水凝胶疫苗制剂.pdf

本发明涉及用于递送一种或更多种活性成分的组合物，并且更具体地涉及包含含有微生物的基质材料的组合物，例如珠子。特别地，本发明涉及含有选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物的组合物。基质材料还可包含表面活性剂，并且可进一步包含佐剂。本发明还涉及所述组合物的制备和用途，并且还涉及其他主题。

权利要求书
1.  一种组合物，其包含：
含有水凝胶形成聚合物的基质；和
包含在所述基质中的选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生 物和经灭活微生物的微生物、表面活性剂和佐剂。

2.  一种组合物，其包含：
●表面活性剂
●选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物 的微生物
●佐剂，以及
●水凝胶形成聚合物，其中包含所述表面活性剂、所述微生物和 所述佐剂；
其中当所述组合物与水组合时能够释放含有表面活性剂和佐剂的自 组装结构。

3.  根据权利要求1或2所述的组合物，其中至少一部分所述佐剂与 至少一部分所述表面活性剂缔合。

4.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中至少所述一部分 所述微生物内容物与至少一部分所述表面活性剂缔合。

5.  根据前述权利中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂与所 述水凝胶形成聚合物的重量比为1∶0.5至1∶2.5，任选1∶0.5至1∶2，例如 1∶1至1∶2.5或1∶1至1∶2。

6.  根据权利要求5所述的组合物，其中所述表面活性剂与所述水凝 胶形成聚合物的重量比为1∶1.4至1∶1.8，例如1∶1.6至1∶1.7。

7.  根据前述权利中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶形成聚合 物选自热致性水凝胶形成聚合物及其组合。

8.  根据权利要求7所述的组合物，其中所述水凝胶形成聚合物选自 明胶、琼脂、琼脂糖、果胶、角叉菜胶和壳聚糖及其组合。

9.  根据权利要求7或8所述的组合物，其中所述水凝胶形成聚合物 包含明胶或者是明胶。

10.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含 基于所述组合物干重的按重量计至少25％、适当地至少40％、例如25％ 至70％、或任选40％至70％的所述水凝胶形成聚合物。

11.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶形成 聚合物还包含增塑剂，例如山梨糖醇或甘油。

12.  根据权利要求11所述的组合物，其中所述增塑剂以按所述组合 物干重计的至多10％、例如3％至8％或适当地4％至6％存在于所述组 合物中。

13.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含壳聚糖。

14.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物为细 菌，并且任选为表达定居因子例如定居因子抗原I(CAF/I)的细菌。

15.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物为肠 产毒性大肠杆菌(E.coli)。

16.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物为幽 门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。

17.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物为霍 乱弧菌(Vibrio Cholerae)。

18.  根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述微生物 为病毒或真菌。

19.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含除所述微生 物之外的一种或更多种抗原，例如包含多种类型的微生物，例如多种类型 的单细胞微生物，任选包含细菌的多种菌株。

20.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是免疫 刺激剂或者包含免疫刺激剂。

21.  根据权利要求19所述的组合物，其中所述免疫刺激剂为T细胞 激活剂和/或者抗原呈递细胞或其他免疫细胞的激活剂。

22.  根据权利要求20所述的组合物，其中所述佐剂是或包含神经酰 胺，特别是a-GalCer。

23.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物由一 种或更多种单细胞微生物组成，佐剂与单细胞微生物总量的比例(佐剂的 干重mg∶10^10细胞)为0.1至100mg∶10^10细胞，任选地0.1至10mg∶10 ^10细胞，例如0.25至5mg∶10^10细胞，特别是0.4至5mg∶10^10细胞。

24.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂 为非离子型表面活性剂。

25.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂 的HLB值为10或更大，例如10至15。

26.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂 选自：聚乙二醇酯、聚乙二醇醚、二嵌段共聚物、三嵌段共聚物和两亲性 聚合物，及其组合。

27.  根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述表面活 性剂包含未取代的烷基链或被单羟基取代的烷基链。

28.  根据权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中所述表面活 性剂包含PEG链。

29.  根据权利要求28所述的组合物，其中所述表面活性剂是或包含 PEG化脂肪酸，例如PEG化羟基脂肪酸，并且任选地，其中所述PEG 化脂肪酸与游离PEG组合。

30.  根据权利要求29所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚乙二 醇-15-羟基硬脂酸酯。

31.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂 以基于所述组合物干重的按重量计20％至55％，例如30％至45％或30％ 至40％存在于所述组合物中。

32.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含阳离子脂 质，任选地，其中所述阳离子脂质选自DOTAP和DOSPER。

33.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物由一 种或更多种单细胞微生物组成，表面活性剂与单细胞微生物总量的比例 (表面活性剂的干重mg∶10^10细胞)为10至200mg∶10^10细胞，任 选地25至125mg∶10^10细胞，例如25至150mg∶10^10细胞、25至100 mg∶10^10细胞、50至200mg∶10^10细胞、50至100mg∶10^10细胞或 60至90mg∶10^10细胞。

34.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其形式为直径为0.5 mm至5mm的珠子。

35.  根据权利要求34所述的组合物，其中所述珠子的直径为1mm至 2mm。

36.  根据权利要求34或35所述的组合物，其中所述水凝胶形成聚合 物基本上是干的，并且其中所述珠子具有包衣。

37.  根据权利要求36所述的组合物，其中所述包衣包含活性成分。

38.  根据权利要求36或37所述的组合物，其中所述包衣为立即释放 包衣。

39.  根据权利要求36至38中任一项所述的组合物，其中所述珠子包 含受控释放包衣，例如肠溶包衣。

40.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含免疫增强营 养物质，例如选自如下的一种或更多种营养物质：维生素A、B(例如， 维生素B6、维生素B12、烟酸(维生素B3)、泛酸、核黄素(维生素 B2)、硫胺(维生素B1)和叶酸之一或组合)、维生素C、维生素E、 类胡萝卜素例如β-胡萝卜素、铁、锰、硒和锌，例如其中所述组合物在与 所述表面活性剂缔合的基质(水凝胶形成聚合物)中和/或在包衣中包含 营养物质。

41.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微生物包含 或是完整的与片断化的微生物细胞的组合，并且任选所述微生物经福尔马 林杀灭。

42.  根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当将所述组合物 置于水性溶解介质中时，来自所述溶解介质的水与所述水凝胶聚合物接 触，此时释放含有表面活性剂的自组装结构(例如胶束)，其中使用动态 光散射测量的所述自组装结构的流体动力学直径为约0.5nm至200nm例 如约1nm至50nm，或约5nm至25nm。

43.  一种方法，其包括混合：
i)含有表面活性剂、佐剂和选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒 微生物和经灭活微生物的微生物的表面活性剂预混合物；与
ii)含有水和水凝胶形成聚合物的液体水性预混合物。

44.  根据权利要求43所述的方法，其还包括通过单孔喷嘴喷射i)与 ii)的混合物以形成液滴，然后促使或使所述水凝胶形成聚合物固化，所 述液滴由此形成珠子。

45.  根据权利要求43或44所述的方法，其中在混合i)与ii)之前， 所述表面活性剂预混合物的温度低于所述水相的温度。

46.  根据权利要求45所述的方法，其中在将两者混合在一起之前， 所述表面活性剂预混合物的温度低于所述水性预混合物的温度，并且其中 临近于所述单孔喷嘴将i)和ii)混合。

47.  根据权利要求43或44所述的方法，其中所述水凝胶形成聚合物 为热致性聚合物或热致性聚合物的混合物，所述水性预混合物处于较高的 温度，所述表面活性剂预混合物的温度不超过环境温度，所述两种预混物 通过各自的进料管流至混合装置，在此混合所述两种预混合物，其中与从 所述混合装置行进至所述喷嘴的混合物相比，所述两种预混合物中的至少 一种通过其进料管行进的距离更长。

48.  根据权利要求47所述的方法，其中通过与所述喷嘴并列设置的 线上混合装置将所述两种预混合物混合。

49.  一种方法，其包括将(i)表面活性剂、(ii)选自活微生物、经 杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物和(iii)佐剂混合。

50.  根据权利要求49所述的方法，其中将诸如中链甘油三酯的疏水 性赋形剂与所述表面活性剂、所述微生物和所述佐剂混合。

51.  根据权利要求49或50所述的方法，其还包括将所得到的表面活 性剂混合物与含有水和水凝胶形成聚合物的水性预混合物混合，所述表面 活性剂为足以形成诸如胶束的自组装结构的量。

52.  一种方法，其包括混合含有水、水凝胶形成聚合物、表面活性剂 和选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物之活性成 分的材料以形成诸如胶束之自组装结构在含有所述水凝胶形成聚合物的 水相中的分散体。

53.  根据权利要求52所述的方法，所述方法用于形成诸如胶束之自 组装结构的水性分散体，其包括：
(i)形成包含水和水凝胶形成聚合物的水相预混合物；
(ii)进行权利要求51或52所述的方法以形成表面活性剂相预混 合物；然后
(iii)以使表面活性剂形成自组装结构的比例将所述水相预混合物 和所述表面活性剂相预混合物混合，以形成自组装结构的分散体。

54.  根据权利要求43至53中任一项所述的方法，其中将所述水性预 混合物和所述表面活性剂预混合物混合以形成微乳剂。

55.  根据权利要求43至54中任一项所述的方法，其还包括使所述分 散体形成为成形单元，例如珠子。

56.  根据权利要求55所述的方法，其中所述形成包括通过单孔喷嘴 喷射所述分散体以形成液滴，促使或使所述液滴落入与水不混溶的冷却液 中，其中所述液滴冷却而形成珠子，然后从所述冷却液中分离所述珠子。

57.  根据权利要求55或56所述的方法，其还包括向所述成形单元施 加一种或更多种包衣。

58.  根据权利要求57所述方法，其中所述一种或更多种包衣包括选 自立即释放包衣和受控释放包衣的至少一种包衣，例如其中所述受控释放 包衣为肠溶包衣。

59.  根据权利要求43至58中任一项所述的方法，其还包含权利要求 5至33、40至42中任一项或引用关系所允许的所述权利要求的任意组合 描述的特征。

60.  一种组合物，其具有根据权利要求43至59中任一项所述的方法 制备的组合物的特征。

61.  一种口服剂型，其包含权利要求34至41中任一项所述珠子的群 或通过权利要求55至58中任一项能够获得的成形单元群。

62.  根据权利要求61所述的剂型，其包含所述珠子或成形单元的第 一群或和所述第一群不同的所述珠子或所述成形单元的第二群。

63.  根据权利要求61或62所述的剂型，其用于在包括至少一次加强 施用的施用方案中使用。

64.  一种产品，其具有通过干燥包含水凝胶之组合物获得的组合物的 特征，所述水凝胶具有分散在其中的自组装结构，所述组合物还包含含有 选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物之抗原的第 一活性成分和含有佐剂的第二活性成分，所述组合物还任选地如权利要求 3至42中任一项或引用关系所允许的所述权利要求的任意组合限定。

65.  根据权利要求64所述的产品在制备诸如明胶胶囊剂的口服剂型 中的用途。

66.  一种用于向对象施用选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生 物和经灭活微生物之微生物的方法，其包括经口向所述对象施用含有选自 活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物之抗原的产品， 其中所述产品是如权利要求1至43中任一项所限定的组合物或如权利要 求61至63中任一项所限定的剂型或如权利要求60或64所限定的产品。

67.  一种用于针对由微生物导致的疾病给对象接种疫苗的方法，其包 括经口向所述对象施用含有选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物 和经灭活微生物之抗原的产品，其中所述产品为如权利要求1至43中任 一项所限定的组合物或如权利要求61至63中任一项所限定的剂型或如权 利要求60或64所限定的产品，其中包含在所述产品中的灭活或减毒形式 的所述微生物在施用所述产品后有效产生针对所述致病微生物的免疫应 答。

