一种治疗慢性乙型肝炎的中药组合物及其制备方法和应用 技术领域 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物及 其制备方法及应用。
背景技术 据调查， 我国慢性乙型肝炎病毒感染者约占总人口的 10％， 其中慢性乙型肝炎患 者约有 1500 万人， 有 30％以上的慢性肝炎患者发展为肝硬化。 目前治疗的要点在于控制肝 细胞的慢性损伤及保护肝细胞作用和抗乙型肝炎病毒感染以及控制慢性肝病向肝纤维化 发展。国内外用于治疗慢性乙型肝炎的药物虽有很多， 西药核苷类药物 ( 阿昔洛韦、 拉米夫 丁、 阿德福韦酯、 贺普丁 ) 和干扰素等抗病毒有效， 文献报道干扰素对乙型肝炎表面抗原有 一定转阴作用 (30-40％ )， 但疗程须超过一年以上， 且对肝功能的全面恢复不强， 远期疗效 不理想， 价格又昂贵， 不少出现类似药物过敏反应 ； 核苷类药物停药后反跳现象严重， 耐药 现象呈增多趋势， 如拉米夫丁用药 1 年后病毒变异率达 16-32％。 由于慢性肝病常需要较常 时间的治疗， 因此， 从天然药物中寻求疗效好、 安全可靠、 并能全面恢复肝功能、 阻止向肝纤 维化发展的药物是肝病治疗领域的重点发展方向。
现今， 治疗慢性乙型肝炎中药制剂保肝降酶药有上百种， 大多没有特别公认的疗 效。
发明内容 本发明所要解决的技术问题， 是提供一种用于治疗慢性乙型肝病的中药组合物， 其治疗效果明显， 且无毒副作用。
本发明还要解决的技术问题， 是提供上述中药组合物的制备方法。
本发明最后需要解决的技术问题， 是提供上述中药组合物在制备治疗慢性乙型肝 炎药物和治疗慢性肝细胞损伤药物中的应用。
为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ：
一种用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物， 它由如下重量份数的原料制备得到 ： 龙葵 10-20 份， 柴胡 6-10 份， 白花蛇舌草 20-40 份， 垂盆草 20-40 份， 女贞子 10-14 份， 焦栀 子 7-11 份， 甘草 3-7 份。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物， 它由如下重量份数的原料制备得到 ： 龙葵 15 份， 柴胡 8 份， 白花蛇舌草 30 份， 垂盆草 30 份， 女贞子 12 份， 焦栀子 9 份， 甘草 5 份。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物， 所述的柴胡为醋柴胡。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物， 所述中药组合物添加辅料， 用常规的 制剂方法制成胶囊剂、 片剂、 颗粒剂、 丸剂、 微丸剂、 软胶囊、 滴丸、 口服液、 分散片、 泡腾片、 咀嚼片或栓剂。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物， 辅料为糊精、 乳糖、 淀粉、 蔗糖、 葡萄 糖、 微晶纤维素、 甘露糖、 甲基纤维素、 羟丙基纤维素、 羧甲基纤维素和甜菊苷的一种或几
种。 上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物的制备方法， 它包括如下步骤 ： 取龙葵、 柴胡、 白花蛇舌草、 垂盆草、 女贞子、 焦栀子、 甘草七味药材合并， 加水煎煮两次， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.15-1.20， 加乙醇使含醇量的体积百分比达 75-85％， 搅拌， 静 置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.20-1.30 并回收乙醇， 得浓缩液， 将浓缩液 加水及辅料配制成口服液， 或将浓缩液喷雾干燥得干浸膏粉， 添加辅料制成胶囊剂、 片剂、 颗粒剂、 丸剂、 微丸剂、 软胶囊、 滴丸、 分散片、 泡腾片、 咀嚼片或栓剂。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物的制备方法， 煎煮条件为 ： 第一次加水 为药材重量的 812 倍量， 煎煮 1-2h， 第二次加水为药材重量的 610 倍量， 煎煮 1-2h，
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物的制备方法， 喷雾干燥条件为 ： 进风温 度为 100-120℃， 出风温度为 80-90℃， 物料温度为 70-90℃， 雾化压力为 0.20.4 兆帕， 喷雾 速度为 5-10ml/s。
上述用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的应 用。
上述的用于治疗慢性乙型肝炎的中药组合物在制备治疗慢性肝细胞损伤药物中 的应用。
本发明中采用的药品原料 ( 药材 ) 符合中国药典等有关规定。
龙葵为茄科植物龙葵 (Solanum nigrum L) 的全草， 全国均有分布。 味苦、 性寒 ； 具 有清热解毒 ； 活血消肿作用。文献记载治疔疮 ； 痈肿 ； 丹毒 ； 跌打扭伤 ； 慢性气管炎 ； 肾炎水 肿等病症。
白花蛇舌草为双子叶植物药茜草科植物白花蛇舌草 (Hedyotis diffusa Willd) 的带根全草， 主要分布于我国东南至西南部各地。味苦甘、 性寒 ； 具有清热解毒 ； 利湿作用。 文献记载治肺热喘咳 ； 咽喉肿痛 ； 肠痈 ； 疖肿疮疡 ； 毒蛇咬伤 ； 热淋涩痛 ； 水肿 ； 痢疾 ； 肠炎 ； 湿热黄疸 ； 癌肿等病症。
垂盆草为景天科植物垂盆草 (Sedum sarmentosum Bunge) 的全草， 我国南北均有 分布。味甘淡、 性凉。具有清热利湿、 解毒消肿作用。用于湿热黄疸， 小便不利， 痈肿疮疡 ； 急、 慢性肝炎等病症。
焦栀子为双子叶植物药茜草科植物栀子 (Gardenia jasminoidesEllis) 的果实大 火炒到焦糊色者， 主产于 ： 浙江、 江西、 湖南、 福建等地。味苦、 性寒。有泻火除烦， 清热利尿， 凉血解毒作用。 用于热病心烦， 黄疸尿赤， 血淋涩痛， 血热吐衄， 目赤肿痛， 火毒疮疡， 扭挫伤 痛等病症。
柴胡为伞形科植物柴胡 (Bupleurum chinense DC) 的根， 醋柴胡为柴胡的醋炮制 品， 分布于东北、 华北及陕西、 甘肃、 山东、 江苏、 安徽、 广西等地。味苦辛、 性微寒。具有解表 退热 ； 疏肝解郁 ； 升举阳气作用。文献记载治外感发热 ； 寒热往来 ； 疟疾 ； 肝郁胁痛乳胀 ； 头 痛头眩 ； 月经不调 ； 气虚下陷之脱肛 ； 子宫脱垂 ； 胃下垂等病症。
甘草为豆科植物甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch) 的根及根茎， 分布于东北、 华北、 西北等地。味甘、 性平。具有益气补中 ； 缓急止痛 ； 润肺止咳 ； 泻火解毒 ； 调和诸药作 用。文献记载治倦怠食少 ； 肌瘦面黄 ； 心悸气短 ； 腹痛便溏 ； 四肢挛急疼痛 ； 脏躁 ； 咳嗽气 喘； 咽喉肿痛 ； 痈疮肿痛 ； 小儿胎毒 ； 及药物、 食物中毒等病症。
