穿膜肽可以不需任何膜蛋白shou体的协助而穿过活细
胞质膜，进入细胞质设置细胞核，而细胞膜缺完好无缺，可有效的将多肽、蛋白质分子及DNA
片段导入多种哺乳动物细胞，与细胞膜亲和性高，穿膜速度快，并能改善体内外病毒介导的
基因转移和蛋白质的分泌表达。同时加入神经营养因子（NT4）信号肽，能够提高重组腺病毒
的转导效率，引导肽与目的短肽相连接，保证正确切割和保持肽的生物活性，以获得最大的
旁观杀伤效应。
本发明的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒经过叶酸修饰后与载体化学偶联。
由于采用了上述技术方案，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，在细胞培养
的同时实现叶酸修饰磷脂对细胞膜的修饰，再用腺病毒对该叶酸修饰宿主细胞的侵染及在
其中复制的过程，实现对重组腺病毒包膜的叶酸修饰，叶酸作为体内生化反应中一碳单位
的载体，参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，并且通过从头合成途径进一步合成DNA和RNA，因此也
算是可对细胞膜产生靶向作用的理想体，通过与叶酸受体作用使得纳米粒被细胞胞吞，从
而提高转染率，有利于产生特异性的细胞靶向作用，也不会因为共价结合小分子后而改变。
本发明的一种重组腺病毒，所述叶酸修饰包括以下几个步骤，
步骤一，配置含有浓度为0.03mg/mL叶酸功能化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的细胞培养液，
将宿主细胞悬浮在细胞培养液中悬浮5d；
步骤二，调整细胞密度为5×106/mL，以MOI=0.5将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分
摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2浓度培养箱中培养48d；
步骤三，收集悬浮细胞，将未悬浮细胞用细胞刮刀刮起，混匀两种细胞后，加入含
1000U/mL GMCSF、1000U/mL IL-4和100ng/mL TNF-α的X-VIVO 15培养基重新悬浮细胞，再
按照MOI=0.3将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2
浓度培养箱中培养48d；
步骤四，收集上层清液，将上层清液置于50mL离心管中，在6500r/min转速下离心
15min，经0.45μm过滤器过滤后超速离心，得到初步处理的病毒清液；
步骤五，在离心管底部加入6mL25%蔗糖/PBS缓冲溶液作为缓冲垫，缓慢加入初步处理
的病毒清液，在22300r/min转速下离心3h，弃去上层清液，沉淀用PBS（pH=7.2）溶解，再次超
速离心进行脱糖。
由于采用了上述技术方案，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，可实现重组
腺病毒的叶酸修饰，二者共定位效率为（94.2±0.7）%，经过叶酸修饰的重组腺病毒保持了
很好的完整性，修饰后的重组腺病毒保持了对宿主细胞的感染能力；经过上述步骤，操作简
便且最大程度保持了病毒的包膜完整性及感染能力，能够快速高效地获得叶酸修饰的重组
腺病毒。
本发明的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒与载体化学偶联。
由于采用了上述技术方案，与载体化学偶联后，能够保护重组腺病毒，具有较高的
亲水性，保持细胞外稳定性，安全进入目标组织或细胞附近，而不被巨噬细胞识别、载体间
无聚集，能够逃离溶酶体，在目标组织或细胞附近将基因载体，即重组腺病毒释放。
本发明的一种重组腺病毒，其特征在于：所述载体为葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束，
所述葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束的分子量为24300，胶束呈球形，胶束直径为为57.4±
3.5nm，所述酰腙凝胶的分子式为，所述n：m=8：17。
由于采用了上述技术方案，上述酰腙凝胶在一定的pH范围内具有可逆触变性能，
在pH为7.2~7.8的范围内，能够形成水凝胶，在容器中可承受自身重力而不流动，但当pH小
于7达到6.8及其以下时，酰腙键断裂，变为溶胶，当pH回升到7.2~7.8的范围时，又可形成凝
胶；由于人体内正常的pH环境为7.0~7.8，当载体进入正常环境中，为凝胶状态，能够对重组
腺病毒起到良好的保护作用；而肿瘤细胞周围的pH略偏酸性，约为6.85~6.95，因此当凝胶
接近肿瘤细胞后，发成触变形成溶胶，将重组腺病毒释放，重组腺病毒靶向作用于肿瘤细
胞，避免基因载体在作用于目标宿主前被巨噬细胞吞噬等，同时能够减小病毒对人体的毒
性。葡聚糖可以在肝、脾、肾和消化道被葡聚糖酶降解，毒性极小，用葡聚糖修饰的高分子胶
束能够减小肝脏对载体的清除，具有好的生物相容性。
本发明的一种重组腺病毒，所述酰腙凝胶的质量分数为葡聚糖的27%，所述重组腺
病毒的质量分数为纳米胶束的0.49%，所述重组腺病毒包裹于载体内部。
本发明的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒用于抑制成骨肉瘤细胞增殖。
本发明的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒用于促使成骨肉瘤细胞凋亡。