68.  根据权利要求66或67所述的方法，其包括在首次给药后重复施 用所述产品，例如在所述首次给药后至少一周的时间。

69.  根据权利要求66或67所述的方法，其包括重复施用所述产品至 少两次，各次施用相互隔开，例如相隔至少一周的时间。

说明书水凝胶疫苗制剂
本发明涉及用于递送一种或更多种活性成分的组合物，并且更特别 地涉及包含含有微生物的基质材料的组合物，例如珠子。特别地，本发明 涉及含有选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的 微生物的组合物。所述基质材料还可包含表面活性剂，并且可进一步包含 佐剂。本发明还涉及所述组合物的制备和用途，并且还涉及其他主题。
背景技术
现有技术公开了一种经改性的释放制剂产品(a modified release  dosage product)，其包含多个含有活性成分的微胶囊(也称为“珠子”)。 所述珠子可通过将彼此不相溶或几乎不相溶的两种不同液体混合而产生， 并且其中一种液体为含有明胶或其他胶凝剂的水性液体。将所述液体混 合，并通过喷嘴喷射得到的混合物，所述喷嘴可具有单孔。在通过喷嘴喷 射混合物时，该喷嘴可振动。经喷射的混合物形成大致呈球形的液滴，液 滴落入冷却气体(例如，空气)中或落入冷却或硬化溶液中，胶凝剂由此 胶凝化，液滴变成微胶囊。公开的珠子通过借助于单孔喷嘴喷射其水相包 含明胶或其他水溶性聚合物基质材料的水包油乳剂制备而成，所述珠子含 有活性剂，可将干燥后的珠子描述为经干燥的水包油乳剂，其中经干燥的 水相中含有聚合物基质材料。参见例如WO 2004/084870、WO  2008/132712和WO 2010/133609，其全部通过引用整体并入文本。现有 技术中未公开经所述现有技术干燥的水包油乳剂的油滴的尺寸，但是已对 其进行了测量，并且发现其为约100nm，或有时低至约50nm。
上述申请WO 2010/133609之珠子的X-射线断层摄影图像示于图9 中。该图像示出了珠子的高度均匀性，即油相几乎遍布整个水相。
树突细胞在机体内的免疫系统中起至关重要的作用。树突细胞的主 要作用是加工抗原物质并将抗原呈递给免疫系统中的其他细胞。肠树突细 胞见于消化道相关的淋巴组织中，包括小肠和大肠的固有层、分离的淋巴 滤泡、派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结。树突细胞以功能上不同的两种状 态存在：未成熟细胞和成熟细胞。未成熟树突细胞存在于外周组织中，主 要为吞噬细胞；成熟树突细胞见于淋巴器官中，专用于抗原呈递。成熟的 树突细胞来源于经历成熟加工后的未成熟细胞，所述成熟加工由炎性刺激 引发，并导致树突细胞大量迁移至引流淋巴结(draining lymph node) (Banchereau，Nature.392：245-252；Steinman，Eur.J.Immunol.37 S53-S60)。
人和小鼠炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease)模型中的一些观 察结果表明树突细胞可起致病作用。功能障碍的树突细胞可：通过在组织 性淋巴组织(organized lymphoid tissues)中引发T细胞对肠道菌群的异 常应答来起作用；通过与T细胞相互作用来维持T细胞在发炎粘膜中的 反应性；以及通过释放促炎性细胞因子来发挥其作为效应细胞的功能 (Rescigno，J.Clin.Invest.119：2441-2450)。
树突细胞是有效的免疫刺激性细胞(Steinman1991)，肠树突细胞通 过将突出直接延伸到用于抗原取样的腔内而穿过肠上皮来积极地参与抗 原捕获(Rescigno，Nat.Immunol.2：361-367)。这些细胞可摄取经口和肠 内两者施用的抗原并将其呈递给幼稚T细胞(Liu和MacPherson，1991)。 认为树突细胞有效捕获和呈递抗原是诱导免疫应答的中心(Colaco， 1999)。
在已知抗原见于腹腔病中的情况下，潜在的基于树突细胞的抗原特 异性策略可利用树突细胞扩增和诱导Treg-主要的耐受性效应细胞的能 力，所述效应细胞进而抑制呈递致病抗原的其他树突细胞(Steinman， Immunity.29：319-324)。
发明内容
在下文的说明书和所附权利要求书中公开了本发明的全部范围。但 是为了有助于读者阅读，本段给出了简短的非限制性概述。本发明提供了 (尤其)珠子，所述珠子可通过将明胶水溶液或另一种水凝胶形成聚合物、 表面活性剂、微生物和任选的佐剂混合获得，所述表面活性剂可为聚乙氧 基化脂肪酸(例如，聚乙氧基化羟基脂肪酸)或聚乙氧基化脂肪醇，所述 微生物选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物。至 少一部分佐剂可与至少一部分表面活性剂缔合。将混合物转化成珠子，其 被认为含有表面活性剂之自组装结构(例如胶束)在水凝胶中的分散体。 然后，干燥该珠子以获得分散在聚合物基质中的表面活性剂自组装结构 (例如胶束)或在与水接触时释放该结构的前体。在任何情况下，本发明 均包括经干燥的含表面活性剂的珠子，其在与水，例如胃肠道的水性介质 (该水性介质可例如从胃肠道提取或通过合成方法制备)中的水接触时递 送自组装结构(例如胶束)。本段中公开的产品和方法是本发明的一部分， 因此可被要求保护，但是本发明并不局限于本段的主题。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含：(i)表面活性剂 和(ii)活性成分。活性成分含有选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒 微生物和经灭活微生物的微生物。该组合物还可包含佐剂。此外，该组合 物还可包含选自水凝胶形成聚合物(特别是热致性水凝胶形成聚合物)的 一种或更多种赋形剂。该组合物可基本由表面活性剂和一种或更多种活性 成分组成。该组合物可基本由表面活性剂、一种或更多种活性成分和水组 成。表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。表面活性剂可含有亲水链和 疏水链。还应提及离子型表面活性剂，例如阴离子表面活性剂。
本发明包括组合物，所述组合物包含：含有水凝胶形成聚合物的基 质；和包含在所述基质中的选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物 和经灭活微生物的微生物、表面活性剂和佐剂。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包 含：(i)表面活性剂；(ii)选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生 物和经灭活微生物的微生物；(iii)佐剂；和(iv)表面活性剂、微生物 和佐剂包含在其中的水凝胶形成聚合物，其中当该组合物与水组合时， 其能够释放含有表面活性剂和佐剂的自组装结构(例如胶束)。所述水可 以是例如胃液、肠液或结肠液形式，或者它们之一的模拟形式。应重申， 表面活性剂可含有亲水链和疏水链。
对于本文公开的所有组合物，至少一部分佐剂可与至少一部分表面 活性剂缔合。
对于本文公开的所有组合物，至少一部分微生物内容物可与至少一 部分表面活性剂缔合。
本发明在其范围内包括一种组合物，所述组合物包含：水凝胶形成 聚合物、分散在聚合物中的自组装结构(例如胶束)和微生物。该水凝胶 形成聚合物与水组合成凝胶态或溶胶态，或者该水凝胶形成聚合物可以 是干燥的。如本文进一步所述，可对该组合物进行包衣。
所述微生物选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活 微生物。微生物可与佐剂一起包含在组合物中。本发明中的微生物是免 疫原性的，例如其含有(内部或外部)或表达或释放单独或与佐剂组合施 用于对象时可触发免疫应答的抗原性物质。所述组合物(例如本段中提及 的组合物)用于免疫原性用途。特别地，本发明提供了一种组合物，其包 含：含有水凝胶形成聚合物的基质和包含在基质中的选自活微生物、经 杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物、表面活性剂和佐 剂。
本文中，有时将自组装结构(例如胶束)形式的表面活性剂或与水 组合时能够形成自组装结构(胶束)的表面活性剂称为“自组装形成表面 活性剂”或“胶束形成活性剂”。(该表面活性剂当然可包含表面活性剂 化合物的混合物)。
可将本发明的一个实施方案描述为干水凝胶形成聚合物基质，所述 基质中包含选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生 物的微生物、表面活性剂和佐剂。该干水凝胶形成聚合物基质可具有含 有表面活性剂和任选佐剂的自组装结构(例如胶束)在其中的分散体。可 将本发明的一个实施方案描述为干自组装结构在水凝胶中的分散体(例如 胶束在水凝胶中的分散体)，其中该自组装结构形成物是或包含表面活性 剂，特别是含有亲水链和疏水链的化合物。可将发明的一个实施方案描述 为干自组装结构在水凝胶中的分散体，其中在一些实施方案中，该自组装 结构形成体是或包含含有亲水链和疏水链的化合物。在一个实施方案中， 所述组合物不是粉末。在另一些实施方案中，可将该组合物模制成和/或 成形为例如诸如球形珠子的珠子形式或其他成形单元形式。在一些实施方 案中，本发明的组合物包含多个自组装结构在模制或成形形式(例如珠子) 中。应当理解，术语“球形”指人眼看起来基本像或一般属于球形形状而 无需使球体达到数学标准的珠子。换言之，本文所述的“球形”珠子一般 是类似球形的，即类似或近似球形。尽管，由于制备工艺的原因，本文公 开的珠子群可包含偶尔非类似球形的珠子，但是本文中提及到的例如多个 珠子或珠子群涵盖这样的珠子集合，其不仅包括本文所述的球形(类似球 形的)珠子，还包括非球形(即非类似球形的)珠子。
当在本发明的干组合物中时，可将自组装结构形成表面活性剂(例 如胶束形成表面活性剂)描述为前自组装结构(例如前胶束)形式。
本发明不仅包括干组合物，还包括“湿”组合物，其中水凝胶形成 聚合物是水凝胶形式。本发明包括其中水凝胶形成聚合物与液态水组合 的液体。
从现有技术预测不到之本发明的一个益处是提供了一种有效的疫苗 制剂，所述制剂可有利地经口施用。具体地，本发明提供了一种用于递 送“全细胞”疫苗的改进制剂，其中抗原性物质以选自活微生物、经杀 灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物形式被递送。本发明 人发明了一种“全细胞”制剂，发现其在经口施用时诱导有效的抗原特 异性抗体应答(如本文的体内数据所证明)。与施用单纯的“全细胞”溶 液相比时，施用本发明的“全细胞”制剂后观察到显著提高的抗体应 答。此外，意想不到的是，与测试过的“亚基”制剂，例如霍乱毒素B 亚基制剂相比，对于“全细胞”制剂，在全身和局部肠应答方面均观察 到更显著的提高(参见实施例中的比较研究)。
认为本发明的另一益处源自由表面活性剂形成的自组装结构的尺 寸。特别地，与通过下文WO 2010/133609的教导获得的油滴相比，观 察到由胶束形成表面活性剂在水性介质中形成的胶束更小，并且以较高 的数目存在。根据本公开形成的胶束一般为10nm至30nm。与现有技 术的较大油滴相比，较小的尺寸产生较大的表面积，同时较大的数目在 水性介质(例如存在于胃肠道中的水性介质)中释放/形成后可提供更多 的分散体和胶束分布。这些特征进而导致其与上皮更好地接触和更好的 吸收。还应提及的是，就尺寸而言，以本发明的实施方案为特征的表面 活性剂胶束(至少就应用中的组合物释放的胶束而言)提供了尺寸方面的 更均匀群，即对于尺寸具有较低的多分散性。认为10nm至30nm(大 约)的这些小尺寸胶束是本说明书所述组合物固有的，但胶束的尺寸任选 应在或应主要在该范围(例如，至少为它们的75％，任选至少80％或至 少90％)内，但并非强制性的。
本发明的某些组合物包含：选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒 微生物和经灭活微生物的微生物和佐剂，该组合物有利地同时释放两种 组分。例如，已对含有肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli，ETEC)和 α-GalCer的组合物进行了测试，其中肠产毒性大肠杆菌是可片断化的细 胞部分的全细胞抗原性物质，α-GalCer是一种这样的佐剂，其为凭借具 有糖头部和由脂肪酸和鞘氨醇链组成的神经酰胺部分而含有亲水性和疏 水性基团两者的两亲性糖脂。以被认为能够释放诸如胶束的自组装结构的 组合物形式施用活性成分ETEC和α-GalCer，当与水组合时，以含有作 为自组装结构形成剂(例如胶束形成剂)的HS15的组合物形 式。还制备了含有全细胞霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)和作为佐剂的 α-GalCer以及HS15的类似组合物，认为这些组合物与水接 触时能够释放自组装结构(例如，胶束)。认为在制备期间，这些组合物 包含分散在水凝胶(例如含有明胶)中的自组装结构(例如含有 HS15作为一种或该自组装结构形成表面活性剂)。然后，干 燥这些组合物，并在储存和后续施用前，对其进行包衣。发现这些组合物 具有有效的免疫原性和免疫保护性。WO 2010/133609中举例的现有技术 疫苗制剂是基于蛋白质的干水凝胶包油乳剂。在不受理论限制的情况下， 推测本发明的组合物同时释放两种药剂，从而使佐剂在与抗原接触前或在 与抗原接触时能够激发合适的免疫细胞。同样在不受理论限制的情况下， 认为至少一部分α-GalCer与至少一部分自组装结构形成表面活性剂(例 如HS15)缔合，例如自身包含在胶束的表面活性剂被膜 (surfactant envelope)中。此外，在疫苗的背景下，认为胶束具有用于 被诸如巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞的抗原呈递细胞摄取的有利尺 寸。
因此，本发明的一个方面提供了一种组合物，其包含含有水凝胶形 成聚合物的基质和包含在所述基质中的选自活微生物、经杀灭微生物、 经减毒微生物和经灭活微生物的微生物(例如ETEC或例如霍乱弧菌(V. Cholerae))、表面活性剂和佐剂。本发明还提供了一种包含以下组分的 组合物：
●表面活性剂(例如聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，特别是Kolliphor  HS 15，
●选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的 微生物(例如ETEC或例如霍乱弧菌)，
●包括α-GalCer的佐剂，以及
●表面活性剂、微生物和佐剂α-GalCer包含在其中的水凝胶形成聚 合物，
其中当该组合物与水组合时，其能够释放自组装结构(例如胶束)。具体 地，分散在聚合物中并且与水组合时可形成自组装结构(例如胶束)的表 面活性剂为聚乙二醇羟基脂肪酸，特别是聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯， 例如是Kolliphor，特别是Kolliphor HS 15。更具体地，微生物为 ETEC。在另一方面，微生物为霍乱弧菌。
胃肠道的不同部分吸收物质的程度特别取决于所涉及物质的物理化 学性质。因此，与结肠相比，疏水性活性剂更易被小肠吸收。某些微生 物(例如，特定的ETEC株系)尤其过表达抗原性物质，例如CAF/I。 这些株系由此具有疏水性表面(更多信息请参见PNAS，2009年6月30 日，第106卷，第26期，10793-10798；和Infect.Immun，2006年2月， 第1062-1071页)。特别地，本发明包括根据本文所述实施方案中任一实 施方案的组合物，其包含表达定居因子(colonisation factor)(例如， CAF/I)的微生物菌株。所述微生物菌株可选自过表达主要的定居因子 CAF/I、CAF/II、CAF/IV等的重组大肠杆菌(Recombinant E.coli)、 志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和霍乱弧菌菌株，包括 DHSαλpir、SY327αλpir、SM10λpir、WS-4437A、WS-1858B、A18-34、 A18-34Ap、A18-34ApTp、ACAM2010(pSTREP)、E1392/75、 E1392/75-2A、PTL003。
此外，理想的是保护含有活性剂(例如本文所述微生物)的制剂免 受降解，一般包括保护其免受胃酸和胃酶或肠酶降解。
有利的是制剂被设计成允许以易于被合适的免疫细胞摄取或以合适 的方式与其相互作用的形式同时释放佐剂和抗原，所述免疫细胞位于胃 肠道上皮屏障的表面或位于其下方。
在一个实施方案中，水凝胶形成聚合物基质(可称为干分散体的水 相)包含如下获得的交联水凝胶形成聚合物：例如通过以化学方法或物理 化学方法(例如干燥)固化液态的水性连续相，使得基质或干燥的胶束分 散体中基本不存在水并且胶束被固定化。因此，在该实施方案中，可将 干水相称为固定化基质。
表面活性剂相可任选地包含或是含有疏水链和亲水链的表面活性 剂。任选地，该表面活性剂相可包含活性成分(例如，疏水性活性成分、 两亲性活性成分或两者)。该表面活性剂相可包含疏水性赋形剂，任选地 以及活性成分。在一些实施方案中，该表面活性剂相包含两亲性赋形剂， 任选地以及疏水性赋形剂和活性剂之一或两者。
涉及自组装结构(例如，胶束)时，术语“释放”指自由地移动、 外出(egress)、结合、溶解、(再)乳化等，尽管实际的移动、外出、 结合、缔合或(再)乳化不是必需的，即可不发生，但是实际上可对其进 行有意的限制，例如通过包衣或包覆的存在和/或通过向水凝胶形成聚合 物基质中加入某些限制性或延缓性物质。
术语“自组装结构”指在水性环境的存在下自发形成的任何类型的 胶束、囊泡、微乳剂(microemulsion)、溶致相(lyotropic phase)、层 状结构或其他自组织结构或其组合。众所周知，当自组装结构形成物质 (例如含有表面活性剂或由其组成的自组装结构形成物质)以高于特定临 界浓度存在时形成自组装结构。该术语包括，例如胶束、反胶束和脂质 体及其组合。本说明书中提及的自组装结构可包含胶束或者是胶束。关 于自组装结构的更多信息可见于Raoul Zana的“Dynamics of Surfactant  Self-assemblies Micelles，Microemulsions，Vesicles and Lyotropic  Phases”，特别是其第1章中，其内容均通过引用并入本文。可通过使 组合物与水接触，并利用合适分析方法(诸例如动态光散射)观察这样的 结构来确定自组装结构从珠子或其他组合物中的释放。