女贞子为木犀科植物女贞 (Ligustrum lucidum Ait) 的果实， 主要分布于陕西、 甘 肃及长江以南等地。味甘苦、 性凉。具有补益肝肾 ； 清虚热 ； 明目作用。文献记载治头昏目 眩； 腰膝酸软 ； 遗精 ； 耳鸣 ； 须发早白， 骨蒸潮热 ； 目暗不明等病症。 。
有益效果 ： 本发明与现有技术相比具有如下优点 ： 1、 本方针对慢性乙型肝病的发 病机制， 辨证合理， 配伍准确， 既具有清热解毒、 调和脾胃的功效， 又具有抗病毒、 保肝、 护肝 效果。2、 制备工艺中针对药材的有效成分特点， 采用水提醇沉的提取工艺， 设计合理， 保留 更多有效成分。 3、 本处方中原药材均为药典收载品种， 基源明确， 副作用小， 疗效确切， 适用 于长期用药。4、 本发明在于提供一种具有改善慢性乙型肝炎患者的临床症状、 保护和恢复 肝细胞损伤、 一定程度上抑制乙型肝炎病毒复制、 控制向肝纤维化发展发挥良好治疗作用 的慢性肝病治疗药物组合。本发明在中医理论和临床实践的基础上， 结合慢性乙型肝炎毒 邪、 湿热、 湿困脾胃的病理机制， 采用中医清热解毒、 调和脾胃的治疗原则， 取龙葵、 白花蛇 舌草为君， 取其苦寒， 以主清热解毒之功 ； 以垂盆草、 焦栀子为臣， 取其甘、 寒、 凉辅以解毒清 热； 以柴胡、 甘草为佐使， 取其 《伤寒论》 “小柴胡” 和解枢机之意， 而畅达脾胃， 醋柴胡又取 醋制入肝之力 ； 另女贞子甘凉濡润、 有滋补肝肾之效。全方既具有传统的清热解毒、 调和脾 胃的功效， 又具有一定抗病毒、 保肝、 护肝的现代作用。 主治肝胆湿热、 湿邪困脾、 肝郁气滞、 肝郁脾虚引起的慢性乙型肝病， 疗效满意， 药效安全稳定， 无任何副作用。 患病率高、 复发率 高是慢性乙型肝病的主要特点， 同时反映出慢性乙型肝病治疗药物市场的需求巨大。本成 果发明， 能积极有效地防治慢性乙型肝病的发生与发展， 这对于提高广大患者的生存与生 活质量、 保护广大患者的健康， 进而提高劳动生产力， 具有重要意义和较高的实用价值。由 于本病发病率高， 预计一经市场推广应用， 必将产生良好的社会效益和经济效益。 具体实施方式
以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
表 1 各实施例所需原料重量份数， 单位 ： 份
龙葵 实施例 1 实施例 2 实施例 3 实施例 4 实施例 5 实施例 6 10 15 20 10 15 20 柴胡 10 8 6 10 8 6 白花蛇舌草 20 30 40 20 30 40 垂盆草 40 30 20 40 30 20 女贞子 10 12 14 10 12 14 焦栀子 11 9 7 11 9 7 甘草 3 5 7 3 5 75102319321 A CN 102319324 实施例 7 实施例 8 实施例 9 实施例 10 实施例 11 实施例 12
10 15 20 10 15 20 10 8 6 10 8 6说20 30 40 20 30 40明书40 30 20 40 30 20 10 12 14 10 12 14 11 9 7 11 9 74/19 页 3 5 7 3 5 7实施例 1 ： 胶囊剂的制备
按表 1 原料配比及胶囊剂剂型常规方法制备， 制备成胶囊剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 10g、 柴胡 10g、 白花蛇舌草 20g、 垂盆草 40g、 女贞子 10g、 焦栀子 11g、 甘草 3g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 8 倍量， 煎煮 1h， 第二次加水为 药材重量的 6 倍量， 煎煮 1， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.15， 加乙醇使含醇量的体 积百分比达 75％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.20 并回收乙醇， 得浓缩液， 喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥条件为 ： 进风温度为 100℃， 出风温度为 80℃， 物 料温度为 70℃， 雾化压力为 0.2 兆帕， 喷雾速度为 5ml/s， 加入适量淀粉， 干法制粒， 过 60 目 筛， 装入 1 号胶囊即可得胶囊剂。
实施例 2 ： 颗粒剂的制备
按表 1 原料配比及颗粒剂剂型常规方法制备， 制备成颗粒剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 15g， 柴胡 8g， 白花蛇舌草 30g， 垂盆草 30g， 女贞子 12g， 焦栀子 9g， 甘草 5g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 10 倍量， 煎煮 1.5h， 第二次加水为 药材重量的 8 倍量， 煎煮 1.5h， 合并煎液， 浓缩至 65 ℃时相对密度为 1.20， 加乙醇使含醇 量的体积百分比达 80％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.25 并回 收乙醇， 得浓缩液， 喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥条件为 ： 进风温度为 110℃， 出风温度为 85℃， 物料温度为 80℃， 雾化压力为 0.3 兆帕， 喷雾速度为 7.5ml/s， 加入适当糊精、 可溶性 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 甘露醇等其中一种或几种， 用适量 80％ (v/v) 乙醇润湿， 制软材， 过 14 目 筛制粒， 50-80℃干燥， 60 目整粒， 得颗粒剂。
实施例 3 ： 片剂的制备
按表 1 原料配比及片剂剂型常规方法制备， 制备成片剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 20g、 柴胡 6g、 白花蛇舌草 40g、 垂盆草 20g、 女贞子 14g、 焦栀子 7g、 甘草 7g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 12 倍量， 煎煮 2h， 第二次加水为药 材重量的 10 倍量， 煎煮 2h， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.20， 加乙醇使含醇量的体 积百分比达 85％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.30 并回收乙醇， 得浓缩液， 将浓缩液加水及辅料配制成口服液， 或将浓缩液喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥 条件为 ： 进风温度为 120℃， 出风温度为 90℃， 物料温度为 90℃， 雾化压力为 0.4 兆帕， 喷雾 速度为 10ml/s， 加入淀粉、 糊精、 糖粉、 乳糖、 微晶纤维素等其中的一种或几种辅料， 混合均 匀， 用适量 80％ (v/v) 乙醇润湿， 制软材， 过 30 目筛制粒， 于 70 ～ 80℃干燥， 用 60 目筛整粒， 压片， 包糖衣， 分装， 外包装， 送检合格， 得片剂。