由于采用了上述技术方案，对成骨肉瘤细胞凋亡测定，正常细胞比例明显下降，从
（85.71±0.19）%下降至（70.17±0.58）%（t=44.15，P<0.05），总凋亡细胞比例从（11.01±
0.22）%上升至（27.28±0.50）%（t=51.82，P<0.05）；对成骨肉瘤增殖抑制测定，从第3天开
始，细胞增殖速度明显下降，第7天达到峰值，细胞增殖率自（395.14±2.24）%下降至
（256.50±3.23）%（t=39.50，P<0.01），细胞生长抑制率达到（35.09±1.05）%，具有明显的抑
制成骨肉瘤细胞增殖和成骨肉瘤细胞凋亡的作用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、构建编码融合基因嵌合肽的重组腺病毒，并对其进行修饰，通过载体搭载重组腺病
毒，对成骨肉瘤肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，进一步能够促使成骨肉瘤肿瘤细胞凋亡。
2、实现对重组腺病毒包膜的叶酸修饰，可对细胞膜产生靶向作用的理想体，通过
与叶酸受体作用使得纳米粒被细胞胞吞，从而提高转染率，有利于产生特异性的细胞靶向
作用，也不会因为共价结合小分子后而改变。
3、与载体化学偶联，保护重组腺病毒，具有较高的亲水性，保持细胞外稳定性，安
全进入目标组织或细胞附近，而不被巨噬细胞识别、载体间无聚集，能够逃离溶酶体，在目
标组织或细胞附近将基因载体释放，提高作用效率。
附图说明
图1是p53(C22)Ant PCR产物的酶切鉴定；
图2是重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant的酶切鉴定；
图3是pSSHG-CMV- NT4p53(C22)Ant重组质粒的酶切鉴定；
图4是重组腺病毒经叶酸修饰CLMS显微镜照片；
图5是酰腙凝胶1H-NMR图谱；
图6是对细胞生长抑制情况对比曲线；
图7是对细胞凋亡情况对比柱形图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本
发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不
用于限定本发明。
实施例1
1、一种重组腺病毒构建
步骤一，设计正向引物为F5’-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAA
GGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，并向正引物的5’端加入保护碱基和Nae I酶位
点；设计负向引物为R5’-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCAC
TTCTTAAG，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamH I酶切位点；
步骤二，经PCR反应体系扩增目的基因，连接于pGEM-T-easy质粒，转化入大肠杆菌
E.Coli DH5α，经过克隆筛选、酶切鉴定、测序正确后，制备p53(C22)Ant片段，得到重组质粒
pGEM-T/p53(C22)Ant；
步骤三，通过Nae I和Bam H I先后消化重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA连接酶连
入带有相同末端的已线性化的pBV220-NT4质粒，连接产物转化入大肠杆菌E.Coli DH5α，接
种在含氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养过夜后挑选已转化的菌落，提取质粒、
筛选并鉴定阳性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；
步骤四，通过EcoR I和BamH I双酶切腺病毒穿梭质粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53
(C22)Ant，凝胶回收354b NT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA连接酶连接，转入
大肠杆菌E.Coli DH5α，挑选转化的菌落，提取质粒筛选并鉴定阳性克隆。
利用PCR 反应体系扩增目的基因p53(C22)Ant，在琼脂糖凝胶电泳上获得全长117
bp 的基因片段，该值与理论值相符(加上1个终止密码子3 bp、2 个限制性内切酶识别序列
12 bp和2个引物内互补序列12 bp)，如图1所示。重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant经Nae I和
BamHⅠ先后消化后，琼脂糖凝胶电泳结果可见117bp的目的基因片段，并与理论值相符，显示
阳性重组质粒被完全切开，如图2所示。应用DNASIS软件，从DNA测序结果找出p53(C22)Ant
嵌合肽cDNA 片段序列，与根据GenBank所提供的序列而设计的嵌合基因序列比较，所克隆
的p53(C22)Ant 嵌合肽cDNA片段从Nae I切点起到终止密码子TAG，序列完全一致，如图3所
示。
2、重组腺病毒叶酸修饰
步骤一，配置含有浓度为0.03mg/mL叶酸功能化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的细胞培养液，
将宿主细胞悬浮在细胞培养液中悬浮5d；
步骤二，调整细胞密度为5×106/mL，以MOI=0.5将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分
摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2浓度培养箱中培养48d；
步骤三，收集悬浮细胞，将未悬浮细胞用细胞刮刀刮起，混匀两种细胞后，加入含
1000U/mL GMCSF、1000U/mL IL-4和100ng/mL TNF-α的X-VIVO 15培养基重新悬浮细胞，再
按照MOI=0.3将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2
浓度培养箱中培养48d；
步骤四，收集上层清液，将上层清液置于50mL离心管中，在6500r/min转速下离心
15min，经0.45μm过滤器过滤后超速离心，得到初步处理的病毒清液；
步骤五，在离心管底部加入6mL25%蔗糖/PBS缓冲溶液作为缓冲垫，缓慢加入初步处理
的病毒清液，在22300r/min转速下离心3h，弃去上层清液，沉淀用PBS（pH=7.2）溶解，再次超
速离心进行脱糖。
如图4所示，CLMS显微镜照片可见，宿主细胞中磷脂自然嵌合修饰的病毒保持了很
好的完整性。
3、葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束载体合成
在三口瓶中加入丙烯酰胺1.207g（0.017mol），双丙酮丙烯酰胺1.352g（0.008mol），
15mL DMSO，搅拌并通入氮气30min，在氮气的保护下，加入偶氮二异丁氰2.7mg（0.016mmol）
后，70℃温度下反应24h，反应完毕后，将反应物逐滴加入到不断搅拌的大量丙酮中，沉淀过
滤，再用乙醚多次洗涤，室温下真空干燥24h，得到酰腙凝胶，1H-NMR图谱如图5所示，合成反
应式如下所示：
将葡聚糖与丁儿酸酐反应，制备羧基化葡聚糖，将80mg羧基化葡聚糖和21.6mg酰腙凝
胶溶解在10mL DMF中，在计入8mg N，N’-二环乙基碳二亚胺和5mg DMAP，室温下搅拌反应
24h，过滤后用乙醇沉淀，得到葡萄糖-酰腙凝胶键合物，将20mg键合物溶液5mL DMF中，然后
加入10mL二次蒸馏水，搅拌2h后透析24h，取出有机溶剂，得到葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束，
葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束的分子量为24300，胶束呈球形，胶束直径为为57.4±3.5nm。
4、经叶酸修饰的重组腺病毒与载体化学偶联
在50mg葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束溶液（10mL）中加入23mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙
基碳二亚胺盐酸盐，和26mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌4h后，加入重组腺病毒，继
续搅拌24h，透析出去未反应的腺病毒，得到与载体化学偶联的重组腺病毒，标记为1号；同
样的方法制备与载体化学偶联的经过叶酸修饰的重组腺病毒，标记为2号，重组腺病毒（经
过叶酸修饰的重组腺病毒）的质量分数为纳米胶束的0.49%，重组腺病毒（经过叶酸修饰的
重组腺病毒）包裹于载体内部。
5、细胞培养
人成骨肉瘤细胞MG63购于中科院上海细胞库（目录好TCHu124），培养条件：37℃、体积
分数为5%二氧化碳条件下，含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。
6、测定对MG63细胞的抑制增殖作用和凋亡作用
MG63传代培养，去对数生长期的细胞，用2.5g/L胰酶溶液销户离心后，制备成单细胞悬
液，以1×104/孔细胞数接种于24孔板中，共分为3组：空白对照组，1号感染组（与载体化学
偶联的重组腺病毒，1×1010 pfu/mL）和2号感染组（与载体化学偶联的经过叶酸修饰的重组
腺病毒，1×1010 pfu/mL），每组平行设置8个复孔，24h细胞铁壁后分别进行相应的处理，分
别继续培养、2、3、4、5、6、7天后收集细胞，MTS法检测细胞增殖：流式细胞仪检测细胞凋亡情
况。
其中，图7中每一组柱形图从左至右依次为阴性对照组，1号感染组和2号感染组。
细胞凋亡的影响与阴性对照组比较，1号感染组组MG63正常细胞比例明显下降，从
（85.71±0.19）％下降至（70.17±0.58）％(t=44.15，P<0.05)，总凋亡细胞比例则从（11.01
±0.22）％上升至（27.28±0.50）％(t=51.82，P<0.05)，其中晚期凋亡细胞数量增加最为突
出。2号感染组与1号感染组比较，总细胞凋亡比例有所减少，但与阴性对照组比较，自
（11.01±0.22）％上升至（24.28±0.50）％(t=30.06，P<0.01)。
细胞生长抑制与阴性对照组比较，从第3天开始，1号感染组细胞增殖速度明显下
降，第7天达到峰值，细胞增殖率自（395.14±2．24）％下降至（256.50±3.23）％(t=39.50，P
<0.01)，细胞生长抑制率达（35.09±1.05）％。2号感染组细胞增殖率较1号感染组有所恢
复，但与阴性对照组比较，增殖率自（395．14±2．24）％下降至（310．0±2．83）％(t=25.86，P
<0.01)，细胞生长抑制率达（21.50±1.74）％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。