在某些实施方案中，自组装结构作为微乳剂存在。例如，微乳剂可 在制备根据本发明的组合物期间通过混合表面活性剂(任选地以及微生物 和/或佐剂)以及含有水凝胶形成聚合物的水相形成。还可基于如下形成 微乳剂：经口施用组合物后，组合物暴露于溶解介质、适当地水性介质 (例如胃肠道流体)中，此时从组合物中释放自组装结构或由组合物形成 自组装结构。微乳剂与常规乳剂的不同之处在于，微乳剂是热力学上稳定 的体系，其含有非常小的自组装结构使得该组合物具有透明溶液的外观 (即是光学各向同性的)。微乳剂旨在涵盖这样的体系，其中自组装结构 以使得组合物具有微乳剂特性的形式(即热力学上稳定的自组装结构分散 体)存在，该结构足够小到提供光学各向同性的(透明的)溶液。该结构 包含表面活性剂，并且还可包含，例如佐剂。
一般而言，存在于组合物中或由组合物形成并从其释放的自组装结 构的尺寸为约0.5nm至200nm，例如约1nm至50nm，或约5nm至 25nm。可利用诸如分子相关光谱学、动态光散射或NMR技术的公知技 术测量自组装结构的尺寸，所述结构存在于组合物中，或者其可在组合 物暴露于水性溶解介质中时形成和/或释放。组合物(例如，微乳剂)的 光学各向同性可利用光学方法(例如，偏振显微镜检查)来确定。用于表 征微乳剂的这些及其他方法是公知的(参见例如Narang等Int J. Pharmaceutics 345(2007)9-25)。用于测量自组装结构(包括例如胶束) 的特定方法为动态光散射。
本发明的另一特征包括本文所述的组合物，其中当将该组合物置于 水性溶解介质中时，溶解介质中的水与水凝胶聚合物接触，此时组合物释 放含有表面活性剂的自组装机构(例如胶束)；其中利用动态光散射测量 的自组装结构的流体动力学直径为约0.5nm至200nm例如约1nm至50 nm或约5nm至25nm。适用于测量自组装结构尺寸的动态光散射装置 是公知的，并且包括例如Zetasizer Nano S(ex Malvern Instruments Ltd)。 Nano S包含于633nm波长下工作的4mW氦氖激光器和雪崩光电二极管 (APD)检测器。提及使用动态光散射的自组装结构(例如胶束)尺寸 指对应于测量的扩散系数的流体动力学直径。提及水接触溶解介质指水渗 透液，例如，任何包衣例如可存在于组合物上的受控释放或肠溶包衣。并 不认为水性溶解介质的性质是关键的，其可以是，例如pH为7.3至7.4 的37℃水。或者，如下文所述，可将该pH升高至例如pH 5.5或更高以 溶解存在于组合物上的肠溶包衣，从而使水能够接触水凝胶聚合物。或者， 该溶解介质可以是胃肠液或模拟的胃肠液。如本文所述，自组装结构含有 表面活性剂(或表面活性剂的混合物)，并且还可包含与该结构缔合的佐 剂。
该方法还可用于测量在制备本发明组合物期间形成的自组装结构 (例如，胶束)或其他结构的尺寸。例如，该方法可用于测量在形成微乳 剂或微乳剂样组合物期间的分散相的尺寸，如本文所述，所述形成是由 将表面活性剂相与水性水凝胶形成聚合物混合引起。
某些实施方案包含选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和 经灭活微生物的微生物和佐剂。优选地，佐剂为直接或间接免疫刺激 剂，例如为免疫细胞激活剂，例如抗原呈递细胞激活剂和/或T细胞激活 剂。代表性抗原为肠产毒性大肠杆菌(ETEC)。佐剂的代表性优选实例 为α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)(例如KRN 7000)或其他糖脂佐剂， 例如除α-GalCer之外的另一种糖基神经酰胺或糖基神经酰胺类似物。糖 基神经酰胺类似物是公知的，并且在本文中进行了描述，例如WO  2004/028475中教导的类似物，其通过引用整体并入文本。特别优选α-半 乳糖基神经酰胺。
现在考虑自组装结构形成表面活性剂，其具体可以是非离子型表面 活性剂，在许多实施方案中，其含有PEG部分，PEG也称为聚(氧乙烯)。 表面活性剂可含有选自烷基链和烯基链的疏水链，该疏水链可以是取代 的，例如被诸如羟基单取代的，只要保持其疏水特性即可。在某些实施方 案中，自组装结构形成表面活性剂选自：聚乙二醇酯、聚乙二醇醚、二嵌 段共聚物、三嵌段共聚物和两亲性聚合物及其组合。优选地，表面活性剂 选自聚乙二醇酯。
在某些实施方案中，表面活性剂具有较高的疏水/亲油平衡值 (HLB)，例如表面活性剂的HLB值为10或更大，例如10至15，适当 地10至14，例如12至14。
在某些实施方案中，表面活性剂可具有蜡样特性。表面活性剂可包 含脂肪酸的聚乙二醇酯，例如脂肪酸(例如硬脂酸和/或12-羟基硬脂酸) 的聚乙二醇单酯和二酯。在一个实施方案中，所述脂肪酸为饱和脂肪酸 (例如硬脂酸和/或12-羟基硬脂酸)。在另一实施方案中，所述脂肪酸为 不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物。特别地，表面活 性剂可包含脂肪酸，适当地饱和脂肪酸(例如硬脂酸和/或12-羟基硬脂 酸)的聚氧乙烯酯。在这些实施方案中，小部分的12-羟基可用聚乙二醇 醚化。表面活性剂还可包含游离的聚乙二醇。
在某些实施方案中，表面活性剂为聚乙二醇酯聚乙二醇-15羟基硬脂 酸酯。代表性的聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯由BASF以HS 15 市售，其符合于2006年7月公开在第6版的欧洲药典(European  Pharmacopoeia)专刊号2052聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯的要求。因此， 本发明中使用的特定种类的表面活性剂为符合于2006年7月公开在第6 版的欧洲药典专刊号2052聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯之要求的这些表面 活性剂。本文中提及“Kolliphor”包括提及Kolliphor HS 15。Kolliphor HS 15可被符合所述专刊号2052之要求的其他表面活性剂替代。
水凝胶形成聚合物可以是热致性水凝胶形成聚合物或此类聚合物的 组合。水凝胶形成聚合物可以是明胶。
本发明还提供了用于制备本发明组合物的自组装结构分散体(特别 是胶束分散体)，该自组装结构分散体包含分散在水相中的表面活性剂， 所述水相包含含有水和水凝胶形成聚合物的液体。该分散体可包含含有 选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物 的抗原。该分散体还可包含疏水性和/或两亲性活性成分，例如佐剂，特 别是佐剂α-GalCer。该分散体可包含亲水性活性成分。应理解，该自组 装结构分散体可与本发明的组合物含有相同的组分，不同之处在于该自 组装结构分散体额外含有大量水。
在另一方面，本发明提供了一种用于制备活性剂/活性成分(例如微 生物)预混合物的方法。本发明的方法包括混合表面活性剂、含有选自活 微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物的抗原 和任选的佐剂，特别是佐剂α-GalCer。表面活性剂和抗原可如本文其他 部分进一步所述。
本发明包括下述方法和通过该方法可获得的组合物(具有通过该方 法获得的组合物的性质)，无论是直接还是间接。该方法包括混合：
i)含有表面活性剂、佐剂和选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微
生物和经灭活微生物之微生物的表面活性剂预混合物；和
ii)含有水和水凝胶形成聚合物的液体水性预混合物。
前述段落的方法还可包括通过单孔喷嘴喷射i)和ii)的混合物以形 成液滴，然后促使水凝胶形成聚合物固化或使其固化，液滴由此形成珠子。 该水凝胶形成聚合物为热致性聚合物或热致性聚合物的混合物，该水性预 混合物处于较高的温度下，该表面活性剂预混合物的温度不超过环境温 度，两种预混物通过各自的进料管流至混合装置，在此混合两种预混合物， 其中与混合物从混合装置行进至喷嘴相比，该两种预混合物的至少一种通 过其进料管行进的距离更长。可在与喷嘴并列设置的位置，例如通过与喷 嘴并置的线上(in-line)混合装置线上混合两种预混合物。
本发明还提供了一种这样的方法，其包括：
(i)混合含有水、水凝胶形成聚合物、表面活性剂和活性成分(例如 选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物和 任选的佐剂)的材料以形成含有水凝胶形成聚合物的水相中的自组装结构 分散体(可能是胶束分散体)，该方法还任选包括
(ii)如下将(i)的分散体配制成合适形式(例如，珠子)：通过单 孔喷嘴喷射该分散体以形成液滴，促使或使该液滴进入冷却介质，例如与 水不混溶的冷却液中，在此液滴冷凝而形成诸如珠子的成形单元。本发明 包括通过该方法可获得(无论是直接还是间接)的成形单元(例如珠子)， 即包括具有通过该方法获得(无论是直接还是间接)的成形单元之特征的 成形单元(例如珠子)。
在一些实施方案中，本发明包括用于制备本发明的组合物或分散体 的方法，其包括：形成含有水和水溶性/分散性材料的水性预混合物和含 有表面活性剂和表面活性剂可溶性/分散性材料的表面活性剂预混合物 (任选包含油)，并将两种预混合物组合以形成水相中含有水凝胶形成聚 合物的自组装结构分散体(可能是胶束分散体)。然后，将该分散体形成 前述段落中所述的珠子。更具体地，组合物的制备方法可任选包括：
(i)形成含有水溶性组分(例如水凝胶形成聚合物、任何水溶性赋形 剂、任何疏水性活性成分(例如可以包含在例如水性混悬液的水相预混合 物中的微生物))的水溶液或通常由该溶液组成的水相预混合物；
(ii)形成含有疏水性和两亲性组分的表面活性剂溶液或通常由该溶 液组成的表面活性剂相预混合物(例如选自微生物的活性成分可直接包含 在表面活性剂预混合物中或以水性混悬液的形式包含在表面活性剂预混 合物中(例如表面活性剂包水乳剂的形式))；
(iii)将两相混合以形成分散体；以及任选地
(iv)如下将分散体配制成珠子或其他成形单元：例如通过单孔喷嘴 喷射该分散体以形成液滴，促使或使该液滴落入与水不混溶的冷却液 中，在此液滴冷凝而形成珠子，然后使珠子与冷却液分离。
本发明还提供了一种这样的方法，其包括混合(i)表面活性剂和(ii) 选自微生物的活性成分，该混合还可包括混合诸如中链甘油三酯的疏水 性赋形剂、表面活性剂和微生物。可将得到的表面活性剂混合物与含有水 和水凝胶形成聚合物的水性组合物混合，其中表面活性剂的量足以形成自 组装结构(例如胶束)，混合由此形成自组装结构分散体。
本发明的另一种方法为如下方法，其包括将含有(i)水、(ii)水凝 胶形成聚合物、(iii)表面活性剂和(iv)活性成分的材料混合以形成含 有水凝胶形成聚合物的水相中的自组装结构(例如，胶束)分散体。
本发明包括包含含有自组装结构形成化合物的自组装结构(例如胶 束)分散在其中的水凝胶的组合物作为在制备本公开内容最终组合物期间 获得的中间产物，所述化合物任选选自具有亲水链和疏水链的化合物， 所述组合物还包含本文所述的活性剂。
本发明还提供了具有通过干燥如下组合物获得的组合物之特征的产 品，所述组合物包含含有自组装结构(例如胶束)形成化合物的自组装结 构(例如胶束)分散在其中的水凝胶，所述化合物任选选自具有亲水链和 疏水链的化合物，所述组合物还包含活性剂。
例如，从制备方面考虑，还有利的是包括含有表面活性剂的油在本 文所述的方法中。因此，所述方法中的表面活性剂相可额外包含油，并 且产品中的表面活性剂可与油缔合。
可使用任何适合药用的油或可用于食品用途(或用于其他所选应用) 的油作为油。按本发明组合物的干重计，油可占1％至85％的比例，例 如1％至50％，任选1％至30％、1％至20％、1％至10％或1％至 5％。油可占5％至30％、5％至20％或5％至10％，其可占20％至30％ 或35％至45％。术语“油”指在环境温度或接近环境温度(例如10℃至 40℃或15℃至35℃)下全部或部分为液态的任何物质，例如在多至25℃ 的温度下为液体，而无论在上述全部范围内是否为液体，所述物质是疏水 性的但是可溶解于至少一种有机溶剂中。油包括植物油(印度楝树油)、 石油化工油(petrochemical oil)和挥发性精油。
可包含的油可为提及的多不饱和脂肪酸，例如Ω-3油例如二十碳五 烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚油酸(ALA)、共轭亚 油酸(CLA)。优选使用例如纯度多至或高于98％的超纯EPA、DHA或 ALA或CLA。Ω油可来源于例如任何合适的植物，例如印加果。诸如 EPA或DHA或ALA或CLA的这些油可单独使用或以任意组合使用。 还包括这些组分以任意比例的组合(包括二元、三元等)，例如以商品名 Epax 6000市售的EPA和DHA比例为1∶5的二元混合物。
可包含的油包含或特别是基于天然甘油三酯的油，其包括橄榄油、 芝麻油、椰子油、棕榈坚果油。特别优选的油包括饱和的椰子油和棕榈 坚果油来源的辛脂肪酸和癸脂肪酸和甘油，例如以商品名MiglyolTM提 供，各种MiglyolTM是可得到的，本发明油相中的一种或更多种组分可选 自包括以下的MiglyolTM：MiglyolTM 810、812(辛酸/癸酸甘油三酯)、 MiglyolTM 818：(辛酸/癸酸/亚油酸甘油三酯)、MiglyolTM 829：(辛酸/ 癸酸/琥珀酸甘油三酯)、MiglyolTM 840：(丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯)。 注意到，MiglyolTM 810/812的不同之处仅在于C8/C10比例，由于MiglyolTM810的低C10含量，因此它具有较低的粘度和浊点。MiglyolTM类可商购自 Sasol Industry。如上文所述，可包含在油相中的油在室温下不必一定是 液体的或完全液体的。可包含在本发明油相中的替代或附加油为中链甘油 三酯，例如由Gattefosse制备之具体产品号为WL1349的LabrafacTMLipophile。
其他可能的(替代或附加)油包括亚油酰基聚乙二醇甘油酯(聚烃 氧基甘油酯)例如Labrafil(例如Gattefosse的产品号M2125CS)和辛 酰基己酰基聚乙二醇甘油酯例如Gattefosse的Labrasol。
在另一些实施方案中，用于制备组合物的表面活性剂相/混合物不含 或基本不含其他油。在这些实施方案中，含有(i)表面活性剂、(ii)活 性成分(例如选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生 物的微生物和任选的佐剂)的表面活性剂相/混合物不含或基本不含其他 油，例如表面活性剂相/混合物含有按重量计低于10％、5％、1％、0.5％、 0.1％或0.001％的油或不含其他油。然后，将表面活性剂相/混合物与本 文所述的含有水和水凝胶形成聚合物的水性组合物混合，从而形成水相中 的自组装结构分散体(可能是胶束分散体)。
可离心已与冷却液分离的珠子以除去过量的油，然后将其风干，例 如在环境温度(比如说15℃至30℃，例如10℃至25℃)下。离心通常在 风干之前发生。
如本说明书下文更详细描述的，根据本文所述制备的珠子可在其制 备之后包覆一层或更多层。
在另一方面，本发明提供了含有本发明的任选地包覆的珠子群的剂 型。所述珠子剂型包含本文所述的活性成分。该剂型适合药用。在某些实 施方案中，剂型可包含至少两个珠子群。
在某些实施方案中，剂型包含呈适于例如向人或动物施用的单位剂 型的本发明组合物(例如珠子或成形单元，特别是多个珠子或成形单元)。 该单位剂型选自胶囊剂、片剂、喷剂(sprinkle)、袋剂、栓剂、阴道栓 剂或其他合适的单位剂型。
在一个代表性实施方案中，如下形成本发明的剂型：将至少下列材 料混合物在一起以形成自组装结构(胶束)分散体：水、水凝胶形成聚合 物、表面活性剂和活性成分，并将分散体配置成含有珠子的剂型(适合药 用)，所述珠子包含干态分散体。
在一些实施方案中，可以以使一种或更多种活性成分释放在胃肠道 (GIT)内的一个或更多个指定位置的方式适当配制剂型。具体地，可将 剂型配制成在至少小肠上端释放微生物和任选佐剂，因此可对剂型进行肠 溶包衣。剂型可包含肠溶包衣珠子，例如剂型可为含有多个肠溶包衣珠子 的胶囊剂或其他形式。剂型可靶向其他部位的释放，例如回肠、结肠或两 者。
本发明的剂型特别用于经口施用。
本发明包括用于向对象施用选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒 微生物和经灭活微生物的微生物的方法，所述方法包括经口向对象施用 本文公开的组合物或剂型，所述组合物或剂型包含所述活性剂(例如(i) 选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物 和(ii)佐剂的组合)。
本发明还包括用于向对象施用含有选自活微生物、经杀灭微生物、 经减毒微生物和经灭活微生物的微生物的活性药物成分的方法，所述方 法包括施用含有珠子群的剂型。该珠子包含含有水凝胶形成组合物的基 质和包含在基质中的表面活性剂、任选的佐剂和选自活微生物、经杀灭微 生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物。该剂型用于经口施用。剂 型可适于在胃肠道内释放活性成分。
本发明还提供了具有通过干燥如下组合物获得的组合物之特征的产 品，所述组合物包含自组装结构(例如胶束)分散在其中的水凝胶，所述 组合物还包含选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生 物的微生物和任选佐剂以及该产品在制备口服剂型(例如明胶胶囊剂)中 的用途。
本发明还包括用于向对象施用选自活微生物、经杀灭微生物、经减 毒微生物和经灭活微生物之微生物的方法，所述方法包括经口向对象施用 含有活性剂的产品(如本文所述)，其中该产品为本文所述的组合物。
本发明还提供了本文公开的组合物或剂型，所述组合物或剂型含有 用作药物的活性剂(如本文所公开)(例如本文公开的活性剂的组合)。
本发明还提供了用于进行选自以下治疗的方法：
i、给对象接种疫苗
ii、诱导免疫治疗性应答例如以治疗选自癌症和自身免疫病的疾病(例 如控制自身免疫病)，所述自身免疫病选自全身和胃肠道自身免疫病
iii、施用活性实体以诱导或调解免疫或局部靶向淋巴系统中的转移或 微转移(micrometastatic)细胞，
所述方法包括施用本文公开的组合物或剂型，所述组合物或剂型包含具有 适当地实现所述治疗之活性的活性剂(如本文所公开)(例如本文公开的 活性剂的组合)。
本发明还提供了本文公开的组合物或剂型，所述组合物或剂型包含 用于制备用于预防或治疗本文所述的疾病或医学病症的药物的活性剂(如 本文所公开)(例如本文公开的活性剂的组合)，所述治疗例如选自
i、给对象接种疫苗
ii、诱导免疫治疗性应答例如以治疗选自癌症和自身免疫病的疾病(例 如控制自身免疫病)，所述自身免疫病选自全身和胃肠道自身免疫病
iii、施用活性实体以诱导或调解免疫或局部靶向淋巴系统中的转移或 微转移细胞。
在本发明的说明书和权利要求书通篇，词语“包括”和“包含”及 其变化形式指“包括但不限于”，这些用语无意于排除(不排除)其他部 分、附加物、组分、整体或步骤。在本发明的本说明书和权利要求书通篇， 除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。特别是除非上下文另有要求， 否则本发明书应理解为无数量词修饰的名词包括复数以及单数。