实施例 4 ： 胶囊剂的制备
按表 1 原料配比及胶囊剂剂型常规方法制备， 制备成胶囊剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 10g、 醋柴胡 10g、 白花蛇舌草 20g、 垂盆草 40g、 女贞子 10g、 焦栀子 11g、 甘 草 3g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 8 倍量， 煎煮 1h， 第二次加 水为药材重量的 6 倍量， 煎煮 1， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.15， 加乙醇使含醇 量的体积百分比达 75％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.20 并回 收乙醇， 得浓缩液， 喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥条件为 ： 进风温度为 100℃， 出风温度为 80℃， 物料温度为 70℃， 雾化压力为 0.2 兆帕， 喷雾速度为 5ml/s， 加入适量淀粉， 干法制粒， 过 60 目筛， 装入 1 号胶囊即可得胶囊剂。
实施例 5 ： 颗粒剂的制备
按表 1 原料配比及颗粒剂剂型常规方法制备， 制备成颗粒剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 15g， 醋柴胡 8g， 白花蛇舌草 30g， 垂盆草 30g， 女贞子 12g， 焦栀子 9g， 甘草 5g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 10 倍量， 煎煮 1.5h， 第二次加水 为药材重量的 8 倍量， 煎煮 1.5h， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.20， 加乙醇使含醇 量的体积百分比达 80％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.25 并回 收乙醇， 得浓缩液， 喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥条件为 ： 进风温度为 110℃， 出风温度为 85℃， 物料温度为 80℃， 雾化压力为 0.3 兆帕， 喷雾速度为 7.5ml/s， 加入适当糊精、 可溶性 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 甘露醇等其中一种或几种， 用适量 80％ (v/v) 乙醇润湿， 制软材， 过 14 目 筛制粒， 5080℃干燥， 60 目整粒， 得颗粒剂。 实施例 6 ： 片剂的制备
按表 1 原料配比及片剂剂型常规方法制备， 制备成片剂， 具体方法如下 ：
取龙葵 20g、 醋柴胡 6g、 白花蛇舌草 40g、 垂盆草 20g、 女贞子 14g、 焦栀子 7g、 甘草 7g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加水为药材重量的 12 倍量， 煎煮 2h， 第二次加水为 药材重量的 10 倍量， 煎煮 2h， 合并煎液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.20， 加乙醇使含醇量 的体积百分比达 85％， 搅拌， 静置， 过滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.30 并回收乙 醇， 得浓缩液， 将浓缩液加水及辅料配制成口服液， 或将浓缩液喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾 干燥条件为 ： 进风温度为 120℃， 出风温度为 90℃， 物料温度为 90℃， 雾化压力为 0.4 兆帕， 喷雾速度为 10ml/s， 加入淀粉、 糊精、 糖粉、 乳糖、 微晶纤维素等其中的一种或几种辅料， 混 合均匀， 用适量 80％ (v/v) 乙醇润湿， 制软材， 过 30 目筛制粒， 于 70 ～ 80℃干燥， 用 60 目 筛整粒， 压片， 包糖衣， 分装， 外包装， 送检合格， 得片剂。
实施例 7-12 均按照表 1 原料配比， 并采用药剂学中常规制剂方法， 添加相应辅料 剂型制备。
实施例 13 ： 本发明对 CCL4 所致慢性肝损伤的保护作用实验研究
1. 实验材料
1.1 实验动物 ：
健康 SD 大鼠 60 只， 雌雄各半， 4 ～ 5 月龄， 体重 220±50g， 江苏省中医药研究院动 物中心 (SPF 级 ) 提供， 合格证号 ： JZDVI NO ： 2008-0087， 正常饲养一周适应。
1.2 实验药物 ：
按照上述实施例 5 中颗粒剂的制备方法制备， 即取龙葵 15g， 醋柴胡 8g， 白花蛇舌 草 30g， 垂盆草 30g， 女贞子 12g， 焦栀子 9g， 甘草 5g 七味药材合并， 加水煎煮两次， 第一次加 水为药材重量的 10 倍量， 煎煮 1.5h， 第二次加水为药材重量的 8 倍量， 煎煮 1.5h， 合并煎 液， 浓缩至 65℃时相对密度为 1.20， 加乙醇使含醇量的体积百分比达 80％， 搅拌， 静置， 过 滤， 滤液减压浓缩至 65℃时相对密度为 1.25 并回收乙醇， 得浓缩液， 喷雾干燥得干浸膏粉， 喷雾干燥条件为 ： 进风温度为 110℃， 出风温度为 85℃， 物料温度为 80℃， 雾化压力为 0.3 兆帕， 喷雾速度为 7.5ml/s， 加入适当糊精， 用适量 80％ (v/v) 乙醇润湿， 制软材， 过 14 目筛 制粒， 50-80℃干燥， 60 目整粒， 得颗粒剂， 由江苏省中医药研究院药材科提供， 按成人常规 计量根据人鼠等效计量换算法， 分别配制成含生药 0.5g/ml、 1g/ml、 2g/ml 的溶液， 按 3ml/ kg 灌胃， 则低中高剂量分别为 1.5g 生药量 /kg， 3g 生药量 /kg， 6g 生药量 /kg。
1.3 主要仪器设备和试剂 ：
超氧化物歧化酶 (SOD) 测定试剂盒 ( 批号 ： 20110328)， 丙二醛 (MDA) 测定试剂 盒 ( 规格 ： 50T/48 样， 批号 ： 20110321)， 均为南京建成生物研究所产品。三用恒温水箱， Cole-Parmer 公司 ； 生物洁净工作台， 美国 Labconco 公司 ； 离心机 L600， 湖南湘仪集团 ； 电 子天平， 上海精天电子仪器有限公司生产， 400 型全自动生化仪， 上海科华公司 ； 756MC 型紫 外可见分光光度计， 上海光学仪器厂。 2. 方法