除非互相矛盾，否则结合本发明特定方面、实施方案或实例描述的 特征、整体、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的 其他方面、实施方案或实例。本说明书中公开的所有特征(包括任何所附 权利要求书、摘要和附图)和/或如此公开的任意方法或过程的所有步骤 可以任意组合形式组合，但是其中至少一些所述特征和/或步骤相互排斥 的组合形式除外。本发明不受限于任何上述实施方案的细节。本发明延伸 到本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中公开之特征的任 何一个新特征或任何新组合，或者延伸到如此公开之任何方法或过程的步 骤的任何一个新步骤或任何新组合。
读者应注意与本说明书同时或在其之前提交的与本申请相关的所有 文件和文献以及公开以供公众查阅本说明书的文件和文献，并且全部这些 文件和文献的内容均通过引用并入文本中。
附图说明
本文中的商标“SmPill”指本发明的组合物，更具体地，指实施例中 所述的本发明组合物。
图1与在溶液中或在无佐剂中递送抗原相比，用中的ETEC和α-GalCer免疫诱导显著更强的粘膜抗体滴度。在第0周， 连续两天用溶液中的ETEC单独或与α-GalCer或CT一起，或者用 中的ETEC单独或与α-GalCer一起免疫小鼠，随后在第2周和 第4周进行相同的加强免疫系列。在加强免疫前1天和最后免疫接种后 12天，收集粪粒，并通过ELISA确定抗原特异性IgA(a)和IgG(b) 抗体滴度。箭头表示加强免疫。＊＊＊，P＜0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC+α-GalCer溶液，+++，P＜0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC
图2经口施用中的ETEC与α-GalCer诱导粪粒中有效的抗 原特异性IgA应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。在最后免疫 接种后12天，收集粪粒，并通过ELISA评估抗原特异性IgA滴度和总 IgA抗体浓度。结果表示为CFA/I-特异性IgA终点滴度(a)或抗原特异 性IgA滴度/总IgA抗体浓度(b)。+++P＜0.001ETEC+α-GalCer 相对于ETEC溶液，＊＊＊P＜0.001ETEC+α-GalCer相 对于ETEC
图3经口免疫接种中的ETEC与α-GalCer诱导强烈的抗原 特异性全身抗体应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。通过ELISA 评估血清样品的抗原特异性IgA和IgG抗体应答，所述血清样品回收于 加强免疫接种前1天和最后免疫接种后12天。箭头表示加强免疫。＊＊， P＜0.01，＊＊＊，P＜0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC+ α-GalCer溶液，++，P＜0.01，+++，P＜0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC
图4经口施用中的ETEC与α-GalCer诱导有效的全身抗原 特异性IgA应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。在最后免疫接 种后12天收集血清样品，并通过ELISA评估血清样品的抗原特异性IgA 滴度(a)和总IgA抗体浓度(b)。
图5用中的ETEC和α-GalCer经口免疫小鼠诱导显著的全 身IgG1抗体应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。通过ELISA 评估血清的抗原特异性IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度，所述血清回收 于最后免疫接种后12天。结果表示为IgG1、IgG2a和IgG2b终点滴度。
图6用含有ETEC和佐剂α-GalCer的经口免疫小鼠诱导肠 局部IgG抗体应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。通过ELISA 确定小肠和大肠洗液的抗原特异性IgG抗体滴度，所述洗液回收于最后 一个免疫接种系列后2周。+P＜0.05，+++P＜0.001ETEC+α-GalCer 相对于ETEC溶液，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001ETEC+α-GalCer 相对于ETEC
图7用含有ETEC和佐剂α-GalCer的经口免疫小鼠诱导显 著的肠局部IgA抗体应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。通过 ELISA确定上清液的抗原特异性IgA抗体滴度和总Ig抗体浓度，所述上 清液通过对最后一个免疫接种系列后两周回收的小肠和大肠提取物两者 进行皂苷处理获得。结果表示为CFA/I-特异性IgA终点滴度((a)和(c)) 或抗原特异性IgA滴度/总IgA浓度((b)和(d))。+++P＜0.001ETEC +α-GalCer相对于ETEC溶液，＊＊＊P＜0.001ETEC+α-GalCer 相对于ETEC
图8用含有ETEC和佐剂α-GalCer的经口免疫小鼠诱导显 著的肠局部IgG抗体应答。按照图1的说明所述对小鼠进行免疫。通过 ELISA确定上清液的抗原特异性IgG抗体滴度，所述上清液通过对最后 的免疫接种系列后两周回收的小肠和大肠提取物两者进行皂苷处理获得。 +++P＜0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC溶液，＊＊＊P＜ 0.001ETEC+α-GalCer相对于ETEC
图9示出了WO2010/133609中所述珠子的X-射线断层摄影图像。
图10示出了参考研究(1)的结果。经口向小鼠施用中的霍 乱毒素B亚基(CTB)与以及不与α-GalCer和Kolliphor HS 15诱导全 身抗原特异性IgG应答。按照与图1的说明类似的方式对小鼠进行免疫。 在最后免疫接种后12天收集血清样品，并通过ELISA评估抗原特异性 IgG滴度(a)。
图11示出了参考研究(1)的结果。经口向小鼠施用中的霍 乱毒素B亚基(CTB)与以及不与α-GalCer和Kolliphor HS 15诱导全 身抗原特异性IgG应答。按照与图1的说明类似的方式对小鼠进行免疫。 在最后免疫接种后12天收集血清样品，并通过ELISA评估抗原特异性 IgA滴度(a)和总IgA抗体浓度(b)。
图12示出了参考研究(2)的结果。经口向小鼠施用中的霍 乱毒素B亚基(CTB)与以及不与α-GalCer和Kolliphor HS 15诱导肠 局部抗原特异性IgA和IgG应答。按照与图1的说明类似的方式对小鼠 进行免疫。
图13用以α-GalCer作为佐剂之JS1569霍乱弧菌的制剂经 口免疫小鼠诱导小鼠中发生强烈的粪粒抗体应答。按照霍乱弧菌实验1 所述免疫小鼠，并对粪粒进行分析。图13为经历(a)1轮、(b)2轮 和(c)3轮免疫接种后观察到的粪粒中的IgA滴度，(e)示出了经历3 轮免疫接种后通过ELISA测定的粪粒中的IgG滴度。图13中的结果表 示各组中所有小鼠的平均值和SD。
图14示出了说明在经历图13所述的各轮免疫接种之后IgA应答的 诱导动力学的时间进程。
图15与在溶液中递送相比，用以α-GalCer作为佐剂之JS1569霍乱 弧菌的制剂经口免疫小鼠诱导更强烈的组织特异性抗体应答。按 照霍乱弧菌实验1所述经口对小鼠接种疫苗。在经历最后一轮疫苗接种后 2周，对小鼠实施安乐死并进行灌注以从内部器官取血。图15示出了通 过ELISA测量之小肠洗液的Inaba特异性LPS IgA(a)和IgG(b)滴 度。结果表示各组中所有小鼠的平均值和SD。
图16：与在溶液中递送的相同制剂相比，用以α-GalCer作为佐剂之 JS1569霍乱弧菌的制剂经口免疫小鼠诱导更强烈血清抗体应答。 按照霍乱弧菌实验1所述经口对小鼠接种疫苗。在经历最后一轮疫苗接种 后2周，通过尾部取血获得血清。图16示出了通过ELISA测量的Inaba 特异性LPS IgA(a)、IgG(b)和IgGl(c)滴度。结果表示各组中所 有小鼠的平均值和SD。
图17较高剂量的含有α-GalCer的JS1569霍乱弧菌的诱导 小鼠的粪粒IgA应答。按照霍乱弧菌实验4所述经口对小鼠接种疫苗。 粪粒样品获于每轮疫苗接种前1天和最后疫苗接种后2周，并测量抗 Inaba-LPS IgA和IgG应答。图17示出了在经历1、2和3轮免疫接种后 观察到的多种IgA滴度，其通过ELISA测量。结果表示经历一系列稀释 的样品的OD492吸光度值。
图18接种较高剂量的以α-GalCer作为佐剂的霍乱弧菌 JS1569细菌诱导小鼠的组织特异性IgA应答。按照霍乱弧菌实验4所述 经口对小鼠接种疫苗。在经历最后一轮疫苗接种后2周，对小鼠实施安乐 死并进行灌注以从内部器官取血。切开小肠，并取出小部分上端部分，将 该部分放置在皂苷溶液中以提取内组织抗体。图18示出了经历3轮免疫 接种后观察到的通过ELISA测量的多种Inaba LPS特异性IgA滴度。结 果表示经历一系列稀释的样品的OD492吸光度值。
发明详述
术语“两亲性”与“两兼性”含义相同，指同时包含亲水性基团和 疏水性(亲油性)基团。
术语“与...缔合”指两种物质被混合或彼此有界面。例如在珠子或其 他干组合物中发生佐剂与表面活性剂缔合的情况下，该缔合可利用合适的 分析技术通过鉴定佐剂和活性成分的共定位来确定。(共定位指存在至少 两种物质同时所在的一个位置)。确定共定位的分析技术可包括TOFF、 拉曼光谱扫描成像(mapping Raman spectroscopy)和红外光谱。因此， 其中至少一部分佐剂与至少一部分表面活性剂缔合的组合物可以是含有 佐剂和表面活性剂共定位之位置的组合物，所述的佐剂(例如基本上所有 的佐剂)均可与表面活性剂共定位。
短语“可药用的”指分子实体和组合物被普遍认为是安全的。特别 地，用于实践本发明的可药用载剂是生理上可耐受的，并且在施用于患者 时一般不产生变态反应或类似不期望的反应(例如，胃不适、头晕等)。 优选地，本文所用的术语“可药用的”指已经适当的政府机构的管理机构 批准或已列入美国药典或用于动物(更特别地，人)的其他公认药典。
“可药用赋形剂”指用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全 无毒的，并且不是生物学上非期望的也不是在其他方面非期望的，其包括 可用于兽医用途以及以及人药用的赋形剂。本申请中使用的“可药用赋形 剂”包括一种及一种以上这样的赋形剂。
术语“释放”，特别是涉及自组装结构(例如胶束)时，指释放聚 合物基质中预先存在的自组装结构，并且指释放含有表面活性剂的这种自 组装结构，其在聚合物基质中时为非自组装结构形式，但是其可在摄取本 发明的组合物后，水与自组装结构相互接触时形成。换言之，从本发明组 合物中释放的自组装结构可在组合物中预先形成或作为释放过程的一部 分形成(全部或部分)。
术语“治疗”包括：(1)预防或延缓发生在动物中的状况、疾病或 病症的临床症状的出现，所述动物可能患有或易患所述状况、疾病或病症， 但还未经历或显示出所述状况、疾病或病症的临床或亚临床症状；(2) 抑制所述状况、疾病或症状(例如，阻止、减少或延缓所述疾病的发生， 或其至少一种临床或亚临床症状在维持治疗的情况下的复发)和/或(3) 缓解所述病症(即导致所述状况、疾病或病症或者其至少一种临床或亚临 床症状消退)。对待治疗患者的益处可以是统计学上显著的或者至少对患 者或医生而言是可感知的。术语“治疗性或预防性”涵盖相同的主题。
将本文中的“疫苗”限定为含有抗原性物质，特别是含有经改性的 活(活的减毒的)感染原或微生物或者经灭活感染原或微生物的组合物， 在大多数情况下，其可与佐剂一起向动物施用以产生免疫介导的效应例如 主动免疫、耐受诱导、耐受中断、改变自身免疫病的进程等。本发明的组 合物可以是疫苗组合物。除非上下文另有要求，否则术语“疫苗组合物” 包括免疫调节，其不一定是免疫接种例如耐受性或其他免疫治疗。
术语“对象”包括鸟、人和其他哺乳动物以及鱼，例如驯养动物(例 如狗和猫)。术语“对象”特别地指人。
“有效量”指足以导致期望的治疗性或预防性应答的量。所述治疗 性或预防性应答可以是被使用者(例如临床医生)认可为对治疗的有效应 答的任何应答。本领域的普通技术人员还可根据对治疗性或预防性应答的 评价来确定合适的治疗持续时间、合适的剂量以及任何潜在的组合治疗。
应用于本公开内容组合物时，术语“干”或“干燥的”可指含有按 重量计少于5％自由水，例如按重量计少于1％自由水的组合物。但是， 应用于本公开内容组合物时，“干”或“干燥的”主要指将初始固化组合 物中存在的水凝胶干燥至足以形成刚性组合物。
如前文所述，本发明尤其提供了一种组合物，其包含：(i)水凝胶 形成聚合物、(ii)表面活性剂和(iii)选自活微生物、经杀灭微生物、 经减毒微生物和经灭活微生物的微生物，该组合物还包含选自以下的特 性：(i)至少一部分表面活性剂是分散在聚合物中的自组装结构形式(例 如胶束)和(ii)该组合物与水组合时能够释放自组装结构(例如胶束)。 该组合物还可包含佐剂。所述水可以是例如胃液、肠液或结肠液形式或它 们之一的模拟形式。本发明还提供了包含以下组分的组合物、所述组合物 的干燥和经干燥的组合物：(i)自组装结构(例如胶束)分散在其中的 水凝胶，所述自组装结构含有自组装结构形成物(former)(例如胶束形 成物)，例如选自含有亲水链和疏水链的表面活性剂的化合物，和(ii) 选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生物。 所述组合物还可包含佐剂。
现在将通过参考本发明组合物可包含的多种组分对本发明进行详细 描述。依据一些赋形剂可具有活性以及一些活性成分可具有赋形剂特性， 有时可使用术语“赋形剂”来描述除活性成分之外的所有或部分组分。
如果未作另外声明，那么本发明组合物中的成分、组分、赋形剂等 适用于本文其他部分所讨论的一个或更多个预期目的，例如是化妆品上可 接受的、环境可接受的、可药用的、作为食品添加剂可接受的等。
为了避免疑问，在此声明本说明书中较早公开之位于标题“背景技 术”下的信息与本发明相关，应被视为本发明公开内容的一部分。
活性成分
本发明的组合物包含微生物作为活性成分。在本发明中，所述微生 物选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物。所述组 合物还可包含佐剂作为活性成分。优选的是，本发明包括含有作为活性成 分的选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的微生 物和佐剂的珠子。
所述微生物可以是单细胞微生物，例如所述单细胞微生物可选自细 菌、单细胞真菌和原生动物。所述微生物可以是肠道病原体。所述微生物 可以是诸如鸟或哺乳动物(例如人)之肠道病原体的病原体。所述微生物 可以是人肠道病原体。所述微生物可以是表达定居因子抗原I(CAF/I) 的细菌，可以是表达CAF/I的人病原体。所述微生物可包括微生物(例 如本段早前所述的微生物)的组合，例如表达CAF/I的微生物的组合。
所述微生物可以是通过技术人员已知的任意方法杀灭的、减毒的或 灭活的微生物，所述方法包括例如放射性，例如非电离辐射、电离辐射、 γ辐射或红外辐射；超声波振动；热灭活，例如湿加热或干加热；化学灭 活，例如使用福尔马林、醇、苯酚、环氧乙烷、丙内酯、乙撑亚胺或二氧 化碳；使用抗生素；物理化学方法，例如蒸汽甲醛；通过诸如组织培养物、 含胚卵或活动物的外源宿主减毒，或其组合。应当理解，在杀灭、减毒或 灭活过程期间，或者实际上在制备过程期间，可将活微生物、经杀灭微生 物、经减毒微生物和经灭活微生物部分片断化。因此，技术人员应当理解， 可使用术语活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物来指 代未片断化的(完整的)和片断化的微生物单位的混合物，所述微生物可 以是完整的，但是应当理解的是，出于实际目的，完整微生物群中可包括 小部分片断化的微生物，术语“完整微生物”应相应地给以解释。
所述微生物可以是被福尔马林杀灭的微生物。可预期，经福尔马林 杀灭的微生物可以是全部、部分或显著片断化的微生物，因此术语“杀灭 的微生物”在其范围内包括完整的死微生物和片断化的死微生物及其组 合。
应当理解，术语“片断化微生物”指通过片断化完整微生物可获得 的产品(其具有可获得之产品的特征)，因此其区别于纯化的或分离的微 生物亚单位或片段，并且不包括所述亚单位或片段，因为它们不包含(基 本上)完整微生物的剩余部分。
将疏水性活性成分限定为可部分或完全溶解于非水性介质但不溶解 于水性介质的化合物。疏水性活性成分可部分或完全溶解于非水性环境。
两亲性活性成分可通过化合物中存在亲水区和疏水区两者确定。因 此，该活性成分可部分或完全溶解于水性介质和非水性介质两者。
在某些实施方案中，所述组合物可包含亲水性活性成分。在一些实 施方案中，所述组合物可包含另一种活性成分，所述另一种活性成分为亲 水性活性成分。亲水性活性成分部分可部分或完全溶解于水性介质但不溶 解于非水性介质。
因此，本发明的组合物包含含有选自活微生物、经杀灭微生物、经 减毒微生物和经灭活微生物的微生物的一种或更多种抗原。此外，所述组 合物可包含佐剂，不论是单一佐剂还是其组合，例如可使用诸如α-GalCer 或其类似物的糖脂佐剂作为佐剂。将本文中的“抗原”限定为指这样的物 质或化合物，当被引入到非人动物或人中时，其可导致形成针对抗原的抗 体和/或细胞介导的免疫，本公开内容组合物中的抗原组分包含微生物或 由微生物组成，例如选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭 活微生物的单一微生物或所述微生物的组合。如本文其他部分所述，所述 微生物选自完整微生物和片断化微生物及其组合。
抗原可从市场上获得或者可由本领域的技术人员制备。包含在疫苗 中的一种或更多种抗原性部分包含例如经改造的活微生物或杀灭的微生 物(例如通过化学方法或热杀灭的微生物)。
可根据本发明使用的代表性抗原包括，但不限于，选自病毒、细菌、 真菌、寄生物或其他感染原(例如朊病毒)的天然、重组或合成产品。抗 原可以是例如选自下列感染原的感染原：溶组织内阿米巴(Entamoeba  histolytica)；芽孢杆菌属(Bacillus)，包括蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组；人芽囊原虫(Blastocystis hominis)； 牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)和克-雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)典型和非典型株系；弯曲杆菌属 (Campylobacter)，包括空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；弧菌 (Vibrio)，包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；肉毒梭菌(Clostridium  botulinum)；艰难梭菌(Clostridium difficile)；产气荚膜梭菌(Clostridium  perfringen)；隐孢子虫属(Cryptosporidium)；环孢子虫(Cyclospora  cayetanensis)；大肠杆菌；肠出血性大肠杆菌(EnteroHemorrhagic  Escherichia Coli，EHEC)；肠产毒性大肠杆菌(ETEC)；幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)；单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria  monocytogenes)；旋毛形线虫(Trichinella spiralis)；隐孢子虫属 (Cryptosporidium)，包括微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)和 小球隐孢子虫(Cyclospora cayetanensis)；肠道病毒(Enteroviruse)； 大肠杆菌，包括产vero细胞毒素(VTEC)菌株以及其他种类；贾第虫 属(Giardia)，包括十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)、兰伯贾第 虫(Giardia lamblia)、肠贾第虫(Giardia intestinalis)；甲型肝炎病毒 (Hepatitis A virus)；单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)； 海洋生物毒素(Marine biotoxin)；诺瓦克病毒类(Noroviruse)(诺瓦 克样病毒(Norwalk-like viruse，NLV)；小圆型病毒(SRSV))；轮状 病毒(Rotavirus)；腺病毒(Adenovirus)；沙波病毒(Sapovirus)；星 状病毒(Astrovirus)；脊髓灰质炎病毒(Polio virus)；沙门氏菌属 (Salmonella)，包括肠血清型肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar  Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和副伤寒沙门 氏菌(Salmonella paratyphi)；志贺氏菌属(Shigella)，包括宋内志贺 菌(Shigella sonnei)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌 (Shigella dysenteriae)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；金黄色葡 萄球菌(Staphylococcus aureu)；蠕虫(Worm)；寄生虫；耶尔森氏菌 属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和 假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)；或其组合。
真菌抗原可以例如是白色念珠菌(Candida albican)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、新型隐球菌 (Cryptococcus neoformans)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、 Coccidioides posadasii、诡谲腐霉(Pythium insidiosum)或其组合。
所述组合物可包含真菌和细菌的组合和/或两种或更多种相同或不同 细菌种类的菌株的组合。本发明旨在包括例如表达或过表达抗原性蛋白质 的天然菌株以及重组或合成微生物菌株。
在一些优选实施方案中，所述组合物包含ETEC作为活性成分。需 要重申的是，所述组合物可包含诸如糖脂佐剂(例如，α-GalCer或其类 似物)的佐剂。
还需提及的是，本发明的组合物包含幽门螺旋杆菌作为活性成分。 需要重申的是，所述组合物可包含诸如糖脂佐剂(例如，α-GalCer或其 类似物)的佐剂。
本发明的另一组合物包含霍乱弧菌(包括Ogawa和Inaba血清型的 O1霍乱弧菌珠系以及含有Ogawa和Inaba血清型两者之抗原的细胞，例 如WO2011/034495中所述的细胞)作为活性成分。特定的霍乱弧菌菌珠 为霍乱弧菌JS1569，其为菌株CVD103的利福平抗性衍生菌株：J.B. Kaper，H.Lockman，M.M.Baldini，M.M.Levine，Biotechnology，2(1984)， 第345-349页，还可为被改造成过表达Inaba LPS多肽的霍乱弧菌 JS1569菌株。所述组合物可包含诸如糖脂佐剂(例如，α-GalCer或其类 似物)的佐剂。
因此，本发明在其范围内包括包含下列组分的组合物：含有水凝胶 形成聚合物的基质以及包含在基质中的(i)选自肠产毒性大肠杆菌 (ETEC)、幽门螺旋杆菌和霍乱弧菌的活细菌、经杀灭细菌、经减毒细 菌或经灭活细菌、(ii)表面活性剂和(iii)佐剂。例如，在一个实施方 案中，所述活细菌、经杀灭细菌、经减毒细菌或经灭活细菌选自肠产毒性 大肠杆菌(ETEC)和幽门螺旋杆菌。
因此，本发明在其范围内另外包括包含下列组分的组合物：
●表面活性剂
●选自肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、幽门螺旋杆菌和霍乱弧菌，例如选 自肠产毒性大肠杆菌(ETEC)和幽门螺旋杆菌的活细菌、经杀灭细菌、 经减毒细菌或经灭活细菌
●佐剂，和
●表面活性剂、微生物和佐剂包含在其中的水凝胶形成聚合物；
其中所述组合物在与水组合时能够释放含有表面活性剂和佐剂的自组装 结构。
读者应当理解的是，本说明书的全部公开内容适用于前两段中所述 的组合物。因此，前两段中任一段所述的组合物可包含本文其他部分所述 的任何一个或更多个特征作为本发明的任选(或优选)特征，在所述组合 物中，细菌为ETEC。因此，前两段中任一段所述之其中细菌为幽门螺旋 杆菌的组合物可包含本文其他部分所述的任何一个或更多个特征作为本 发明的任选(或优选)特征。类似地，前两段中任一段所述之其中细菌为 霍乱弧菌的组合物可包含本文其他部分所述的任何一个或更多个特征作 为本发明的任选(或优选)特征。
本发明包括其中的组合物含有佐剂活性成分的实施方案，所述佐剂 选自：免疫刺激剂、T细胞激活剂、巨噬细胞激活剂、皂苷、皂苷级分、 合成的皂苷成分、ISCOMS、胞壁酰二肽及类似物、复合多元醇、海藻糖 双霉菌酸酯、含胺化合物、细胞因子、脂多糖衍生物和阳离子转染剂(例 如DOTAP)。佐剂可选自例如神经酰胺(例如α-半乳糖基神经酰胺， 也称为α-GalCer)、壳聚糖、诸如rCTB(重组霍乱毒素B亚基)的霍 乱毒素、诸如mLT的大肠杆菌热不稳定肠毒素、诸如寡聚脱氧核苷酸(例 如CpG，胞嘧啶磷酸鸟嘌呤)的寡核苷酸和无论是否衍生化的ODN1a(脱 氧次黄嘌呤核苷/脱氧胞嘧啶)、诸如MPLA的单磷脂(MPL)、BCG、 包括衍生自皂皮树(Quillaja肥皂草)的这些的皂苷(例如QS21和QuilA)、 聚I：C(聚肌苷酸：聚肌胞苷酸或聚肌苷酸-聚胞苷酸钠盐)等、多种油 例如诸如角鲨烯(lUPAC名称(6E，10E，14E，18E)-2，6，10，15，19，23-六甲 基四葡胺-2，6，10，14，18，22-六烯油))的胆固醇相关的或胆固醇来源的油。 还可包括上述所有物质的衍生物，不管衍生物是否在特定上下文中有所提 及。本文中确定为佐剂的物质在本发明中可具有或起其他作用或者可同时 起一种以上作用。例如，在某些实施方案中，rCTB还可起抗原作用。
作为佐剂还可提及海生衍生物、海绵皂(sponge)等以其衍生物。一 般情况下，可包括toll样受体配体作为佐剂，并且包括细菌和病毒通常释 放的LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛、双链RNA、未甲基化的CpG岛以及 DNA和RNA的多种其他形式。在一个实施方案中，优选TLR3和TLR9 配体。与抗原呈递细胞上的CD1d蛋白结合的物质特别包括槲寄生提取 物，特别是脱毒的槲寄生提取物。包括的其他佐剂包括Wagner等在PLoS ONE，2009年4月，第4卷，第4期中所述的Nod样受体(NLR)配体， 其全部内容均通过引用并入文本。还包括胞壁酰二肽，如Li等在DNA and Cell Biology，第27卷，N°8，2008中所述的KLKL5KLK，其全部内 容均通过引用并入文本。还包括Schellack等在Vaccine 24(2006) 5461-5472中所述的KIKL5KLK与ODN1a的组合，其全部内容均通过 引用并入文本。
可包括在本发明中的其他佐剂包括：非晶形羟基磷酸铝硫酸盐、氢 氧化铝、磷酸铝、硫酸钾铝及其他铝化合物、Al水凝胶、阳离子脂质体 -DNA复合物JVRS-100ISCOMTM、磷酸钙、弗氏完全佐剂(Freund′s  Complete Adjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freund′s Incomplete Adjuvant)、 CpG DNA、霍乱毒素B亚基、脂质体、二甲基双十八烷基溴化铵、大肠 杆菌无毒B亚基、IL-12、IL-15、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细 胞介素-7、大肠杆菌热不稳定毒素LTK63、LTK72、TiterMax Gold、Ribi 佐剂系统(RAS)、Montanide ISA 720、Montanide不完全Seppic、棒 状杆菌属(Corynebacterium)来源的P40、MPLTM、明矾和脂多糖(LPS) 衍生的单磷酰基脂质A(Monophosphoryl Lipid A，MPL)组合(AS04)、 含有MPL和皂苷级分QS21的MF59水包油乳剂(AS02)、AS03、细 菌脂多糖(LPS)、胞壁酰二肽(MDP)CRL1005共聚物、经杀灭的短 小棒状杆菌(Corynebaeterilm parvum)、Montanide ISA 51、百日咳博 德特氏菌(Bordetella pertussis)、阳离子脂质体、金刚烷基酰胺二肽 (AdDP)、阿拉塞A(Arlacel A)、VSA-3、POLYGENTM、AdjnmerTM、 藻类葡聚糖(Algal Glucan)、N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-β-D-呋喃葡萄 糖基)-N-十八烷基十二烷基酰胺醋酸盐、N-乙酰基葡糖氨基-N-乙酰基胞 壁酰基(acetylinuramyl)-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰基丙基酰胺 (DTP-DPP)、硬脂酰酪氨酸、Specol、线性(未支化)β-D-(2-1)聚呋喃 果糖基-α-D-葡萄糖和Al水凝胶(Algammulin)、N，N-二(十八烷基)N′，N′- 双(2-羟基乙基)丙二胺、磷酸钙凝胶(Calcium Phosphate Gel)、CTA1-DD 基因融合蛋白、DOC/Al(OH)3/矿物质载体复合物、γ-菊糖(Inulin)、 Gerbu佐剂(Gerbu Adjuvant)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、N-乙 酰基葡糖氨基-(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、重组 hIFN-γ/干扰素-g、Sclavo肽、Rehydragel LV、Rehydragel HPA、洛索立 宾(Loxoribine)、MF59、MTP-PE脂质体、乙酸异丁酯(murametide)、 胞壁软脂酸(murapalmitine)、D-胞壁软脂酸、神经氨酸酶-半乳糖氧化 酶、非离子型表面活性剂囊(NISV)、聚甲基丙烯酸甲酯、蛋白质螺旋 物、StimulonTM QS-21、SPT(抗原制剂)、Quil-A、2-[(R)-3-十四烷酰 氧基十四烷酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基 十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]-β-D-吡喃葡萄糖化 三乙基铵盐(RC529)、LTR192G大肠杆菌热不稳定毒素、1-(2-甲基丙 基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(Imiquimod)、Resiquimod、AF03、鞭 毛蛋白、Abisco-100、白蛋白-肝素微颗粒、B7-2(CD86)、 脱氢表雄酮、含有针对共刺激分子的抗体的免疫脂质体、SAF-1、Sendai 脂蛋白体、苏氨酰胞壁酰二肽(TMDP)、Ty-VLP、布比卡因 (Bupivacaine)、聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、单磷酰基脂质A(MPL) +角鲨烯、霍乱毒素mCT-E112K的无毒突变体E112K、Matrix-S。
优选的佐剂包括神经酰胺和特异性刺激自然杀伤T(NKT)细胞的 其他脂质分子(特别是非离子脂质分子)。神经酰胺由鞘磷醇和脂肪酸构 成，其以高浓度见于细胞的细胞膜内，神经酰胺是构成鞘磷脂的脂质组分 之一，而鞘磷脂为脂双层中的一种重要脂质。神经酰胺可起信号传导分子 作用，例如调控细胞的分化、增殖、程序性细胞死亡(PCD)和凋亡(I 型PCD)。优选的神经酰胺包括α-半乳糖神经酰胺，包括agelasphin和 衍生物。特别优选的α-半乳糖神经酰胺是可从日本的Funakoshi商购之 称为KRN7000的产品，其最初由日本的Kirin Pharmaceuticals合成。还 包括KRN7000的衍生物作为本发明组合物的组分，所述衍生物在WO  2004/028475和Dere等(2008)，Organic Letters，第10卷，n°20，第 4641-4644页中进行了详细描述，两篇文献的全部内容均通过引用并入文 本。特别优选Dere等所述之α-半乳糖基神经酰胺的硫醇化衍生物(其中 糖苷氧原子被硫原子取代)，同样特别优选其外消旋体、对映异构体或非 对映异构体以及紧密相关的衍生物。
可用作本发明佐剂之含神经酰胺衍生物的α-GalCer类似物包括：含 1，2，3三唑的α-GalCer类似物；3-氧-磺基-α-GalCer；4’-氧-磺基-α-GalCer； 6’-氧-磺基-α-GalCer；4-脱氧和3，4-二脱氧α-GalCer类似物；含芳香环 α-GalCer类似物；α-GalCer的C-糖苷类似物；α-GalCer的二糖类似物 包括Galα1-6Galα1-1’Cer、Galα1-2Galα1-1’Cer、Galαl-4Glcβ1-1’Cer、 Galα1-6Glcα1-1’Cer、β1-3Galβ1-1’Cer；半乳糖苷丝氨酸型神经酰胺； GalA-GSL；Galα1-2GalCer、Galα1-3GalCer、Galα1-6GalCer糖脂； α-GalCer的糖苷类似物；α-半乳糖神经酰胺的聚乙氧基化衍生物 (αGCPEG)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)糖鞘脂、α-异头物GalCer； α-GalCer的C-葡糖苷类似物包括α-C-GalCer；α甘露糖基神经酰胺；α 半乳糖苷1，2-二酰基sn-甘油醇；α-半乳糖神经酰胺类似物8；α-半乳糖 醛酸基神经酰胺(Gal A-GSL)；脂肪酰链中具有一个或更多个双键的 α-GalCer类似物包括C20：1顺式/反式C20：2α-GalCer类似物；具有6- 苯基乙酰基(C6Ph)、8-苯基辛酰基(C8Ph)或11-苯基十一酰基(C11Ph) 作为脂肪酰链的α-GalCer类似物；α-葡糖基神经酰胺(α-GlcCer)；α- 葡糖醛酰基神经酰胺；α-连接甘露糖基神经酰胺α-ManCer)；β-异头物 GalCer；β-GalCer；β-GlcCer；神经酰胺二己糖基硫酸盐；神经酰胺三 己糖基硫酸盐；神经酰胺四己糖基硫酸盐；异球三己糖基神经酰胺；OCH (具有截短的鞘氨醇尾的α-GalCer类似物)或PBS-25(具有八碳基酰基 链的α-GalCer类似物)。
可用于本发明的脂质佐剂的另一些实例包括Borelia糖脂；糖鞘脂 (GSL)；磷脂包括双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰 甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、溶血PC、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血 磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰肌醇；CD1脂质包括同种型CD1a、CD1b、 CD1C、CD1d。
在本发明的一个实施方案中，佐剂不是α-GalCer。
在一个实施方案中，本发明组合物中包含一种以上的可有助于刺激 黏膜免疫应答的佐剂。
在一些实施方案中，佐剂在组合物中以0.01％至1％，例如0.05％ 至0.5％或0.1％至0.3％存在，其中％为以组合物干重计的重量。
在一些优选实施方案中，活性成分为微生物，第二活性成分为佐剂。 优选地，佐剂为免疫刺激剂，例如T细胞激活剂和/或抗原呈递细胞激活 剂。佐剂的一个代表性实例为α-GalCer。
在某些实施方案中，佐剂：微生物的重量比为1∶1至1∶10，任选1∶3 至1∶5，例如1∶1.35至1∶1.45。所述微生物可由一种或更多种单细胞微生 物组成。在该实施方案中，佐剂与单细胞微生物总量的比例(佐剂的干重 mg：10^10细胞)可以为0.1至100mg：10^10细胞，例如0.1至10mg：10 ^10细胞，例如0.25至5mg：10^10细胞，特别是0.4至5mg：10^10细胞
在某些实施方案中，所述微生物由一种或更多种单细胞微生物组成， 表面活性剂与单细胞微生物总量的比例(佐剂的干重mg：10^10细胞) 可以为10至200mg：10^10细胞，任选25至125mg：10^10细胞，例如 25至150mg：10^10细胞、25至100mg：10^10细胞、50至200mg：10^ 10细胞、50至100mg：10^10细胞或60至90mg：10^10细胞。
在组合物中的任何组分(例如，微生物、佐剂等)对温度敏感的实 施方案中，应当理解的是，可使用适应温度不稳定性组分的制备方法(如 下文所述)。