2.1 造模方法 ： 正常对照组给予皮下注射生理盐水 3ml/kg， 每隔 3 天注射 1 次 ； 模 型组予 40％ CCL4， 方法同前正常对照组。第 5 周观察是否形成慢性肝损伤 ： 造模第 5 周末 随机处死每组各两只大鼠， 眼球取血测定血清 ALT、 AST， 确定是否造模成功。
2.2 分组方法及给药方法 ：
取 10 只健康大鼠作为正常对照组， 再将成功复制大鼠慢性肝损伤模型 40 只随机 分为 4 组， 每组 10 只， 分别为模型对照组、 本发明小剂量组、 本发明中剂量组、 本发明大剂量 组。
正常对照组 ： 正常饲养。模型对照组 ： 生理盐水 3ml/kg 灌胃， 1 次 / 天 ×5W ； 本发 明小剂量组 1.5g/kg、 本发明中剂量组 3g/kg、 本发明大剂量组 6g/kg， 1 次 / 天 ×5W。
2.3 标本采集方法 ：
除正常对照组， 其余各组禁食不禁水 12h， 腹腔注射 30mg/kg 戊巴比妥钠麻醉大 鼠。断头取外周血 7.5ml， 分别置入注好标记的试管中， 以 16000r/min 离心 5min， 作血清 AST、 ALT 含量检测。
剖腹暴露肝脏， 选取肝脏组织， 用滤纸擦干， 用电子称取 0.2g 左右， 电子天平称 重， 加 9 倍 0.9％冰生理盐水后移于 EP 管中， 用眼科小手术剪尽快剪碎组织块， 再用匀浆器 制备匀浆， 分别作组织 SOD、 MDA 含量检测。
2.4 检测方法 ：
血清 ALT、 AST 检测 ： 采用 400 型全自动生化分析仪。肝脏组织匀浆 MDA、 SOD 检测 ： 采用分光光度法测。
2.5 统计学方法 ： 处理全部数据采用 SPSS 17.0(t 检验， F 分析 )。
3. 结果
3.1 各组血清 ALT、 AST 含量变化情况
表 2 各组血清 ALT、 AST 含量比较
注： 与模型对照组比较 *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01
表 2 显示 ： 模型组 AST、 ALT 显著高于正常对照组 (P ＜ 0.01)， 表示造模成功， 不同 剂量药物各组 AST、 ALT 均明显低于模型组 (P ＜ 0.05)， 小、 中、 大剂量组组间比较无统计学 差异 (P ＞ 0.05)。表明本发明各组能降低模型大鼠血清 AST、 ALT 含量， 改善肝功能， 治疗 肝损伤。
3.2 各组肝脏组织匀浆 SOD、 MDA 含量
表 3 各组肝脏组织匀浆 SOD、 MDA 含量比较
注： 与模型对照组比较 *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01
表 3 显示 ： 正 常 对 照 组 SOD 显 著 高 于 模 型 组、 而 MDA 含 量 显 著 低 于 模 型 组 (P ＜ 0.01)， 说明肝损伤后 SOD 含量降低、 MDA 含量升高 ； 而本发明不同剂量组 SOD 含量亦显著 高于模型组 (P ＜ 0.01)， MDA 含量亦显著低于模型组 (P ＜ 0.01) 小、 中、 大剂量组间比较无 差异 (P ＞ 0.05)， 表明各组水提液均能提高肝损伤模型动物 SOD 活力， 降低肝脏组织中 MDA 含量。
4. 结论 ：
本发明对化学性慢性肝损伤大鼠肝功能损害具有改善作用。
实施例 14 ： 对急性肝损伤大鼠模型的成模抑制作用的实验
1. 材料
1.1 动物 ： 健康 SD 大鼠， 雌雄各半， 4 ～ 5 月龄， 体重 220±50g。江苏省中医药研 究院动物中心提供， 合格证号 ： JZDVI NO ： 2008-0087。正常饲养 2 天适应。
1.2 试验药物 ： 样品准备同前 ； 对照药物 ： 护肝宁片， 0.35 克 / 片 ( 贵州信邦制药，
国药准字 Z20033118)， 加蒸馏水溶解成 2％的浓度的混悬液。
1.3 主要试剂 ： 谷丙转氨酶 (ALT) 临床诊断试剂盒、 谷草转氨酶临床诊断 (AST) 试 剂盒， 均为南京建成生物公司。GL-20G 高速冷冻离心机 L600， 湖南湘仪集团 ； TG328A 型电 子天平， 上海精天电子仪器有限公司 ； 400 型全自动生化仪， 上海科华公司 ； 756MC 型紫外可 见分光光度计， 上海光学仪器厂。
2 方法 ：
2.1 分组及造模干预方法 ：
将 72 只大鼠随机分为 6 组， 每组 12 只， 雌雄各半。正常对照组， 正常饲养 ； 模型组 每天生理盐水 10ml/kg 灌胃 ； 另 4 组分别予以本发明小剂量 0.5g/ml、 中剂量 1.0g/ml、 大剂 量 2.0g/ml 溶液、 2％护肝宁片混悬液、 按 10ml/kg 灌胃， 连续 7 天。第 7 天给药后 6h， 模型 组、 本发明小剂量组、 中剂量组、 大剂量组、 肝宁片组均给予 50％ CCL4 花生油 2ml/kg 腹腔注 射， 造成大鼠急性肝损伤。
2.2 指标测量方法 ： 末次灌胃后， 禁食不禁水 12h， 腹主动脉采血 3ml， 置入离心机， 以 16000r/min 离心 5min， 取血清， 采用 400 型全自动生化分析仪测定 ALT， AST 活性。
2.2 统计学处理方法 ： 采用 SPSS 17.0(t 检验 )。
3 结果 表 4 各组肝损伤后血清中 ALT 和 AST 活性比较 (IU/L)
注， 与正常组比较 *P ＜ 0.01 ； 与模型组比较 #P ＜ 0.05 ； 与本发明大剂量组比较 ☆ P ＜ 0.05
表 4 显示 ： 各组 AST、 ALT 含量比较， 模型组显著高于正常对照组 (P ＜ 0.01) ； 本发 明不同剂量组及及护肝宁组均显著低于模型组 (P ＜ 0.05)， 而大剂量组又明显低于中、 小 剂量组和护肝宁组 (P ＜ 0.05)， 显示， 本发明具有降低模型组 AST、 ALT 含量的作用， 并且随 剂量的增加作用效果越明显。
4. 结论
本发明具有抗急性肝损伤的作用， 在急性肝损伤模型的形成中， 能减轻药物对肝 脏的损害。
实例 15 本发明对 Hepg2.2.15 细胞的生长抑制作用的体外实验
1 实验材料
1.1 实验药物 样品准备同上 ； 乙肝健片 (0.26g/ 片， 三普药业股份有限公司， 批
号： Z20023080)。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器 8452A 型紫外分光光度计 ( 美国惠普公司 ) ； TG328A 型电光分析天平 ( 上海天平仪器厂 ) ； 二氧化碳孵箱 (Heraeus 公司 ) ； 三用恒温水箱 (Cole-Parmer 公司 ) ； 倒置生物显微镜 CKX31-12PHP(Olympus 公司 ) ； 生物洁净工作台 ( 美国 Labconco 公司 ) ； 酶标仪 (Thermo LabsystemS 公司 ) ； L600 离心机 ( 湖南湘仪集团 ) ； 一次性滤器 (0.22um) ( 美国 Costar 公司 ) ； 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ) ； MDFu-281 超低温冰箱 ( 日本 SANYO 公 司)； ES-315 全自动灭菌锅 ( 日本 TOM 公司 )。