可利用本发明的组合物来直接或在吸收后使抗原与消化道相关的淋 巴组织(GALT)接触。在一个实施方案中，本发明的组合物意图使抗原 和/或佐剂与GALT内的T细胞相互作用，或促进其与所述T细胞相互作 用。在一个实施方案中，该相互作用发生的胃肠道部分为直肠和/或结肠。 在另一实施方案中，所述部分为空肠或几乎无免疫诱导位点的其他部位。 可将本发明的组合物配制成在其穿过胃之后特别是在上端小肠释放微生 物和佐剂，因此，可对所述组合物进行肠溶包衣。
本发明提供了在存在或不存在本文其他部分所述的佐剂和任选其他 成分的情况下被配制成含有必需抗原性肽(包括任何共价或非共价经修饰 肽)的组合物和/或制剂。所述其他成分(例如渗透性增强剂)随着本发 明组合物任选地被单个或多个(例如)聚合物层包封(例如，包衣)，经 改性的层或聚合物包衣允许活性组分在沿肠或结肠/直肠的最适当位置释 放。
因此，本发明包括诱导哺乳动物(例如人)的免疫应答的方法，其 包括：向哺乳动物施用本公开内容的组合物，所述组合物被配制成在胃肠 道内释放选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的 微生物；和/或向哺乳动物施用还含有佐剂的本公开内容组合物。
当用于诱导免疫应答、例如作为疫苗或免疫治疗剂时，所述微生物 和疫苗的剂量自然需要根据使用的具体微生物和组合物的使用性质而变 化。适当地，所述组合物提供的剂量为108至1014个细胞。所需剂量的大 小可由技术人员采用公知方法来确定。所述剂量可作为单次推注剂量或作 为分次剂量施用。如果期望的话，可重复剂量以提供期望的免疫应答。例 如可在初次剂量后短于一周重复施用本发明的组合物。或者可在至少一周 的时间后重复施用。任选地，可给予另外的剂量，但是各次施用相互隔开， 例如各次施用相隔至少一周。当施用重复剂量时，每次剂量可与初次剂量 相同或不同。
用于在结肠或直肠内释放的配制(adaptation)可以例如通过以下方 式提及：
●将组合物配制成栓剂
●配制用于经口施用且含有控释剂的组合物。
作为控释剂的实例，所述组合物可包含在结肠内被细菌酶降解的聚 合物或在组合物到达结肠前以其他方式起屏障作用的聚合物((例如，溶 于结肠环境或在结肠环境中被降解的聚合物)。可使用在经过胃肠道期间 经历降解或腐蚀的延缓聚合物(retardant polymer)和/或在结肠环境中 溶解或降解的含有成孔剂的pH依赖性聚合物。所述组合物可包含肠溶聚 合物以防止其在胃内被降解，使得所述组合物仅在进入肠道内时暴露于进 一步的溶解、腐蚀或降解。本段中提及的聚合物可包含在基质中和/或可 形成或包含在一层或更多层包衣中。
如本文其他部分所讨论的，可使用pH依赖性包衣聚合物，例如乙基 纤维素。因此，向易被细菌酶而非消化酶(例如人消化酶)降解的第二聚 合物(例如多糖，特别是杂多糖)添加乙基纤维素(例如，SureleaseTM) 或其他pH依赖性包衣有助于确保包衣的屏障功能，所述包衣被末端回肠 和/或结肠内的所述酶的作用破坏，从而确保活性成分在回肠和/或结肠内 释放。pH依赖性包衣中包含这样的细菌酶可降解的聚合物(例如乙基纤 维素)在调节聚合物在本发明珠子中的添加量从而获得最佳溶解特性方面 提供了灵活性。因此，一般情况下，本公开内容包括本文所述之含有包衣 的制剂，所述包衣包含诸如可腐蚀聚合物(例如乙基纤维素)的延迟释放 物质和对结肠内细菌酶的降解敏感的聚合物(例如多糖，特别是水溶性多 糖，特别是果胶)的组合。但是，即便在靶向结肠释放的情况下，将乙基 纤维素或其他pH依赖性包衣聚合物与对细菌酶降解敏感的聚合物组合 也不是强制性的。
营养物质
本发明的组合物还可包含增强免疫的营养物质，例如，选自以下的 一种或更多种营养物质：维生素A、B(例如，维生素B6、维生素B12、 烟酸(维生素B3)、泛酸、核黄素(维生素B2)、硫胺(维生素B1) 和叶酸之一或组合)、维生素C、维生素E、类胡萝卜素例如β-胡萝卜素、 铁、锰、硒或锌。所述组合物可在基质(包含在水凝胶形成聚合物中)中 包含营养物质，例如营养物质组合；所述组合物可包含与表面活性剂缔合 的营养物质，例如营养物质组合，所述组合物可在包衣中包含营养物质， 例如营养物质的组合；所述组合物可在上述两个或三个位置中的任何一个 包含营养物质(例如营养物质组合)。水溶性营养物质可适合包含在基质 中(干水相)，表面活性剂可溶性营养物质可适合与表面活性剂缔合，例 如包含在所述表面活性剂中，但是本发明并不限于这些可能性。
聚合物基质
本公开内容包括含有表面活性剂相和提供机械强度的连续相或基质 相的制剂。所述连续相或基质相包含水凝胶形成聚合物。因此，这些制剂 包含聚合物基质。
水凝胶形成聚合物是能够形成水凝胶的聚合物。可将静止时不流动 的水凝胶描述为固体或半固体材料，其包含遍及水性液体介质体积的亲水 性聚合物链的网(基质)。
组合物可包含选自以下的水凝胶形成聚合物：明胶、琼脂、琼脂糖、 果胶、角叉菜胶、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、黄原胶、阿拉伯树胶、果阿 胶、刺槐豆胶、聚氨基甲酸酯、聚醚聚氨酯、纤维素、纤维素酯、醋酸纤 维素酯、三醋酸纤维素、交叉键合的聚乙烯醇、丙烯酸聚合物和共聚物、 丙烯酸羟烷基酯、丙烯酸羟基乙酯、二乙二醇单丙烯酸酯、2-羟丙基丙烯 酸酯、3-羟丙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸的聚合物和共聚物、甲基丙酸羟乙 酯、二乙二醇单甲基丙烯酸酯、2-羟丙基甲基丙烯酸酯、3-羟丙基甲基丙 烯酸酯、二丙二醇单甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺聚合物和 共聚物、N-甲基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺聚合物和共 聚物、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-2-羟乙基甲基丙烯酰胺和乙烯基吡咯烷 酮及其组合。在一些具体实施方案中，上述任何物质的二元或三元等组合 是预知的。
还可将水凝胶形成聚合物称为水胶体，即其中胶体颗粒分散在水中 的胶体体系，可获得的水量允许凝胶的形成。在一些实施方案中，优选使 用与不可逆(单一状态)水胶体相反的可逆水胶体，优选热可逆性水胶体 (例如琼脂、琼脂糖、明胶等)。热可逆性水胶体可以凝胶和溶胶状态存 在，并且在添加或去除加热的情况下可在状态间交替变化。特别优选的热 可逆性、可复水胶体为明胶、琼脂和琼脂糖。还包括明胶衍生物，例如琥 珀酸化或邻苯二甲酸化明胶。可根据本发明使用的热可逆性水胶体包括来 源于天然来源的这些水胶体，例如角叉菜胶(提取自海藻)、明胶(提取 自牛、猪、鱼或植物来源)、琼脂(来自海藻)、琼脂糖(获自琼脂的多 糖)和壳聚糖(提取自柑橘皮、苹果或其他水果)。对于某些应用，可优选 基于非动物的水胶体，所述应用例如向出于宗教或健康原因不期望摄取动 物产品的素食者或个体施用。关于角叉菜胶的用途，请参考美国专利申请 2006/0029660A1(Fonkwe等)，其通过引用整体并入本文。水凝胶形成 聚合物可包含或是明胶与一种或更多种其他热可逆性水胶体(例如与一种 或更多种其他刚列举的热可逆性水胶体)的组合。水凝胶形成聚合物可包 含或是明胶与琼脂的组合，任选地，所述组合可包含至少另外一种热可逆 性水胶体，例如刚列举的一种热可逆性水胶体。
与其他水凝胶形成聚合物相比，热可逆性胶体存在益处。通过例如 在液体冷却浴中或通过空气流动冷却胶体来凝胶化或硬化热可逆性胶体。 通过化学方法驱动其他水凝胶形成聚合物凝胶化可导致组合物内容物泄 漏到凝胶化介质中，因为硬化过程的发生可需要一些时间。组合物内容物 的泄漏可导致组合物中具有不精确量的活性成分。热可逆性胶体还可被称 为热可逆性凝胶，因此，优选水凝胶形成物为热可逆性胶凝剂。
可应用于有利水凝胶形成聚合物的另一术语为“热致性”：热致性 胶凝剂(读者可推论，其优选为本发明中使用的水凝胶形成物)是一种通 过改变温度导致胶凝的胶凝剂，与胶凝作用由化学方法诱导的胶凝剂(例 如胶凝作用由离子诱导的离子型胶凝剂，例如壳聚糖)相比，所述胶凝剂 能够更快地胶凝。因此，在本发明的一些实施方案中，水凝胶形成物为热 致性凝胶形成聚合物或此类组合物的组合。
组合物的制备可要求水凝胶形成聚合物作为溶液(优选水性溶液) 存在。在制备期间，水凝胶形成聚合物占水相的按重量计5％至50％、优 选10％至30％、更优选15％至20％。
在一些实施方案中，组合物包含基于组合物干重的按重量计至少 25％、适当地至少40％的水凝胶形成聚合物。例如，水凝胶形成聚合物 以组合物的25％至70％、例如40％至70％、适当地45％至60％存在， 其中％为按组合物干重计的重量。
在一些实施方案中，所述水凝胶形成聚合物是可药用聚合物。
在某些实施方案中，水凝胶形成聚合物为明胶。在某些实施方案中， 水凝胶形成聚合物包含明胶。在某些实施方案中，明胶占组合物的至少 40％，例如40％至70％，适当地45％至60％，其中％为按组合物的干 重计的重量。
水凝胶形成聚合物可任选包含诸如山梨糖醇或甘油的增塑剂或其组 合。特别地，可将一种或更多种增塑剂与明胶组合。
在本发明的聚合物基质为明胶的实施方案中，此处参考“Bloom强 度”，其为O.T.Bloom于1925年开发的凝胶或明胶的强度量度。该测 试探针(通常具有0.5英寸的直径)使凝胶的表面偏转4mm而不破裂所 需的重量(g)。结果表示为Bloom(评分)，其通常为30Bloom至300 Bloom。在进行测试前，将6.67％凝胶溶液在10℃保持17至18小时以对 明胶进行Bloom测试。
当水凝胶形成聚合物包含明胶或是明胶时，明胶的凝胶强度为125 Bloom至300Bloom、200Bloom至300Bloom，优选250Bloom至300 Bloom。应当理解，较高bloom强度明胶可被更高浓度的较低bloom强 度明胶取代。
根据本发明，在水溶性聚合物基质材料包含明胶或是明胶的实施方 案中，明胶可通过多种方式获得。例如，明胶可通过部分水解胶原材料(例 如动物的皮、白色结缔组织或骨头)获得。A型明胶主要来源于经历酸加 工的猪皮，其等电点为pH 7至pH 9，而B型明胶来源于经历碱加工的 骨头和动物(牛)皮，其等电点为pH 4.7至pH 5.2。在某种程度上，优 选A型明胶。本发明中使用的明胶还可来源于冷水鱼的皮。本发明可使 用A型和B型明胶的混合物以获得具有制备珠子所必需的粘度和bloom 强度特性的明胶。
优选低温明胶(或明胶衍生物或明胶与熔点缩减剂(melting point  reducer)的混合物)或在低温下能够被固化的其他聚合物基质(例如海 藻酸钠)，例如当本发明组合物中加入的活性成分是温度不稳定的或者这 些组分的活性可因暴露于较高的温度而受到影响时。因此，认为含有低温 明胶或是低温明胶的聚合物为本发明的优选基质聚合物。
根据本发明，在聚合物包含明胶或是明胶的实施方案中，优选在制 备前，通过向明胶中添加增塑剂或软化剂来调节本发明组合物的硬度，从 而对初始明胶材料进行改性，以产生“软明胶”。期望的是，增塑剂的添 加可获得增强的柔软性和柔韧性以优化溶解和/或进一步加工，例如包衣。 本发明中可用于与明胶或其他水凝胶形成聚合物组合的增塑剂包括甘油 (1，2，3-丙三醇)、D-山梨糖醇(D-葡萄糖醇)、山梨糖醇BP(非结晶 山梨糖醇溶液)或D-山梨糖醇的水溶液、山梨聚糖(例如Andidriborb 85/70)、甘露醇、麦芽糖醇、阿拉伯树胶、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三正 丁酯、癸二酸二丁酯。还包括其他的或类似的低分子量多元醇，例如乙二 醇和丙二醇。还可使用聚乙二醇和聚丙二醇，但这些物质不是较佳的选择。 甘油和D-山梨糖醇可从Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.USA 或Roquette，France获得。包含的用于其他功能的一些活性剂或赋形剂可 起增塑剂作用。
如果使用的话，软化剂或增塑剂可理想地以上升至按本发明组合物 干重计的30％，优选多至20％，更优选多至10％，甚至更优选3％至8％， 最优选4％至6％的比例添加。
在本发明的范围内，水凝胶形成聚合物可能包含除与任何佐剂缔合 之所述表面活性剂之外的其他表面活性剂，需要重申的是，所述表面活性 剂可以是表面活性剂化合物的混合物。
尽管不是必需的，但是在特定需要时，水凝胶形成聚合物还可任选 包含崩解剂以提高本发明组合物的崩解速率。可包含的崩解剂的实例为海 藻酸、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、低取代的羟基丙基纤维素和羟乙 酸淀粉钠。
本发明的组合物中还可包含结晶抑制剂(例如，按组合物干重计约 1％)。一个实例为羟丙基/甲基纤维素(HMC或HPMC，羟丙甲纤维素 等)，其可起其他作用例如乳化剂。
在一个替代优选实施方案中，聚合物基质为壳聚糖，在有或无添加 剂的情况下，其可以生物凝胶的形式存在，如例如美国专利4,659,700 (Johnson&Johnson)中所述、Kumar Majeti N.V.Ravi在Reactive and  Functional Polymers，46，1，2000中所述以及Paul等在ST.P.Pharma  Science，10，5，2000中所述，3篇文献均通过引用整体并入本文。还包括 壳聚糖衍生物，例如硫醇化的实体。
水凝胶形成聚合物可具有低含水量，因此，所述组合物可具有低含 水量。
在某些实施方案中，所述组合物不包含含有二硫键的化合物。在一 些实施方案中，水凝胶形成聚合物不包含含有二硫键的化合物。
表面活性剂
表面活性剂可作为分散在水凝胶形成聚合物中的自组装结构(例如 胶束)存在于“湿”(未经干燥)组合物中，所述“湿”组合物作为本文 所述制备方法中的中间物被制备。还认为表面活性剂作为自组装结构(例 如，胶束)存在于干组合物中，但是在干化合物中可观察到类似胶束或胶 束样结构的自组装结构并非本发明的要求。关于这点需要提及的是，表面 活性剂以自组装结构(例如，胶束)形式存在不要求组合物中的全部表面 活性剂物质均是这种形式，因为，认为更可能的是一部分表面活性剂位于 自组装结构(例如，胶束)外面。因此，无论水凝胶形成聚合物是凝胶状 态还是溶胶(液体)状态，“湿”组合物均可包含超过用于形成自组装结 构(例如胶束)之临界浓度(即高于临界胶束浓度)的表面活性剂。
对于胶束，分散胶束的直径为0.5nm至200nm、1nm至50nm， 或5nm至25nm。胶束的尺寸可通过本领域中公知的动态光散射或扩散 NMR技术确定。尽管胶束的尺寸以直径的形式给予，但是并不意味胶束 必须是纯粹的球形种类，只要胶束在一定程度上可具有接近圆形的尺寸即 可。
表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。表面活性剂可以是聚氧乙 基化表面活性剂。表面活性剂具有亲水头部，其可以是亲水链，例如聚氧 乙烯链或多羟基化链。
当然，表面活性剂具有疏水部分，特别是疏水链。疏水链可以是烃 链，其具有例如至少6个碳原子，任选至少10个碳原子，特别至少12 个碳原子，一些烃链可具有不超过22个碳原子，例如C10-C20、C12-C20或 C15-C20烃链。疏水链还可以是烷基链，其具有例如刚提及的碳原子数目。 疏水链可以是含有一个或更多个碳-碳双键的烯基链，其具有例如刚提及 的碳原子数目。表面活性剂可包含被取代的烃链(例如烷基链或烯基链)， 只要其保持疏水特性即可。可具有例如一个或两个取代基，例如选自例如 卤素(例如F或Cl)、羟基、巯基、氧基、硝基、氰基的单取代基，羟 基或巯基可被例如脂肪酸酯化。一类表面活性剂包含被羟基单取代的烃基 部分；任选地，表面活性剂(例如珠子中的表面活性剂)等分部分中的至 少一部分羟基可被本文公开的脂肪酸或单羟基脂肪酸酯化或被脂肪醇(例 如具有至少6个碳原子，任选至少10个碳原子，特别至少12个碳原子的 脂肪醇)酯化；一些烃链具有不超过22个碳原子，例如C10-C20、C12-C20或C15-C20脂肪醇。
疏水链可为酯化的脂肪酸R1-COOH或者醚化的或酯化的脂肪醇 R1-COH的一部分，其中R1为疏水，例如前段中提及的疏水链。酯形成 或醚形成(根据情况)基团一般包含亲水链。一部分脂肪酸分子R1-COOH 或脂肪醇分子R1-COH可作为游离酸或醇，一部分可被酯化或被醚化(在 脂肪醇的情况下)。
如上所述，表面活性剂可具有亲水链，可以是非离子型表面活性剂， 也可同时满足两个要求。亲水链可以是聚(乙二醇)，其也被称为聚氧乙 烯或聚乙二醇。亲水链可以是式(O-CH2-CH2)n-OR，其中n为5或6至 50，R是H或诸如乙基或甲基的烷基。本发明包括这样的实施方案，其 中n为6至40，例如6至35。在一些实施方案中，n为6至25，任选8 至25或8至15。在另一些实施方案中，n为8至50或8至40，例如为 10至50，10至40或10至35。在一个具体实施方案中，n为15。对于 式(O-CH2-CH2)n-OR的所有亲水链，在一类实施方案中，R为H。
亲水链可以是多羟基化链(例如C5-C20例如C5-C10链)，例如链的 碳原子上具有羟基，例如葡糖酰胺。
表面活性剂可包含上文所述疏水链与上文所述亲水链的组合。因此， 表面活性剂可以是或包含本文所述脂肪酸的聚乙二醇酯或本文所述脂肪 醇的聚乙二醇醚。
含有疏水链和亲水链的胶束形成表面活性剂可选自：聚乙二醇酯、 聚乙二醇醚、二嵌段共聚物、三嵌段共聚物和两亲性聚合物。在本发明的 某些实施方案中，本发明包括所述组的任意组合。
适用于本发明的聚乙二醇酯的实例为脂肪酸的聚乙二醇酯，所述脂 肪酸具有至少6个碳原子，任选10个碳原子，特别至少12个碳原子；一 些脂肪酸具有不超过22个碳原子，例如C10-C20、C12-C20或C15-C20脂肪 酸。所述脂肪酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，但特别是饱和脂肪酸。 需要提及的是聚乙二醇25十六十八烷基醚(A25)、聚乙 二醇6十六十八烷基醚(A6)、聚乙二醇甘油麻酸酯35 (EL)、聚乙二醇-甘油羟基硬脂酸酯40(RH 40)、聚乙二醇_15-羟基硬脂酸酯(聚烃氧基_15-羟基硬脂酸酯US Pharmacopoeia和National Formulary、European Pharmacopoeia，例如 Kolliphor HS 15，之前也称为HS 15)。适用于本发明的聚乙二 醇酯的实例为脂肪醇的聚乙二醇醚，所述脂肪醇具有至少6个碳原子，任 选至少10个碳原子，特别至少12个碳原子；一些脂肪醇具有不超过22 个碳原子，例如C10-C20、C12-C20或C15-C20脂肪醇。所述脂肪醇可以是 饱和脂肪醇或不饱和脂肪醇，但是在一个实施方案中，其为饱和脂肪醇。 HS 15通过使15摩尔的环氧乙烷与1摩尔的12-羟基硬脂酸 反应获得；因此，表面活性剂可以是或包含通过使10至25摩尔的环氧乙 烷与1摩尔的12-羟基硬脂酸反应可获得的表面活性剂(具有通过所述方 法可获得的表面活性剂的性质)，环氧乙烷的摩尔数可以是12至25，任 选15至20，例如15或20。
HS 15由12-羟基硬脂酸的聚乙二醇单酯和二酯以及约 30％的游离聚乙二醇组成。酯部分的主要组分具有下列化学结构：


其中x和y为整数，小部分12-羟基可用聚乙二醇醚化。
因此，表面活性剂可包含分子混合物。例如，制备过程中使用的表 面活性剂组合物可包含聚乙氧基化(PEG化)分子，并且可额外包含游 离的聚乙氧基(游离PEG)化合物，或者制备过程中使用的表面活性剂 组合物可包含具有多羟基化部分的分子，并且可额外包含游离的多羟基化 合物。本发明的实施方案为其中表面活性剂是或包含聚乙氧基化脂肪酸 (例如聚乙氧基化羟基脂肪酸)与游离PEG的组合的这些实施方案。
适用于本发明的两亲性聚合物的实例为：烷基葡糖酰胺、脂肪酸聚(乙 氧基)酯，也称为聚乙氧基化烷基醚、聚乙氧基化脂肪酸酯(Myrj或 Kolliphor)、脂肪酰胺聚乙氧基化物、脂肪酰胺乙基化物、烷基酚乙氧 基化物、聚乙氧基化脱水山梨醇酯(聚山梨酯)、聚乙氧基化甘油酯或聚 甘油酯。
适用于本发明的共聚物的实例为：环氧乙烷与环氧丙烷共聚物(泊 洛沙姆)、聚乙烯基吡咯烷酮-聚乙酸乙烯酯(Plasdone S630)、甲基丙 烯酸氨基烷酯共聚物(Eudragit EPO)、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共 聚物(Eudragit S100，L100)、聚己酸内酯-PEG、聚己酸内酯-甲氧基 -PEG、聚(天冬氨酸)-PEG、聚(苄基-L-谷氨酰胺)-PEG、聚(D，L- 丙交酯)甲氧基-PEG、聚(苄基-L-天冬氨酸)-PEG或聚(L-赖氨酸) -PEG。
在一个优选实施方案中，表面活性剂为聚乙二醇酯，更优选符合欧 洲药典专刊号2052聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯的聚乙二醇酯，例如由 BASF销售的HS 15。
合适的表面活性剂包括在制备期间以高于其形成透明液体的CMC 的量与水相(含有水凝胶形成聚合物)组合的那些表面活性剂。HS 15为这样表面活性剂。
在某些实施方案中，表面活性剂与微生物抗原的重量比为10∶1至 100∶1，任选50∶1至100∶1。在一些实施方案中，该比例为80∶1至90∶1，。 在一些具体实施方案中，该比例为50∶1至60∶1。
在一些实施方案中，表面活性剂以基于组合物干重的按重量计20％ 至55％，例如30％至45％或30％至40％存在于组合物中。
自组装结构形成化合物的组合
在一些具体实施方案中，本发明的组合物包含自组装结构形成化合 物的组合。所述自组装结构形成化合物的组合可由本说明前述部分中提及 的两种或更多种表面活性剂组成。或者，表面活性剂可与至少潜在地能够 与表面活性剂形成胶束的一种或更多种其他化合物组合，所述化合物任选 地选自阳离子脂质和糖脂等。作为额外选择，组合物可包含本说明前述部 分中提及的多种表面活性剂和至少潜在地能够与表面活性剂形成自组装 结构(例如，胶束)的一种或更多种其他化合物，所述化合物任选地选自 阳离子脂质和糖脂等。
对于含有自组装结构形成(例如，胶束形成)化合物之组合的“混 合自组装结构”或“混合胶束”，在不受理论约束的情况下，认为这些混 合结构中的至少一部分佐剂α-GalCer将与所述自组装结构形成表面活性 剂一起充当自组装结构形成化合物。认为其他糖脂和神经酰胺将起类似作 用，无论单独使用还是与其他糖脂或神经酰胺组合使用。
因此，本发明包括本文所述的组合物，其包含：
●两种或更多种自组装结构形成(例如胶束形成)表面活性剂，例如 两种或更多种具有疏水链和亲水链的表面活性剂
●化合物，例如选自阳离子脂质和糖脂的单一化合物或两种或更多种 化合物
●两种或更多种自组装结构形成(例如胶束形成)表面活性剂和化合 物，例如选自阳离子脂质和糖脂的单一化合物或两种或更多种化合物。
其他赋形剂
除至少一种活性成分、表面活性剂和水凝胶形成聚合物之外，本发 明预见向组合物中引入一种或更多种下列物质或物质类别。例如，所述组 合物可包含保护剂，例如蛋白水解酶抑制剂或针对酸降解的保护剂或两者 (例如诸如氢氧化钠的碱)；粘合剂实体，例如粘膜粘合剂或生物粘合剂； 使活性药物化合物溶解度最大化的赋形剂；使活性药物化合物在GIT内 的渗透性最大化的赋形剂；油，例如中链甘油三酯组合物；阳离子脂质， 例如脂质转染剂；和/或另一种表面活性剂。
用于增强上皮屏障渗透性的典型赋形剂包括但不局限于癸酸钠、月 桂酸钠、棕榈酸钠、SNAC、壳聚糖及其衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、聚 醚、胆汁盐、磷脂、烷基聚葡糖苷、羟化酶抑制剂、抗氧化剂(抗坏血酸) 和/或氧化氮供体，包括与多种活性药物组分共价连接的氧化氮或二氧化 碳供体组。前述列表特别有利于增强回肠内的渗透性。
用于增强结肠内渗透性的典型赋形剂包括但不限于癸酸钠、月桂酸 钠、棕榈酸钠、SNAC、壳聚糖及其衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、聚醚、 胆汁盐、磷脂、烷基聚葡糖苷、羟化酶抑制剂、抗氧化剂(抗坏血酸)和 /或氧化氮供体，包括与多种活性药物组分共价连接的氧化氮或二氧化碳 供体组。
所述组合物还可包含增强活性成分在回肠和结肠中的治疗潜力的赋 形剂，其包括但不限于吸收限制剂、精油例如Ω-3油、天然植物提取物 例如印楝、离子交换树脂、细菌可降解的缀合接头例如偶氮键、多糖例如 直链淀粉、瓜尔胶、果胶、壳聚糖、菊糖、环糊精、硫酸软骨素、葡聚糖、 瓜尔胶和刺槐豆胶、核因子κB抑制剂、酸例如富马酸、柠檬酸等及其改 性形式。
所述组合物还可包含油，例如可包含单一油或油组合，所述油可以 是任何可药用的油。油可包括植物油(例如印楝油)、石油化工油和挥发 性精油。组合物可包含选自以下的油：多不饱和脂肪酸例如Ω-3油；中 链甘油三酯；基于天然甘油三酯的油，其包括橄榄油、芝麻油、椰子油、 棕榈坚果油，优选包括饱和的椰子油和棕榈坚果油来源的辛脂肪酸和癸 脂肪酸和甘油；其他可能的油包括亚油酰基聚乙二醇甘油酯(聚烃氧基甘 油酯)例如Labrafil(例如Gattefosse的产品号M2125CS)和辛酰基己 酰基聚乙二醇甘油酯例如Gattefosse的Labrasol。
油可以是提及的液体脂质，例如选自中链甘油三酯(MCT)组合物， 所述中链甘油三酯为选自C6-C12脂肪酸的至少一种脂肪酸的一种或更多 种甘油三酯。应当理解的是，用于本发明的市售MCT组合物为来源于天 然产品的混合物，其通常或总是包含少量非MCT的化合物；因此，术语 “中链甘油三酯组合物”应被解释为包括这些组合物。
本发明的组合物还可包含阳离子脂质，例如阳离子脂质体转染剂。 阳离子脂质包含疏水部分和阳离子基团，所述疏水部分例如具有一个或更 多个碳-碳双键的烷基链或烯基链。疏水基团可以是例如饱和烷基链或不 饱和烷基链。所述阳离子脂质可选自DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧 基)]-N，N，N-三甲基铵丙烷甲基硫酸酯/盐)、DOSPER(1，3-二油酰氧基 -2-(6-羧基精胺基(carboxyspermyl))-丙基酰胺)、DC-胆固醇盐酸 (3β-N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇盐酸盐)、DODAP (1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷)、DDAB(二甲基二(十八烷基)铵)、 12：0EPC(1，2-二月桂基-sn-甘油-3乙基磷酸胆碱)、DOTMA(1，2-二-氧- 十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷)、DOEPC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基 磷酸胆碱氯化物盐)、DOG(1，2-二油酰基-sn-甘油)、DODAP(1，2-二油 酰基-3-二甲基铵-丙烷)、DOPE(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、 DOPC(1，2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPG(1，2-二油酰基sn-甘油 -3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)]钠盐)、DOSPA(2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧 酰胺)乙基]-N-N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸)、DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰 氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DMRIE(1，2-二肉豆蔻基氧基丙基 -3-二甲基羟基乙基溴化铵)、DMKE(O，O′-二肉豆蔻基-N-赖氨酰天冬 氨酸)、DMKD(O，O′-二肉豆蔻基-N-赖氨酰谷氨酸)和DOPS(1，2- 二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-1-丝氨酸]钠盐)及其组合。
组合物还可包含被认为具有除形成胶束之外的重要作用的表面活性 剂，其选自：阳离子表面活性剂；两性表面活性剂(两性离子表面活性剂)； 阴离子表面活性剂包括全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛磺酸盐 (PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸铵及其他类型的烷基 硫酸盐、月桂基聚醚硫酸钠(sodium laureth sulfate)，也称为月桂基醚 硫酸钠(SLES)和烷基苯磺酸盐；以及非离子型表面活性剂包括全氟化 碳、聚氧乙烯二醇十二烷基醚(例如Brij例如Brij35)、Myrj(例如 Myrj49、52或59)、吐温20或80(也称为聚山梨酯)(Brij、Myrj 和Tween产品均可从Croda商购)、泊洛沙姆，其是由聚氧丙烯(聚(环 氧丙烷))的中心疏水链和侧面聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水 链组成的非离子型三嵌段共聚物。水相中的一种优选阴离子表面活性剂为 SDS。还可包括其他表面活性剂的混合物，例如含有全氟化碳的混合物。
在本发明的一些实施方案中，所述组合物包含亲水性表面活性剂， 在不受理论限制的情况下，认为其至少部分地分隔水相(聚合物基质)。
用于如此包含在本发明水相中的这些表面活性剂优选为易于扩散或 可扩散的表面活性剂从而有利于制备和加工本发明的组合物。表面活性剂 的HLB可为至少10，任选至少15，例如至少30，任选38至42，例如 40。这些表面活性剂可以为任意特定类型(离子型、非离子型、两性离子 型)，并且占组合物干重的比例可为0.1％至6％，例如0.1％至5％、0.1％ 至4％或0.1％至3％，更优选地所述比例为至少1％，特别是1.0％至4.5％ 或5％，理想的是位于2％至4％范围之内或刚好在2％至4％范围之外， 例如2％至3％或接近2％或接近4％。
除非另有说明或要求，否则所有的百分比和比例均为按重量计。
用于包含在水相中的特定阴离子表面活性剂包括全氟辛酸盐(PFOA 或PFO)、全氟辛磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基 硫酸铵及其他类型的烷基硫酸盐、月桂基聚醚硫酸钠，也称为月桂基醚硫 酸钠(SLES)和烷基苯磺酸盐。一类特定类别的表面活性剂包括硫酸盐。 水相中的一种优选阴离子表面活性剂为SDS。还包括阴离子表面活性剂 的混合物。
关于在制备期间将其引入到水相中这一点，表面活性剂的物理形式 在制备根据本发明的组合物方面发挥重要作用。因此，尽管可使用液体表 面活性剂，但是优选利用在室温下是固体形式的表面活性剂(例如结晶、 颗粒或粉末)，特别是当水相包含明胶时。
一般而言，可利用表面活性剂的混合物，例如以获得具有最佳的长 期稳定性的本发明组合物，其中一般情况下，较短链表面活性剂有利于较 短期稳定性(有助于加工)，较长链表面活性剂有利于较长期稳定性(有 助于保存期限)。在一些实施方案中，较短链表面活性剂具有多至C10烷 基(例如C6-C10烷基)作为表面活性剂的疏水部分，而较长链表面活性 剂具有C10或更高的烷基(例如C10-C22烷基)作为表面活性剂的疏水部 分。根据其他赋形剂和活性成分的特性，设想C10烷基表面活性剂可有利 于加工或有利于延长货架期或两者。在本发明的一些具体实施方案中，高 级烷基可以是C11-C22或C12-C22烷基，在一些实施方案中，其长度不大于 C18。
替代水相中的表面活性剂(或作为对其的补充)，本发明还包括使 用诸如HPMC(也称为羟丙甲纤维素)的表面活性剂样乳化剂(也称为 结晶抑制剂)，但是一般考虑以相对小的量使用它们以避免可能限制加工 选择的高粘度。
所述组合物还可包含提高在GIT道(例如小肠)吸收后的全身性生 物可利用度的赋形剂或其他活性药物或其他成分，包括外排泵抑制剂，包 括但不限于PgP抑制剂和代谢抑制剂，包括但不限于细胞色素P450 3A 抑制剂。
所述组合物还可包含降低与在GIT(例如小肠)内吸收相关的全身 性副作用的赋形剂，包括但不限于，抗氧化剂，例如类姜黄色素类、类黄 酮类或者更具体包括姜黄素、β-胡萝卜素、α-生育酚、抗坏血酸盐或拉扎 洛依。
所述组合物可进一步或单独包含抗氧化剂(例如抗坏血酸或BHT-丁 基羟基甲苯)掩味剂或光敏组分或光保护组分。抗氧化剂可以例如多至按 重量计1％，优选按重量计0.01％至0.50％，更优选按重量计0.10％至 0.20％被引入到水相(例如，亲水性抗氧化剂)或表面活性剂相(例如， 疏水性抗氧化剂，例如维生素E)中。
所述组合物还可包含增强免疫营养物，例如维生素A/B/C/E、类胡萝 卜素/β-胡萝卜素和铁、镁、硒、锌。这些营养物质可存在于组合物中， 或者如果组合物具有包衣，例如如果组合物是珠子形式，则这些营养物质 可包含在包衣中。
组合物可进一步或单独包含粘合剂以确保如果期望的话，珠子的剂 型可在胃环境中保留或保持更久。本发明的珠子还可包含促进或能够降低 浮动或密度的物质，例如作为使珠子在期望胃肠部位局部化的方法。珠子 的剂型还可使得在胃或其他胃肠部位内溶胀和/或聚集。
本发明的剂型可包含上文所公开的赋形剂。在某些实施方案中，剂 型中存在的任何赋形剂可不包含在剂型组合物群中。
形状、尺寸和几何形状
本发明的组合物可成形为无限多的形状和尺寸。在下文描述组合物 制备方法的部分中，提供了多种方法，包括将液体胶束分散体倒入或引入 到使或可促使其硬化的模具中。因此，通过制作适当的模具(例如圆盘形、 丸形或片形)，组合物可产生任何期望的形式。但是并非必需使用模具。 例如组合物可成形为片层，例如通过将液体胶束分散体倒入到使或可促使 其硬化的平面上获得。
优选地，组合物的形式可以是球形或如下文所述制作的类似球形的 形状。优选地，本发明的组合物呈基本球形的形式，无缝珠子。珠子表面 上不存在缝是一个优点，例如在进一步加工中(例如包衣中)，因为其允 许更一致的包衣、流动性等。珠子上不存在缝还提高珠子溶解的一致性。
可对本发明珠子的优选尺寸或直径进行选择以避免在经口施用珠子 后其在胃内滞留。较大的剂型在胃内的滞留时间可变，并且其只随食物一 起通过括约肌，而较小的颗粒独立于食物而通过幽门。因此，选择适当的 尺寸范围(参见下文)可更精确地预测给药后的治疗效果。与单个大单片 口服形式(例如传统的压制药片)相比，在胃肠内释放的珠子群(如本发 明剂型所预见的)允许更大的肠腔分散从而通过暴露于更大的上皮区域而 增强吸收、防止刺激(例如，如其他情况用NSAID可见的)以及获得更 大的表面包衣(例如根据对胃肠道某些部位(例如结肠)中局部药物效果 的期望)。另一潜在优点是缩短在回肠-盲肠接合部中的滞留时间。
本发明的组合物优选为内部(即截面)均匀、不包含基质材料可能 的薄皮以及不包含任何包衣层。
本发明组合物提供的珠子的直径一般为0.5mm至10mm，其中上限 优选为5mm，例如2.5mm。一个特别方便的上限是2mm或1.7mm。 下限可优选是1mm，例如1.2mm，更优选1.3mm，最优选1.4mm。在 一个实施方案中，该直径为0.5mm至2.5mm，例如1mm至3mm、1mm 至2mm、1.2mm至3mm或1.2mm至2mm。不考虑其最小尺寸，珠 子的直径可以为不超过2.5mm。不考虑其最小尺寸，珠子的直径可以不 超过2mm。
本文所述的珠子的纵横比可以是不超过1.5，例如不超过1.3，例如 不超过1.2，特别是1.1至1.5、1.1至1.3或1.1至1.2。本文所述的珠子 群(例如至少10个珠子)的平均纵横比可以是不超过1.5，例如不超过 1.3，例如不超过1.2，特别是1至1.5、1至1.3或1至1.2。本段中提及 的纵横比任选应用于经包衣的珠子，并且任选应用于未经包衣的珠子。利 用粒径分析仪，例如Innopharma Labs，Dublin 18，Ireland的EyeconTM颗 粒表征器来适当地确定珠子群(例如至少10个珠子)的平均纵横比。
因此，本公开内容的珠子可具有如上文段落[00194]中公开的尺寸和1 至1.5的纵横比。本公开内容的珠子可具有如上文段落[00194]中公开的尺 寸和如下纵横比：不超过1.3，例如不超过1.2，特别是1.1至1.5、1.1至 1.3或1.1至1.2。
珠子尺寸(直径)可通过任意合适的技术确定，例如显微术、筛分、 沉积、光感测区方法、电感测区方法或激光散射。出于本说明书的目的， 可根据USP General Test<786>Method I(USP 24-NF 18，(U.S. Pharmacopeial Convention，Rockville，MD，2000)，第1965-1967页)通过 分析筛分确定珠子尺寸。
在一些实施方案中，本发明的珠子为单分散体。在另一些实施方案 中，本发明的珠子不是单分散体。“单分散体”指对于珠子群(例如至少 100，更优选至少1000)，珠子的直径变异系数(CV)为35％或更小， 任选25％或更小，例如15％或更小，例如10％或更小，任选8％或更小， 例如5％或更小。特定种类的聚合物珠子的CV为25％或更小。当在本说 明书中提及时，CV被限定为100倍(标准差)除以平均值，其中“平均 值”为平均颗粒直径，标准偏差为颗粒尺寸的标准差。CV的确定可利用 筛进行。
本发明包括CV为35％，平均直径为1mm至2mm(例如1.5mm) 的珠子。本发明还包括CV为20％，平均直径为1mm至2mm(例如1.5 mm)的珠子，以及CV为10％，平均直径为1mm至2mm(例如1.5mm) 的珠子。在一类实施方案中，90％珠子的直径为0.5mm至2.5mm，例 如1mm至2mm。
本发明组合物的另一可能形式是半球形珠子，可在平面上将两个半 球形珠子任选地连接以产生具有两个不同半体的单个珠子，每个半体含有 不同的组合物，如果期望的话，例如每个半体含不同的活性成分或相同的 活性成分但不同的赋形剂例如以获得两个半体之间的不同渗透性、溶解性 或释放性能。
由本发明组合物提供的珠子还可用作产生其他例如药物或营养制品 形式的起点物质，例如通过将珠子用作可施加额外材料层的糖母粒 (nonpareil seed)，如例如药学领域的技术人员所公知的那样。如该文 献所述，额外的材料层可包含相同或不同的活性成分和/或相同或不同的 赋形剂。这样的变体允许差别释放相同或不同的活性成分，并有利于包含 多个固定剂量的组合产品，如例如结合公知术语“多效药片”所讨论的， “多效药片”指包含以剂量固定组合的超过一种活性成分的单个药片，与 心血管医学特别相关的一个概念。
本发明的组合物的外表面上可具有额外材料的包衣。该包衣可以多 种方式施加，包括药物成层，如下文标题“包衣”的部分中更具体描述的。 在一个这样的实施方案中，本发明的组合物包含酸，例如包含在水凝胶形 成聚合物基质中或作为呈微囊形式的液体芯以及以包衣形式施加的碳酸 氢盐，例如通过药物成层。如果组合物具有例如控制释放到结肠内的聚合 物包衣，碳酸氢盐可任选地或额外地包含在或不存在于包衣聚合物中。该 组合物目的是在胃肠道内释放二氧化碳，例如以减轻疼痛或减轻炎症。在 一个相关实施方案中，芯或组合物包含提高具有多种pKa(酸解离常数) 的活性成分在小肠或结肠内溶解度的酸。或者，芯或组合物包含提高具有 多种pKa(酸溶解常数)的活性成分在小肠或结肠内溶解度的碱。
其他特征
在某些实施方案中，本发明的组合物包含上述现有技术的一个或更 多个要素、组分、赋形剂、结构特征、功能特征或的其他方面。
为了概括本发明有限的实施方案，上文以及本文其他部分所述的组 合物还可以是下列中的一种或更多种：基本不含水、呈凝胶态、呈固态、 未溶解、非粉状、形成(formed)、成形(shaped)和非溶液形式。
优选的是，本发明的组合物本质上或基本上是干的，例如包含按重 量计少于5％，优选少于1％的自由水。组合物中的珠子优选是均质的， 但是可改变加工条件(参见下文)以获得例如异质性例如，较硬的皮和较 软的芯，同时较不完全使胶束固定在与珠子表面相对的芯。特别的是，可 将具有较大外形(form)或形状(shape)的本发明珠子改造成体现这种 异质性。
低自由水含量是本发明组合物某些实施方案的区别特征。可利用热 失重分析(TGA)，例如用市售的仪器，例如用TA Q系列仪器的TGA Q 500测量自由水含量。TGA测量随温度变化的重量变化。例如，TGA方 法可包括温度扫描，例如20℃至400℃，每分钟20℃，其中水含量获自 样品在100℃下减轻的重量。
在一个实施方案中，胶束分散体均匀分散在固化的水凝胶形成聚合 物中，其中邻近胶束之间基本不存在聚结。因此，胶束分散体优选在固化 期间被保持。
本发明的组合物一般包含多个胶束，其中呈模制或成形形式的组合 物一般可包含数百或数千个胶束，与此不同的是来源于微米尺寸颗粒的粉 末，其通常在喷雾干燥期间，在胶束聚结后引入单个或少量胶束。尽管不 排除粉末实施方案，本发明的组合物(如果是颗粒的话)优选包含比粉末 颗粒大的颗粒，因此组合物呈非粉状形式。
本发明的“固体”组合物(即通过下文所述方法固化和干燥水凝胶 后)应适当地使得组分在含表面活性剂小肠和表面活性剂受限的结肠中的 至少之一(例如两者)内容易地形成胶束。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含：
a)25％至70％(适当地40％至65％，特别是45％至60％)水凝胶形 成聚合物(例如明胶)；
b)20％至50％(适当地30％至40％)表面活性剂(例如Kolliphor HS 15)；
c)1％至10％(适当地3％至8％)增塑剂(例如山梨糖醇)；和
d)0.01％至2％(适当地0.1％至1％或0.1％至0.3％)佐剂(例如 α-GalCer)；
其中％为在组合物上不存在任何包衣的情况下以组合物的干重计的重量。 在这些实施方案中，所述组合物还包含选自活微生物、经杀灭微生物、经 减毒微生物和经灭活微生物的微生物。微生物的浓度应在最终剂型中提 供期望的剂量，例如，每剂量足以供给108至1014个细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了具有立即释放(IR)特性的珠子 或其他成形单元，例如不含包衣、仅含肠溶包衣或被设计成仅防止珠子在 受限的时间内释放和/或溶解的包衣或水相中缺乏延缓剂。在另一实施方 案中，本发明提供了具有延缓或持续释放(SR)特性的珠子，例如含有 一层下文、特别是标题“包衣”部分中详细描述的包衣(或一层以上包衣)。 本发明还提供了立即释放珠子以不同的IR：SR/CR比例与缓释或控释 (CR)珠子组合产生的实施方案。立即释放珠子可以下列比例(按效力 计w/w)与缓释或控释珠子组分组合，例如10％立即释放(IR)+90％缓 释(SR)/控释(CR)微胶囊、20％IR+80％SR/CR、30％IR+70％SR/CR、 40％IR+60％SR/CR和50％IR+50％SR/CR。
在一些实施方案中，珠子或成形单元在由含胶束的组合物构成的芯 和IR包衣之间具有立即释放包衣，其为具有至少一种下列作用的子包衣 (sub-coat)：提供机械强度、防止吸收湿气、调节活性剂从芯释放、稳 定活性剂从芯释放(例如调节并稳定活性剂从芯释放)。