1.2.2 试剂 冰醋酸 ( 上海试剂四厂， 批号 ： 090402) 伊文斯兰 ( 国药集团化学 试剂有限公司， 批号 ： 2010053) ； MEM 培养基 (Gibco 公司 ) ； 胎牛血清 (Hyclone 公司 ) ； G418(Sunshine 公司 ) ； 胰酶 (Sunshine 公司 ) ； EDTA(Sunshine 公司 ) ； 二甲基噻唑二苯基 四唑嗅盐 (MTT)(Sunshine 公司 ) ； 二甲基亚砜 (DMSO)(Sunshine 公司 )。HBsAg 及 HBeAg 酶 联免疫检测试剂盒 ( 上海荣盛生物技术有限公司 ) ； 细胞周期检测试剂盒 ( 南京凯基生物 有限公司 )。Hepg2.2.15 细胞株， 中科院上海药物研究所左建平主任惠赠。
1.3 动物 清洁级 SD 大鼠 60 只， 雌雄各半， 体重 220±50g， 4 ～ 5 月龄。江苏省中 西医结合医院动物中心提供， 合格证号 ： SYXK( 苏 )2007-0026。 2 实验方法
2.1 本发明药液的制备 取按上述实施例 5 制备方法制成颗粒剂， 加入 500ml 水， 配 制成浓度为 182mg 生药 /mL 的溶液， 放入离心管中， 于离心机 8000 转离心， 去杂质， 取其清 液， 制成本发明提取液， 并按照 10 倍对数稀释。
2.2 含药血清的制备 ： 取 SD 大鼠 60 只， 雌雄各半， 随机分成 5 组， 即空白血清组 ( 给予同体积消毒饮用水 )、 乙肝健血清组 (0.143g 乙肝健 A 片混悬液 /kg) 和本发明血清 1、 2、 3 剂量组 (6.31、 12.63、 25.26g 生药 /kg， 分别相当于 70kg 成人日用量的 0.5 倍、 同倍、 2 倍、 4 倍 )， 每组 12 只。每日给予相应药液 2.5ml 灌胃 1 次， 连续给药 7 天。末次给药前 12 小时禁食不禁水， 末次给药后 1 小时腹主动脉取血， 3000rpm 离心 10min， 分离血清， 并将 每组大鼠的血清混合， 经 56℃灭活 30min， 0.22μm 滤膜过滤灭菌， 置 -20℃冰箱保存备用。
2.3 溶液的配制 ： ① DMEM 培养基 ： 将 DMEM 粉末溶于 800mL 去离子水， 定容至 1L， 0.22μm 过滤灭菌， 4℃保存备用。②胰蛋白酶溶液 ： 称取 0.25g 胰蛋白酶， 加入 80ml×PBS 缓冲液， 完全溶解后， 定容至 100mL， 过滤除菌， 4 ℃保存。③二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐 (MTT)(5mg/mL) ： 20mg MTT 溶于 4mL 的 PBS， 充分溶解， 4℃避光贮存。
2.4HepG2.2.15 细胞的复苏与培养 ： 预热培养基， 30 分钟后， 向培养瓶中加入 8ml 已预热的培养基， 取出冻存于液氮中的 HepG2.2.15 细胞株， 迅速投至 37℃的水浴锅中， 不 断振摇。 取出冻存管， 75％酒精擦洗消毒， 将冻存的细胞悬液吸至培养瓶中， 混和均匀后， 移 入三气培养箱中 37℃、 5％ CO2 条件下培养。细胞长至 90％融合时， 接种细胞， 加入 0.25％ 5 胰蛋白酶， 含 10％新生牛血清的 DMEM 培养液将细胞稀释为 10 /mL 的细胞悬液， 接种于 96 孔培养板， 每孔体积 200μL， 置于 37℃、 5％ CO2 的孵箱培养 24h。
2.5HepG2.2.15 细胞活性测定 (MTT 法 )
参照 Mosmann MTT 比色法， 将 1×105/ml 的细胞悬液加入 96 孔培养板中， 每孔 100μl， 置 CO2 孵箱 (37℃， 5％ CO2) 中培养 24h 后， 细胞贴壁且生长良好， 吸除全部培养液，
加入用培养基稀释的乙肝健药液 ( 终浓度为 ： 16mg/ml)、 不同浓度的发明组合药药液 ( 终浓 度分别为 ： 10、 12、 14、 16、 18、 20mg/ml) 及各相应的含药血清， 每个浓度设 3 个复孔， 连续培 养 48h， 培养结束前 4h， 每孔加入 MTT 10μl， 于 CO2 孵箱中继续培养。4h 后小心吸弃上清 液， 每孔加 DMSO 100μl， 微量振荡器振荡 5min， 使结晶紫完全溶解。自动酶标仪 ( 检测波 长 570nm， 参考波长 630nm) 读取各孔 OD 值， 记录结果。
2.6ELISA 法定量检测 HBsAg 和 HBeAg
将 1×105/ml 的细胞悬液加入 96 孔培养板中， 每孔 100μL， 置 CO2 孵箱 (37℃， 5％ CO2) 中培养 24h 后， 分别加入乙肝健药液 ( 终浓度为 ： 15mg/ml)、 发明组合药药液 ( 终浓度 分别为 ： 10、 17、 20mg/ml) 及各相应含药血清， 每个浓度 3 个复孔。连续培养 48h 后， 分别吸 出上清液， 用乙型肝炎病毒 e 抗原诊断试剂盒和乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 ( 酶联 免疫法 ) 检测上清液中 HBeAg 和 HBsAg 的表达。再次加入各组药液及其含药血清继续培养 48h 后， 分别吸出上清液做 HBeAg 和 HBsAg 的表达检测， 具体步骤参照试剂盒说明书。
2.7 细胞周期测定 ( 流式细胞术 )
①取对数生长期的细胞， 均以 4×105/ml 密度接种于 6 孔细胞培养板上， 每孔约 2000-2500μl， 置 CO2 孵箱 (37 ℃， 5 ％ CO2) 中培养 24h 后， 加入乙肝健药液 ( 终浓度为 ： 15mg/ml)、 不同浓度的本发明药液 ( 终浓度分别为 ： 10、 17、 20mg/ml) 及各相应含药血清， 连 续培养 48h。②消化收集细胞， 包括培养液中悬浮的死细胞。③ 1000r/min 离心 5min， 去上 6 清。④加 1ml PBS 缓冲液重悬细胞， 再次离心去上清。⑤调整细胞浓度为 1×10 个 /ml， 于 -20℃预冷的 70％冰乙醇中 4℃固定 24h。⑥ PBS 清洗三次， 在每个离心管中留 1ml PBS， 打散细胞团， 每管分别加入 100μl Rnase， 37℃水浴 30 分钟， 再加入 400ul PI 染色均匀， 4℃避光 30 分钟。上流式细胞仪测定细胞周期。
2.8 统计方法
所有结果数据用均数士标准差以 表示， 多组间两两比较采用单因素方差分 析， 以 P ＜ 0.05 表示差异有统计学意义。所有数据利用 SPSS 17.0 软件包分析。
3 结果
3.1 本发明对 Hepg2.2.15 细胞生长的抑制作用
3.1.1 对细胞形态的影响
接种后 24h 在倒置相差显微镜下观察， 可见细胞清晰、 大小均一、 呈梭形、 贴壁生 长， 细胞饱满， 胞浆均匀透明， 折光性好， 生长旺盛呈细长型。而加入各组药物后， 各组细胞 逐渐变圆、 胞间接触变松、 体积变小、 折光性减弱、 细胞变粗糙、 贴壁减少、 有少量悬浮细胞。
3.1.2 不同浓度发明组合药药液对 Hepg2.2.15 细胞生长的抑制作用
表 5 不同浓度本发明药液处理的 Hepg2.2.15 细胞的 OD 值 ( n ＝ 3)
注： 与空白对照组比较， *P ＜ 0.01， 与乙肝健组比较， ☆ P ＜ 0.01。
表 5 显示 ： 本 发 明 不 同 浓 度 药 液 组 及 乙 肝 健 组 OD 值 均 低 于 空 白 对 照 组 (P ＜ 0.01) ； 本发明不同浓度组随着浓度的增加， OD 值似呈降低趋势 ； 各组与乙肝健组比较， 在 10、 12、 14、 16mg/ml 浓度时， OD 值高于乙肝健组 (P ＜ 0.01)， 而在 18、 20mg/ml 浓度时， OD 值又低于乙肝健组， 且仅 20mg/ml 浓度组有显著差异 (P ＜ 0.01)。 说明， 本发明低浓度组对 Hepg2.2.15 细胞生长的抑制作用略低于乙肝健组， 但高浓度组的抑制作用优于乙肝健组。
3.2 本发明含药血清对 Hepg2.2.15 细胞生长的抑制作用
表 6 不同浓度本发明含药血清处理的 Hepg2.2.15 细胞的 OD 值 ( n ＝ 3)
注： 与空白血清组比较， ☆ P ＜ 0.05， ☆☆ P ＜ 0.01， 与乙肝健血清组比较， △P＞0.05 表 6 显示 ： 本发明不同浓度含药血清组及乙肝健含药血清组 OD 值均低于空白血清 组 (P ＜ 0.01)， 而本发明不同浓度含药血清组与乙肝健含药血清组 OD 值相比， 各组间无显 著性差异 (P ＞ 0.05)。 似可看出， 本发明各浓度血清组及乙肝健血清组对 Hepg2.2.15 细胞 生长具有抑制作用， 且两者抑制作用相当。
3.3 不同浓度本发明药液对 2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用
表 7 不同浓度、 时间本发明药液处理的 2.2.15 细胞上清液中 HBsAg 利 HBeAg OD 值( n ＝ 3)
注： 与空白对照组比较， *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01， 与乙肝健比较， ☆ P ＜ 0.01
表 7 显示 ： 本发明不同浓度药液组及乙肝健药液组在 48h 及 96h 各指标 OD 值比 较， 除本发明 1 组 HBsAg 98h 外， 其余值均低于空白对照组 (P ＜ 0.01) ； 本发明各药液组与 乙肝健药液组比较， 除本发明 -3 药液组 OD 值略低于乙肝健药液组 (P ＞ 0.05) 外， 其余均 高于乙肝健组 (P ＜ 0.01)。说明本发明药液对病毒标记物的抑制作用总体低于乙肝健药 液， 但本发明高浓度显示出对 HBsAg 及 HBeAg 抑制的优势。
3.4 本发明含药血清对 2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用
表 8 不同浓度、 时间本发明含药血清处理的 2.2.15 细胞上清液中 HBsAg 和 HBeAg n ＝ 3) OD 值 (
注： 与空白血清组比较， *P ＜ 0.05， ** ＜ 0.01， 与乙肝健血清比较， △ P ＜ 0.05， △△ P ＜ 0.01
表 8 显示 ： 本发明各浓度含药血清和乙肝健含药血清各指标均低于空白血清组 (P ＜ 0.05) ； 本发明不同浓度血清组各指标 OD 值均低于乙肝健血清组， 大部分有显著性差异 (P ＞ 0.05)。说明， 本发明含药血清对病毒标记物的抑制作用总体优于乙肝健血清。
3.5 本发明药液及其含药血清对对 Hepg2.2.15 细胞周期的影响
本发明药液及其含药血清作用于 Hepg2.2.15 细胞后， G0/G1 期细胞比例均增加。 本 发明药液浓度在 10mg/mL 与 20mg/mL 之间时， 随着本发明药物浓度的增加， G0/G1 期细胞比例 明显增加。而乙肝健组 G0/G1 期细胞则增加数量相对较少， 与本发明组相比则呈减少趋势。
4 结论 ：
从实验数据我们可以看出， 本发明药液对 Hepg2.2.15 细胞生长具有抑制作用。在 10 与 20mg/ml 浓度之间时， 其抑制作用与药液浓度高低明显相关， 随着药液浓度的增加， 其
抑制作用逐渐增强， 呈现一个明显的量效关系 ； 本发明低浓度组抑制 Hepg2.2.15 细胞生长 的抑制作用略低于乙肝健药液， 但高浓度组的抑制作用优于乙肝健药液 ； 本发明各浓度血 清组及乙肝健血清组对 Hepg2.2.15 细胞生长的抑制作用相当。
本发明药液及其含药血清具有一定抑制 HBV 体内复制的作用 ； 本发明药液对病毒 标记物的抑制作用总体低于乙肝健药液， 但本发明药液随着浓度的增加显示出对病毒标记 物抑制作用增强的趋势 ； 本发明含药血清对病毒标记物的抑制作用总体优于乙肝健血清。
本发明含药血清作用于 Hepg2.2.15 细胞后， G0/G1 期细胞比例明显增加， 随着药物 浓度的增加， G0/G1 期的细胞比例不断增加， 且本发明组细胞增加比例较乙肝健组明显。分 析其可能原因为本发明及其含药血清可使细胞周期停滞于 G0/G1 期， 也就是说处于静止期 和 DNA 复制前期的细胞比例增加， DNA 合成期和有丝分裂期的细胞比例相对减少， 表明本发 明和含药血清可影响细胞周期分布， 其中 G0/G1 期对药物最为敏感。
实例 16 本发明对肝细胞保护作用的体外实验
1. 实验材料
1.1 实 验 动 物 ： 清 洁 级 SD 大 鼠 4 只， ♂， 体 重 150 ～ 180g， 购于上海斯莱克实 验 动 物 有 限 公 司， 合格证号 ： SCXK( 沪 )2007-0005 ； 动物饲养环境 ： SPF 级， 合格证号 ： SYXK( 苏 )2007-0026。 1.2 细胞株及主要试剂、 药物 ：
正常人肝 L-O2 细胞， 中科院上海细胞库 ； DMEM 培养基， Gibco 公司 ； 小牛血清， 杭 州四季青公司 ； 胰岛素， Sigma 公司 ； 二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐 (M TT)， Sigma 公司 ； 二甲 基亚砜 (DMSO)， Sigma 公司 ； 其余试剂为国产分析纯。本发明药物制备方法同前， 按成人日 常用量， 配制成浓度为 182mg 生药 /mL 的溶液。对照药益肝灵片， 0.2 克 / 片， ( 江苏中兴药 业有限公司， 国药准字 Z32020090) 按成人日常用量， 配置成 200mg/mL 益肝灵混悬液。
1.3 实验仪器 ：
二 氧 化 碳 孵 箱， Heraeus 公 司 ； 三 用 恒 温 水 箱， Cole-Parmer 公 司 ； 倒置生物 显 微 镜 CKX31-12PHP， Olympus 公 司 ； 生 物 洁 净 工 作 台， 美 国 Labconco 公 司 ； 酶 标 仪， ThermoLabsystemS 公司 ； 离心机 L600， 湖南湘仪集团。
2 方法
2.1 溶液的配制 ：
① DMEM(Dulbecco’ s modified Eagle medium) 培 养 基， 1L ： 将 DMEM 粉 末 溶 于 800ml 去离子水， 定容至 1L， 0.22μm 过滤灭菌， 4 ℃保存备用。② 1×PBS 缓冲液， 1L ： NaCL8.5g， KCL0.2g， Na2HPO4· 12H2O2.2.77g， KH2PO40.31g， 溶于 800mlddH2O 中， 定容至 1L， 高压灭菌， 4℃保存。③胰蛋白酶溶液， 100ml ： 称 0.25g 胰蛋白酶， 加入 80ml×PBS 缓冲液， 完全溶解后， 定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存。④二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐 (MTT)(5mg/ ml) ： 20mg MTT 溶于 4ml PBS， 充分溶解， 4℃避光贮存。
2.2 含药血清的制备
取雄性 SD 大鼠 4 只， 随机分成 3 组， 即空白血清组 ( 给予同体积消毒饮用水 )、 阳 性药血清组 (0.2mg/kg 益肝灵混悬液 ) 和本发明血清组 (8.34g 生药 /kg)、 每组 1 只。每日 两次间隔 12 小时， 连续给药 3 天。末次给药后 1 小时， 全麻下腹主动脉取血， 3000rpm 离心 10min， 分离血清， 经 56℃灭活 30min， 0.22μm 滤膜过滤灭菌， -80℃保存备用。
2.3L-O2 细胞的复苏、 培养和分组
打开超净工作台紫外灯灭菌， 同时预热培养基， 30 分钟后， 关掉紫外， 打开通风和 照明， 向准备好的培养瓶中加入 8ml 已预热的培养基。取出冻存于液氮中的 L-O2 细胞株， 迅速投至 37℃的水浴锅中， 不断振摇， 使之尽快融化。取出冻存管， 用 75％酒精擦洗消毒， 移入已经灭菌超净工作台， 将冻存的细胞悬液吸至培养瓶中， 混和均匀后， 移入三气培养箱 中 37℃、 5％ CO2 条件下培养。当细胞长至 90％融合时， 用 PBS 轻轻荡洗两次， 加入 0.25％ 5 胰蛋白酶， 37℃条件下消化 2 ～ 3min。按 1x10 分瓶传代， 置于 37℃、 5％ CO2 的孵箱培养。
待 L-O2 细胞在培养瓶内铺满单层后倒掉培养液， 用 PBS 轻轻荡洗两次， 加入 0.25％胰蛋白酶， 37℃条件下消化 2 ～ 3min， 后加入 DMEM 培养液终止消化， 用吸管轻轻吹打 数次， 使细胞完全分散， 倒置显微镜下观察计数， 用含 10％新生牛血清的 DMEM 培养液将细 5 胞稀释为 10 /ml 的细胞悬液， 接种于 96 孔培养板， 37℃、 5％ CO2 培养 24 小时， 细胞贴壁铺 满单层即可用于实验。
实验用细胞分为空白对照组、 CCL4 对照组、 本发明药液不同浓度组和本发明药液 不同浓度加入 CCL4 组。本发明药液用 DMEM 培养液按 1 ∶ 10 梯度稀释， 按 1 ∶ 100 加入 96 孔板中， 使终浓度分别为 182mg/ml、 18.2mg/ml、 1.82mg/ml、 0.182mg/ml， 每项相同实验均重 复 3 次。 2.4 实验分组 ：
肝细胞培养 12h 后， 随机分组， 每组 3 孔， 分为 CCL4 模型组 ( 加入浓度为 25mmol/ L 的 CCL410μL)、 本发明不同药液组 (7 组， 加入 CCL4 后同步分别加不同浓度本发明稀释液 10μL)， 正常对照组不添加任何液体， 置于 37℃、 CO2 培养箱中继续培养 12h。
2.5 细胞存活测定 ： 采用四唑盐 (MTT) 比色法， 测定前 4h， 每孔加入 20μL MTT 液 (5mg/mL)， 终止培养， 吸弃上清， 加入 DMSO 200μL/ 孔， 待结品溶解后， 于全自动酶标光度 计 570nm 处， 测定每孔的吸光度 (OD 值 )， 计算细胞的存活率。
2.8 统计方法 ： 所有结果数据采用均数 ± 标准差表示， 并利用 SPSS 13.0 软件包 分析。
3. 结果
3.1 不同浓度本发明药液对 L-O2 细胞损伤 OD 值情况
表 9 本发明与 CCL4 模型组 L-O2 细胞 OD 值比较 ( n ＝ 3)
注： 与正常对照组比较△ P ＜ 0.01 ； 与 CCL4 模型组比较 *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01
表 9 显示， 正常对照组 L-O2 细胞 OD 值均高于 CCL4 模型组及各药液组 (P ＜ 0.01) ； 本发明药液除在高浓度 (182mg/ml) 时， 与 CCL4 模型组之间 OD 值之间无明显差异 (P ＞ 0.05)， 其它各浓度组 OD 值均高于 CCL4 组 (P ＜ 0.05)。
3.2 本发明含药血清对 CCL4 损伤后肝细胞 OD 值变化情况
表 10 本发明对损伤后 L-O2 细胞 OD 值变化情况比较 ( n ＝ 3)
注： * 与 CCL4 组和空白组比较 P ＜ 0.05 ； △与益肝灵血清组比较 P ＜ 0.05
表 11 显示， 正常血清组与 CCL4 模型组 L-O2 细胞 OD 值比较无显著性差异 (P ＞ 0.05)。 本发明血清组及益肝灵血清组 L-O2 细胞 OD 值明显高于 CCL4 模型组和正常血清组， 差异显著 (P ＜ 0.05) ； 本发明血清组 L-O2 细胞 OD 值又显著高于益肝灵血清组 (P ＜ 0.05)。
4 结论 ：
本发明药液对人肝 L-O2 细胞具有抗 CCL4 损伤的作用， 除在高浓度 (182mg/ml) 时， 与 CCL 模型组之间 OD 值之间无明显差异 (P ＞ .05)， 其它各浓度组 OD 值均高于 CCL4 组 (P ＜ 0.05)， 提示本发明具有抗肝细胞损伤作用。
本发明含药血清和益肝灵含药血清对 L-O2 细胞生长作用后， OD 值明显高于空白 血清加 CCL4 组和 DMEM 加 CCL4 组， 二者之间的差异存在显著性 (P ＜ 0.01)， 二者对 L-O2 细 胞有抗损伤作用。
本发明含药血清和益肝灵含药血清对 L-O2 细胞生长作用后， OD 值之间存在显著
性差异 (P ＜ 0.05)， 说明本发明含药血清的抗 CCL4 损伤作用优于益肝灵含药血清。
实例 17 ： 临床疗效观察及典型病例
1. 临床观察资料
样品制备 ： 按 上 述 实 施 例 5 制 备 临 床 试 验 样 品， 规 格 为 10g/ 袋， 含生药量为 27.25g/ 袋。
本研究共纳入 60 例患者， 其中治疗组 30 例， 对照组 30 例。治疗组男 23 例， 女7 例； 对照组男 17 例， 女 13 例， 治疗组年龄范围 21 ～ 65 岁， 平均年龄 38.33±12.06 岁 ； 对 照组年龄范围 22 ～ 65 岁， 平均年龄 39.97±13.52 岁。治疗组最长病程最长 22 年， 最短 3 月； 对照组病程最长 20 年， 最短 7 月。病情轻重治疗组轻度 18 例， 中度 10 例， 重度 2 例 ； 对 照组轻度 14 例， 中度 14 例， 重度 2 例。治疗组与对照组的性别、 年龄、 病程等比较， 差别无 统计学意义 (P ＞ 0.05)。
诊断标准 ： ①有急性肝炎病程超过半年， 或原有乙型肝炎或 HBsAg 携带史。 ②具有 慢性乙型肝炎症状、 体征及肝功能异常。③慢性肝炎并有任何一项 ： 血清 HBsAg 阳性 ； 血清 HBV-DNA 阳性 ； 血清抗 -HBcAb 阳性 ； 肝内 HBcAg 和 / 或 HBsAg 阳性， 或 HBV-DNA 阳性被诊断 为慢性乙型肝炎。
服用方法 ： 每日三次， 每次一袋， 服用 6 个月。
疗效判定标准 ： ①显效 ： 自觉症状消失， 肝脾肿大稳定或缩小， 无压痛及扣痛 ； 其 他慢性肝炎体征减轻或稳定不变 ； 肝功能复常， 病毒复制指标降低。②有效 ： 症状明显减轻 或消失， 肝脾肿大稳定不变 ； 无明显压痛及叩痛， 肝功能检查恢复正常或较治疗前异常值下 降 50％以上， HBV DNA、 HbeAg、 HbsAg 有 1 项阴转。③无效 ： 疗程结束后， 未达到上述标准者。
结果 ：
表 11 两组降酶疗效的比较
表 11 显示治疗后治疗组降酶显效明显高于对照组， 有显著意义。(P ＜ 0.05) 表 12 治疗前后肝功能变化比较
注： 与治疗前比较， **P ＜ 0.01， 与对照组比较， #P ＜ 0.05。 表 12 显示， 发明组合药能显著改善患者 AST、 ALT 水平， 改善程度优于对照组 (P 表 13 两组乙肝病毒标志物疗效的比较18＜ 0.05)
102319321 A CN 102319324说明书17/19 页
表 13 显示治疗组乙肝病毒标志物疗效治疗组明显高于对照组， 而且两组间比较 差别有统计学意义 (P ＜ 0.05)。
表 14 两组病例治疗前后乙肝标志物检测指标变化的比较
表 14 显示治疗前后乙肝病毒标志物 HBV-DNA 转阴率高于对照组， ， 经统计学检验， HBV-DNA 转阴率在两组间有显著差异 (P ＜ 0.05)。
表 15 两组病例治疗前后乙肝标志物检测指标变化的比较
# 注： 为转阳率
本发明通过对临床 60 例慢性乙型肝炎疗效观察显示 ： 治疗组用本发明， 对照组 予复方益肝灵， 疗程为 6 个月， 观察两组患者治疗前后临床症状、 体征、 肝功能、 乙肝病毒 标志物的变化。结果显示 ： ①两组临床综合疗效比较 ： 治疗组显效率为 16.7％， 有效率为 76.7％， 总有效率为 93.4％； 对照组显效率为 3.3％， 有效率为 66.7％， 总有效率为 70.0％， 两组相比治疗组均高于对照组， 临床综合疗效比较有统计学差异 (P ＜ 0.05)。②治疗后两 组中医证候均较前有所改善， 在腹胀脘闷、 胁肋疼痛、 倦怠乏力、 大便稀溏证候方面治疗组 效果优于对照组， 两组比较有统计学意义 (P ＜ 0.05)。③改善肝功能方面比较 ： 两组治疗 后在 AST、 ALT、 γ-GT、 TB、 DB 等方面均较前明显改善， 在降酶及 γ-GT 方面两者比较有显著 差异 (P ＜ 0.05)， 治疗组效果优于对照组。④乙肝病毒标志物变化情况 ： 治疗组 HBsAg 阴
转率为 3.3％， HBeAg 阴转率 48.0％， HBV-DNA 阴转率 51.9％ ； 对照组 HBsAg 阴转率为 0％， HBeAg 阴转率 3.7％， HBV-DNA 阴转率 0％， 治疗组各项阴转率高于对照组， 两组比较在 HBeAg 阴转率和 HBV-DNA 阴转率方面有非常显著意义 (P ＜ 0.01)。 ⑤试验组中的治愈病例， 半年、 1 年后分别作回访， 均无复发。综上所述， 本发明的治疗效果良好。
典型的实例
1、 许某， 女， 30 岁， 江苏南京人。
主诉 ： 进食油腻食物后胸胁胀闷不舒 1 年余。
病史 ： 患者 1 年来进食油腻食物后时感胸胁胀闷不舒， 乏力， 既往有 CHB 病史 3 年， 2007 年 09 月 28 日查肝功能 ： 谷丙转氨酶 ： 161U/L， 谷草转氨酶 ： 110U/L， γ-GT ： 47U/L， 乙 肝五项 ： HBsAg(+)， HBeAg(+)， HBcAb(+)， HBV-DNA ： 2.22×106copies/ml。
刻诊 ： 两胁肋胀闷不舒， 偶有隐痛， 乏力明显， 纳食一般， 无口干口苦， 无嗳气泛酸， 无恶心呕吐， 二便正常， 舌苔黄腻， 舌质红， 脉细弦。
辨病 ： 慢性乙型病毒性肝炎。
辨证 ： 肝郁脾虚， 湿热瘀毒留恋不解。
治则 ： 疏肝健脾， 清热利湿， 活血解毒。
处方用药 ： 服用按上述实施例 5 制备的本发明颗粒剂。
复诊 (2 周后 ) ： 胸胁胀闷、 乏力略有好转， 寐差， 苔薄白， 脉细弦。
服本发明药物半年后 ( 未用抗 HBV 治疗 )， 胸胁无明显胀闷不适， 乏力不明显， 苔薄 舌红， 脉细弦， 复查肝功能正常， HBV-DNA ＜ 500copies/ml， 后复查肝功能正常。
2、 患者郑某， 男， 22 岁， 江苏南京人。
主诉 ： 反复乏力， 纳差 2 年余。
病史 ： 2 年 来 反 复 乏 力， 纳 差， 腹 胀， 胁 痛， 既 往 有 CHB 病 史 10 年， 肝功能反复 波 动。2007 年 09 月 27 日 查 ： AST 32U/L， ALT 29U/L， 乙肝五项： HBeAg(+)， HBV-DNA ： 3.06×103copies/ml。
刻诊 ： 乏力， 纳食欠佳， 腹胀， 胁痛， 便溏， 大便每日 2-3 次， 舌苔薄腻微黄， 舌质暗 红， 脉细弦。
辨病 ： 慢性乙型病毒性肝炎。
辨证 ： 湿热毒邪蕴结， 气滞血瘀， 肝脾失调。
治则 ： 调肝运脾、 清化瘀毒。
处方用药 ： 服用按上述实施例 5 制备的本发明颗粒剂。
复诊 (2 周后 ) ： 乏力， 纳差略有好转， 仍有腹胀， 胁痛， 大便每日 2 次， 苔薄白， 脉细 弦。
服药半年后 ( 未用抗病毒治疗 )， 乏力不明显， 偶有腹胀， 纳食可， 大便偶尔质稀， 苔薄舌红， 脉细弦， 复查肝功能正常， HBV-DNA ＜ 500copies/ml， 后复查肝功能正常。
3、 盛某某， 男， 35 岁， 江苏无锡人。
主诉 ： 右胁隐痛 3 年余， 间断痰中带血 1 月。
病史 ： 患者近 3 年时感乏力， 近 1 月来时有痰中带血， 既往有 CHB 病史 6 年， 未正规 治疗， 2007 年 4 月 13 日查肝功能 ： 谷丙转氨酶 ： 34U/L， 谷草转氨酶 ： 14U/L。
刻诊 ： 右胁隐痛， 无痰中带血， 纳食一般， 无嗳气泛酸， 无恶心呕吐， 二便正常， 舌苔薄白， 舌质红， 脉细弦。
辨病 ： 慢性乙型病毒性肝炎。
辩证 ： 湿热疫毒稽留， 病久正气受损， 肝脾不足， 邪实正虚。
治法 ： 先以祛邪为主， 暂以疏肝运脾、 清热凉血解毒为法。
处方用药 ： 服用按上述实施例 5 制备的本发明颗粒剂。
1 个月后复诊 ： 乏力及口干较前好转， 偶有胁痛， 无嗳气泛酸， 无恶心呕吐， 大便 1 次 / 日， 苔薄白， 舌淡红， 脉细弦。复查肝功能 ： ALT ： 32U/L， AST ： 26U/L， γ-GT ： 37U/L， 此 后应用此方治疗半年之后， 患者 HBV-DNA 降至 7.65×102copies/ml， 继续服用半年， 患者 HBV-DNA ＜ 500copies/ml， 后多次复 HBV-DNA 持续阴性。
最后， 应当指出， 以上实施例仅是本发明具有代表性的例子。显然， 本发明的技术 方案并不限于上述实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的 内容直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。21