在一些实施方案中，自组织结构(例如胶束)以自组装结构的尺寸 为特征。确定胶束尺寸的方便方法为上文所述的动态光散射，其中胶束尺 寸被确定为流体动力学直径。光散射是可用于确定溶液中颗粒尺寸分布的 技术。当光撞击到颗粒时，光沿各个方向散射(Rayleigh散射)。如果光 源是激光，并且因此是单色的和连贯的，那么观察到散射强度发生时间依 赖性波动。这些波动归因于以下事实：溶液中的颗粒正进行布朗运动，因 此溶液中散射颗粒之间的距离随时间不断变化。颗粒的动态信息源自试验 期间记录到的强度轨迹的自相关性，所述自相关性取决于测量的时间延 迟。在时间延迟短时，相关性较高，原因是颗粒没有机会从其所处的初始 状态大幅度移动。当时间延迟变长时，相关性开始按指数规律衰减至零， 意味着经历长时间后，初始状态和最终状态的散射强度之间无相关性。该 指数衰减与颗粒的运动相关，特别是与扩散系数相关。为了拟合衰减，基 于对假设分布的计算，使用了无数的方法。如果样品是单分散体，那么衰 减仅呈单指数，并且多分散指数(PdI)是零或接近零；但是如果样品是 多分散体，衰减可呈双指数(此时有两个群体)或具有甚至更复杂的衰减。 多分散指数通过拟合衰减获得，在PdI等于1时，其达到最大值。
用于测量自组装结构(例如，胶束)尺寸和形成的其他可用表征方 法包括小角度X-射线散射和扩散核磁共振(Diffusion Nuclear Magnetic  Resonance)。这些技术是公知的，参见例如Oliver等PLOS one，2013 年5月，第8(5)卷，e62488和Colafemmina等，J.Phys Chem B 2007，111， 7184-7193。
制备方法
本文描述的制备方法包括将液体混合。所述混合过程必须在待混合 的物质处于液态(即液体形式)的温度下进行。例如，热可逆性胶凝剂必 须在其处于液态的温度下混合，例如所述温度为50℃至75℃，例如50℃ 至70℃，或55℃至75℃，例如60℃至70℃，在一些具体实施方案中， 在混合含有水性明胶的组合物的情况下为约55℃或65℃。Kolliphor HS 15同样应以液态混合，并且适当保持在室温或略高温度下，例如保持在 至少30℃的温度下，例如35℃至50℃，特别是40℃；当需将Kolliphor HS 15和水性明胶两者混合时，那么使用较高的温度，例如50℃至75℃，例 如55℃至75℃，在此温度下Kolliphor HS 15以及水性明胶均为液体。
如下制备本文公开的组合物：混合包含水、水凝胶形成聚合物、表 面活性剂和活性成分的材料以形成含有水凝胶形成聚合物的水相中的自 组装结构分散体。然后使或促使水凝胶形成聚合物胶凝。适当地，该过程 包括将水性自组装结构分散体制备或加工成期望的形式(例如珠子)，其 中形成过程可包括模制，但优选包括通过单孔喷嘴喷射水性胶束分散体以 形成液滴，然后促使或使液滴进入冷却介质，例如与水不混溶的冷却液， 在此液滴冷凝而形成例如珠子。
混合材料可包括将水性预混合物(或水相)和表面活性剂预混合物 (或表面活性剂相)混合，其中水性预混合物包含水和水溶性物质，而表 面活性剂预混合物包含表面活性剂和表面活性剂可溶性物质。在一些实施 方案中，水性预混合物包含至少一种水可分散性物质。在一些实施方案中， 表面活性剂预混合物包含至少一种表面活性剂可分散性物质。
水性预混合物包含水溶性组分(即水凝胶形成聚合物、任何水溶性 赋形剂、任何亲水性活性成分)的水溶液，或通常由其组成。水性预混合 物可包含最终组合物中的至少一部分(例如全部)微生物组分。水性预混 合物可包含最终组合物中的至少一部分(例如全部)佐剂组分。水性预混 合物可包含本说明书其他部分中所述的增塑剂，即水溶性赋形剂。水性预 混合物可包含例如提高聚合物粘度和改善乳化从而有助于防止活性剂在 加工过程中沉淀的表面活性剂。SDS是这种表面活性剂的一个实例。水 相可包含一种或更多种控释聚合物。在任何情况下，可搅拌水性预混合物 的组分一段时间，例如1小时至12小时以形成完成的水性预混合物。
表面活性剂相预混合物包含疏水性和两亲性组分之表面活性剂中的 溶液。本说明书在此公开了表面活性剂相预混合物，其包含最终组合物中 的至少一部分微生物组分和至少一部分佐剂组分。表面活性剂相预混合物 可包含最终组合物中的所有微生物组分和至少一部分(例如全部)佐剂组 分。表面活性剂相预混合物可包含最终组合物中的一部分微生物组分，该 部分同时包含在水相预混合物中；和最终组合物中的至少一部分(例如全 部)佐剂组分。在表面活性剂相包含一部分微生物组分的情况下，所述部 分可以是至少50重量％，例如至少75重量％。在表面活性剂相包含一部 分佐剂组分的情况下，所述部分可以是至少50重量％，例如至少75重量 ％。需要重申的是，表面活性剂可包含疏水链和亲水链。疏水性和两亲性 组分可包含选自疏水性和两亲性活性成分的一种或更多种活性成分(如果 有的话)。
因此，在很多情况下，表面活性剂预混合物包含微生物。通常而言， 微生物将直接包含在表面活性剂中，例如以冻干物或其他干粉的形式，或 者微生物可以水性混悬液的形式包含在表面活性剂中。微生物可同时以冻 干物(或其他干粉)和水性混悬液的形式包含在表面活性剂中。因此，本 发明提供了用于制备表面活性剂/活性成分预混合物的方法。本发明的方 法包括混合(i)表面活性剂、(ii)微生物和任选的(iii)佐剂。表面活 性剂预混合物可包含除表面活性剂和任何活性成分之外的物质。例如，表 面活性剂预混合物可包含额外的赋形剂。所述额外的赋形剂可以是疏水性 的或亲水性的，例如它们可包含与水不混溶的物质，例如油。因此，额外 的赋形剂可以是液体脂质，例如中链甘油三酯(MCT)组合物，其中中 链甘油三酯为选自C6-C12脂肪酸的至少一种脂肪酸的一种或更多种甘油 三酯。任何一种或更多种活性剂可预先溶解于诸如乙醇或MCT组合物的 溶剂中，然后将其组合成表面活性剂预混合物。在一些实施方案中，将表 面活性剂组分混合(或其他方式搅拌)一段时间，例如10分钟至3小时 以形成预混合物。
将两种预混合物合并，并搅拌一段时间，例如几秒至1小时，例如 30秒至1小时，适当地5分钟至1小时，以形成自组装结构(例如胶束) 在水性水凝胶形成聚合物中的分散体，然后可对所述分散体进行进一步加 工以形成最终的制剂。通过在混合容器中搅拌可将两种预混合物组合成分 散体，作为替代或补充，可在连续流动混合器中组合两种预混合物。
因此，用于制备本发明组合物的基本方法为将流体形式(优选溶液) 的水凝胶形成聚合物(或聚合物的混合物)与一种或更多种活性成分以及 表面活性剂混合以形成聚合物形成之水凝胶中的分散体。考虑到所需的最 终组合物(如本文其他部分所述)，可以1∶2.5(优选接近1∶3或1∶4)的 比例混合表面活性剂和液体水凝胶形成聚合物(即，水凝胶形成聚合物的 溶液或混悬液)。如本领域技术人员所熟知的那样，一般情况下仅需利用 磁力或机械系统(例如悬挂式搅拌器)轻轻搅拌组分，以获得自组装结构 (例如胶束)的分散体。优选连续搅拌。混合过程也可通过利用线流混合 系统实现。出于此目的，可利用任何合适的实验室搅拌装置或工业规模混 合器，例如磁力搅拌器(Magnetic Stirrer)(由制造Stuart)或悬挂式搅 拌器(Overhead Stirrer)(由KNF或Fisher制造)。优选以使诸如水 的组分蒸发最小化的方式设置装置。在本发明方法的一个实施方案中，优 选利用封闭搅拌系统来实现此目的。线流混合可特别适用于封闭系统加 工。
本发明包括将表面活性剂相液体和水不溶性组分形成的透明溶液与 水相混合的实施方案。在将两相混合形成乳剂之前，它们均可以是透明溶 液。
在一些实施方案中，可对表面活性剂预混合物中表面活性剂的浓度 进行选择使得与水性预混合物合并后，合并的混合物中的表面活性剂浓度 超过使用表面活性剂的CMC，从而使胶束形成在含有水凝胶形成聚合物 的水相中。根据使用表面活性剂的浓度，还可形成除胶束之外的自组装结 构。特定表面活性剂的CMC可通过利用公知的方法确定，例如按照 Holmberg等，Surfactants and Polymers in Aqueous Solutions，第2版， 第2章中所述。
在一些实施方案中，将水性和表面活性剂预混合物混合导致形成透 明溶液，例如微乳剂，其中含有水凝胶形成聚合物的水相为连续相。将表 面活性剂相和水相混合后形成的透明溶液通常指示已形成非常小的自组 装结构，例如微乳剂。微乳剂是自组装结构在水相中的热力学稳定分散体， 自组装结构的尺寸小到足以提供透明的外观。如前所述，在一些实施方案 中，作为将水相和表面活性剂相混合得到的分散相形式存在的自组装结构 的尺寸为约0.5nm至200nm，例如约1nm至50nm，或约5nm至25nm。 形成的自组装结构的尺寸以及组合物(例如微乳剂)的其他特性(例如光 各向同性)可利用前述公知技术确定。
在聚合物基质基本由明胶组成，同时添加有山梨糖醇的实施方案中， 如下制备聚合物基质的水相：向水中添加适量的山梨糖醇(和表面活性剂， 如果期望的话)，加热至约50℃至75℃，例如60℃至75℃，直至呈溶液 形式，然后添加明胶，但是添加的精确顺序和时机并不重要。典型的“明 胶溶液”包含8％至25％(例如15％至25％，优选17％至18％)明胶、 75％至85％(优选77％至82％)水加上1％至5％(优选1.5％至3％)山 梨糖醇。
尽管对形成分散体的温度的选择基于多种因素，所述因素包括活性 成分的温度不稳定性和包含在明胶中的增塑剂的量，明胶的类型以及其他 因素。但是一般情况下，明胶溶液(尤其在标准明胶或常规凝胶的情况下) 被保持在50℃至70℃，适当地60℃至70℃以使其保持在液态。
然而，可通过利用低熔点明胶(或明胶衍生物或明胶与熔点减缩剂 的混合物)或其他聚合物基质材料(例如，海藻酸钠)来将加工温度降低 至理想的目标温度例如37℃。或者，可通过利用限制热不稳定性活性成 分与高温介质之接触时间的合适装置或机器来在高温下对热不稳定性活 性成分进行加工。例如，如果明胶液滴通过机器挤出并立即例如在冷却浴 中冷凝形成，那么可利用额外的合适入口管来将温度敏感性活性成分引入 到液体明胶溶液(并可立即均化混合物)中，然后在很短的时间内从珠子 喷嘴喷射或进行其他成液滴过程使得活性成分在高温明胶中的暴露持续 时间受到限制，从而降低活性成分的任何热依赖性降解。该过程可使用任 何适合的装置(例如诸如螺杆均化器的均化器)与挤压型装置的联合，如 例如WO 2008/132707(Sigmoid Pharma)所述，其通过引用整体并入文 本。
因此，本发明包括如下方法，其中通过单孔喷嘴喷射水相和表面活 性剂相的混合物以形成液滴，然后促使或使水凝胶形成聚合物固化，液滴 由此形成珠子，其中水凝胶形成聚合物为热致性聚合物或热致性聚合物的 混合物，水相(也称为水性预混合物)处于较高的温度下，表面活性剂相 (也称为表面活性剂预混合物)处于适当不超过环境温度的低温下，两种 预混合物通过各自的进料管流入混合装置，在此混合两种预混合物，其中 与从混合装置行进至喷嘴的混合物相比，两种预混合物的至少一种通过其 进料管行进的距离更长。可在与喷嘴并排设置的位置混合两相，例如通过 与喷嘴并排设置的线流混合装置。
本发明包括如下方法，其中在混合两种预混合物之前，表面活性剂 预混合物处于比水性预混合物低的温度下。可利用使表面活性剂预混合物 保持在比水性预混合物低的温度下来降低该过程期间对组合物中热不稳 定性组分(例如，微生物和/或佐剂)的损害。在一些实施方案中，可有 利的是紧邻喷嘴形成表面活性剂和水性预混合物的混合物。这种布置使混 合物能够从喷嘴(通常为单孔喷嘴)以液滴的形式立即被喷射到冷却介质 中，从而最小化表面活性剂预混合物(其可包含诸如抗原或佐剂的热不稳 定性物质)组分暴露于升高温度的时间。表面活性剂预混合物组分在该过 程期间暴露于升高温度的时间还可通过将混合装置(例如线流混合器)的 出口定位在紧邻喷嘴的地方和/或利用从混合装置到喷嘴的高混合物流速 来最小化。冷却介质可如本文所述，例如低温气体或诸如油浴的合适液体 介质。
一般而言，当自组装结构形成表面活性剂是液体时，无需对其进行 加热，在室温下添加活性成分，同时进行搅拌直至澄清。可能的是表面活 性剂相可包含额外组分。除表面活性剂之外的这些其他组分可包括挥发性 (或非挥发性)溶剂。表面活性剂相还可包含适量的活性成分(如果在将 表面活性剂与水相混合之前添加到表面活性剂中添加了的话)以获得活性 成分的目标比例，如本文其他部分和实施例中所述。在表面活性剂是蜡质 固体(例如Kolliphor HS 15)的实施方案中，适当地将蜡质固体加热至 例如高于30℃以提供液体。
如上所述，通过边搅拌边向液体水相中添加表面活性剂形成分散体。 那么，得到的分散体中含有上文所述固化珠子中的组合物，但是仍存在有 液态水。
可在混合水相和表面活性剂后任选添加一种或更多种活性成分。
然后，将自组装结构分散体倒入或引入模具或其他容器中或倒在薄 片上或片层之间或逐滴将其递送(或挤出)到另一流体中使得含聚合物基 质的水相经固化后拥有期望的模具、容器、片层或液滴/珠子形式。优选 在不延迟的情况下进行模具形成，例如形成珠子。
可采用专用或定制机器例如来产生上文所述的半球形珠子(参见上 文标题为“形状、尺寸和几何形状”部分)代替成模，其中本发明采用半 球形珠子形式。可能的是制备通过利用专用装置将两个这样的半球体连接 而制备的单个珠子(即每个珠子具有两个不同的半体)，在所述专用装置 中，在挤出点或喷嘴(其可处于振动状态)前短时间内，两种不同乳剂流 经之通常具有圆形截面的两个管相连形成具有使两个乳剂流分开的平壁 的单双腔管，并且这两个管防止两种乳剂在挤出点之前接触。因此，在挤 出点前处于连接状态的双腔管的截面看起来像两个半球形。在操作中，两 个半球状乳剂流在挤出时合并形成单个基本球形的珠子，挤出使得用于固 化的正常液滴被喷射/挤出。
根据基质聚合物，固化可以多种方式进行，例如通过改变模具、容 器、片层、液滴/珠子等周围的温度或通过使用固化流体或硬化溶液从而 胶凝或固化模制的形状。在某些实施方案中，可一起或同时采用改变温度 和使用固化流体或硬化溶液两者。
在本发明的组合物采用珠子形式的优选实施方案，可例如通过使自 组装结构分散体逐滴落入使其固化的流体中形成珠子。当待形成珠子之乳 剂的粘度达到特定点，液滴制剂形成变得更加困难，然后优选专用装置。
使用术语“干的”并非试图提示干燥步骤是产生干胶束分散体所必 需的(但是不排除在外)，而是固体或经固化的水外相基本不含水或不含 可用水。水相(外部相)的固化可通过多种方式发生，包括通过化学方法 (例如通过交联)或通过物理方法(例如通过冷却或加热)。在此方面， 本文献仍采用术语“水相”来指代本发明珠子的外部(连续)相，尽管在 某些实施方案中，水很大程度上不存在于(或被截留在珠子的交联基质中) 本发明的珠子中。然而，本发明组合物的外部相是水溶性的，并且溶于水 性介质中。在一个实施方案中，无论固体组合物中胶束形成表面活性剂采 用的形式为何，当水相溶解或暴露于水性介质时，自组装结构被释放。
因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物在溶解或在经 口施用组合物后暴露于水性介质(例如溶解介质，例如胃肠液)时释放自 组装结构。在一些实施方案中，从组合物中释放的自组装结构(例如胶束) 为约0.5nm至200nm，例如约1nm至50nm或约5nm和25nm。自 组装结构(例如胶束)的尺寸可通过例如上文限定的动态光散射确定。适 当地，如下确定所述自组织结构(例如胶束)从本发明组合物中的释放： 将组合物置于水性溶解介质中，并利用动态光散射测量被释放到溶解介质 中的自组装结构的尺寸。溶解介质应使得含有水凝胶形成聚合物的基质暴 露于水性介质从而形成和/或释放自组装结构(例如胶束)到溶解介质中。 因此，当对组合物进行包衣以延缓或控制释放时，可能有必要调节例如介 质的pH或在溶解介质中的滞留时间，从而使溶解介质能够渗入含有水凝 胶基质的芯，并允许形成和/或释放自组装结构到溶解介质中。例如，当 组合物包覆有肠溶包衣时，可需要将溶解介质的pH升高至pH＞5.5或 ＞6.5以允许肠溶包衣溶解并使芯暴露于水性溶解介质中。用于测量自组 装结构的溶解介质可简单地是水，例如pH为7.2至7.3的37℃水。将组 合物置于溶解介质后，可定期对溶解介质取样，并利用例如本文所述的动 态光散射方法分析自组装结构的存在或从组合物中的释放。
在固化可通过升高或降低温度实现的情况下，可调整固化流体的温 度以获得期望的固化速率。例如，当使用明胶作为水凝胶形成聚合物时， 固化流体处于比乳剂温度低的温度下，由此导致聚合物基质固化。在该情 况下，将固化流体称为冷却流体。
在固化可通过化学方法，例如通过在暴露于固化流体组分时诱导交 联来实现的情况下，可调整固化流体中所述组分的浓度和/或其温度(或 其他特性或组分)以获得期望的固化速率和固化程度。例如，如果选择海 藻酸盐作为聚合物基质，则固化流体的一种组分可以是能够诱导海藻酸盐 和随后的固化交联的含钙实体(例如氯化钙)。或者，在形成珠子之前， 相同或类似的含钙实体可包含(例如分散)在流体乳剂的水相中，并通过 使乳剂液滴逐滴落入或加入到其中的固化流体具有更高或更低的pH来 触发交联。根据得到的珠子特性，可通过控制钙离子利用度(浓度)和其 他物理条件(尤其是温度)改变所述静电交联。固化流体可以是气体(例 如空气)或液体或两者。例如，当使用明胶作为水凝胶形成聚合物基质时， 固化流体可以起初是气态(例如液滴通过冷却空气)，然后，随后是液态 (例如液滴通过冷却液)。还可使用反向顺序，并且还可单独使用气态或 液态冷却流体。或者，流体可以是喷雾冷却的，其中将乳剂喷雾到冷却气 体中以使其固化。
在指定明胶或其他水溶性聚合物(或聚合物混合物)来形成固定化 基质的情况下，优选固化流体为非水性流体(例如中链甘油三酯、矿物油 或优选地具有低HLB的类似物质以确保最小润湿)，可将所述流体方便 地置于浴(冷却浴)中以接收胶束分散体液滴，同时液滴固化形成珠子。 使用非水性流体为选择进行冷凝过程的温度提供了更大的灵活性。
在采用流体冷却浴的情况下，当使用标准水凝胶作为水凝胶形成聚 合物时，通常使冷却浴保持在低于20℃，优选保持在5℃至15℃，更优 选8℃至12℃。如果选择甘油三酯作为冷却浴中的冷却液，那么一个优选 实例为来自Sasol的Miglyol 810。
如果选择明胶或其他热致性聚合物或聚合物混合物作为水凝胶形成 聚合物基质，则合适的温度范围应确保聚合物以适当的速率固化以避免破 坏例如在活性成分为蛋白质的情况下蛋白质的三级结构。
如果选择海藻酸盐作为聚合物基质，制备珠子的典型方法包括逐滴 将如上所述油滴分散于其中的3％海藻酸钠溶液加入到4℃含有0.1M氯 化钙的交联浴中以产生海藻酸钙(可将此方法称为“扩散硬化”，因为认 为钙扩散到珠子中从而引起交联或硬化)。利用注射泵或Inotech仪，可 通过无菌针头或其他喷嘴(本文其他部分所述)产生或挤出(如果使用泵 的话，以5mL/h产生或挤出)液滴，如本文其他部分所讨论，针头或喷 嘴可以处于振动状态。如果期望的话，可在通过4.5mm管时将15L/分 钟至20L/分钟的空气速率向下施加到针头上以减小液滴尺寸。然后，可 在氯化钙浴中搅拌新形成的珠子长达1小时。如果使用角叉菜胶作为聚合 物基质，可利用盐和降低温度(例如通过落入冷却油中)两者来实现固化。
当使用海藻酸盐时，一种替代方法是内部凝胶化，其中钙离子在激 活之前分散在水相中，以导致水胶体颗粒凝胶化。例如，可如下实现此方 法：添加将导致海藻酸盐交联的离子的失活形式，然后在完成足够的离子 分散体后，可通过改变例如pH来激活所述离子(参见Glicksman，1983a； Hoefler，2004，两篇文献均通过引用并入本文)。在期望快速凝胶化和/ 或扩散方法通过使API扩散在交联浴中而可能导致其损失的情况下，该 方法特别有用。
当使用除海藻酸盐之外的另一种离子型聚合物时，可使用与本文中 针对海藻酸盐所描述之方法类似的合适方法。
在形状形成、模制或形成珠子之后，如果合适的话，可对得到的形 状或形式进行洗涤，然后干燥。因此，在用固化流体固化珠子的情况下， 上文所述制备方法中的任选最后步骤包括从固化液中移除经固化的珠子。 这可通过例如在网状篮中收集实现，通过网状篮固化流体(例如中链甘油 三酯)被排出，而珠子保留下来，优选在不延迟的情况下进行，例如珠子 一形成就进行，或者在其形成后5、10、15、20、25或30分钟内进行。 然后，利用离心装置(或适用于去除过量液体的其他装置或机器)除去过 量的固化流体，随后干燥珠子以除去水或自由水和/或除去用于溶解前述 步骤中活性成分或促进其溶解的部分或全部任何额外溶剂(例如乙醇或异 丙醇)，任选地，然后进行洗涤(例如利用乙酸乙酯)和随后的“干燥” 步骤以除去过量的溶剂(例如乙酸乙酯)。异丙醇是优选在减少油或水相 中残留物的过程后期去除的溶剂的一个实例。干燥可通过本领域中公知的 任何合适方法实现，例如使用滚筒干燥机(例如Freund滚筒干燥机，其 可以是Spherex设备系列的一部分，如使用的话)，其利用15℃至25℃， 优选20℃左右的热空气导致水通过空气蒸发或带走。在大多数情况下， 使用明胶作为聚合物基质(例如作为水性固定相的主要组分)需要干燥步 骤，对于珠子，干燥步骤优选通过在上文所述的空气中干燥实现。如上文 更详细所述，得到的组合物(本发明的组合物)基本是干燥的。
根据自组装结构分散体液滴可在上述珠子形成过程第一步中形成的 方式，可对上述方法进行改变，包括将液滴引入多种固化流体中。
一般情况下，珠子可通过在液态分散体(水相和表面活性剂相的混 合物)和合适的固化流体(例如气体或液体)之间施加表面张力来产生， 从而产生球形或基本球形的最终珠子。
或者，可如下产生珠子：通过具有特定直径的孔或喷嘴喷射或挤出 液态分散体，并且任选使孔或喷嘴经受选择的振动频率和/或重力流。可 使用的机器的实例为Freund Spherex、ITAS/Lambo、Globex或Inotech 加工设备。由Freund制造之Spherex机(需要时)制备本发明的珠子的 操作在美国专利5,882,680(Freund)中有所描述，其全部内容通过引用 并入文本。优选选择10RPM至15RPM的振动频率，但是最终的选择 (和各自选择的振幅)取决于待形成珠子之分散体的粘度。如果选择在低 温下固化的聚合物基质，可能适当的是，使通往孔/喷嘴的管保持在一定 温度下以保持溶液的流动性。
因此，应当理解的是，本发明包括用于制备本发明组合物的方法， 其包括：形成包含水和水溶性/可分散性材料(因此包含水凝胶形成聚合 物)的水性预混合物和包含表面活性剂、微生物和任选佐剂以及表面活性 剂可溶性/可分散性材料的表面活性剂预混合物，并将两种预混合物合并 以形成含有水凝胶形成聚合物之水相中的分散体(分散相)。然后，可使 分散体成形为诸如珠子的成形单元。更具体地，组合物的制备可任选包括：
(i)形成含有水溶性组分(例如本文其他部分所述的水凝胶形成聚 合物、任何水溶性赋形剂、任何亲水性营养物)的水溶液或通常由该溶液 组成的水相预混合物；
(ii)形成含有微生物、任选佐剂以及选自疏水性和两亲性组分的任 选其他组分(例如本文其他部分所述的营养物质)在表面活性剂中的混合 物的表面活性剂相预混物；
(iii)将两相混合以形成分散体；以及任选地
(iv)如下将分散体配制成珠子：例如通过单孔喷嘴喷射该分散体以 形成液滴，促使或使该液滴落入与水不混溶的冷却液中，在此液滴冷凝 而形成珠子，然后使从冷却液中分离珠子。
一些制备方法包括下文的步骤(A)至(D)或者制备方法可包括步 骤(A)至(D)中的单个步骤或其任意组合。
(A)示例性制备水相：
在搅动(超声波处理或搅拌)条件下，将水相组分添加到水(例如经纯化 的水)中。将温度逐渐升高至例如55℃至75℃，特别是65℃，以实现固 体完全溶解。水相组分包含水凝胶形成聚合物(例如明胶或琼脂)和任选 的一种或更多种其他赋形剂(例如D-山梨糖醇，一种增塑剂)以及任选 的一种或更多种活性成分。可能的水相组分在本文其他部分中进行了描 述。水相组分可包含微生物细胞(无论完整和/或片段化)。如本文所述， 本发明在此公开了其中至少一部分微生物组分(任选地全部微生物组分) 在制备期间被添加到表面活性剂相中的方法及其产品。尽管如此，本发明 确实涵盖其中全部微生物组分位于水相中的组合物和方法。
明胶可以是A型明胶。在一些较不优选的实施方案中，明胶为B型 明胶。明胶的Bloom强度可以是125至300，任选200至300，例如250 至300，特别是275。可搅动水相组分一段时间例如1小时至12小时以完 成水相的制备(水性预混合物)。
(B)示例性制备表面活性剂相：
在搅动(超声波处理或搅拌)条件下，将表面活性剂相组分添加到表面活 性剂(例如经纯化的水)中。将温度逐渐升高至，例如在蜡质表面活性剂 (例如Kolliphor HS 15)的情况下，通常35℃至50℃，特别是40℃以实 现固体完全溶解。因此，通常搅拌表面活性剂相组分，例如搅拌至获得透 明溶液。表面活性剂相组分包括诸如HS15的表面活性剂和任 选的一种或更多种活性成分。可能的表面活性剂相组分在本文其他部分中 进行了描述。特别地，表面活性剂相可包含微生物细胞(无论完整和/或 片段化)和佐剂(一般情况下)。可搅动表面活性剂相组分一段时间例如 10小时至3小时以完成表面活性剂相的制备(表面活性剂预混合物)。
水相和表面活性剂相中的至少之一包含至少一种活性成分。
(C)示例性混合两相：
将水相和表面活性剂相混合。两相可以期望重量混合，例如，表面活性剂 相与水相的重量比可以是1∶1至1∶10，例如1∶1至1∶6，任选1∶1至1∶4， 在一些情况下1∶3至1∶4。在另一些实施方案中，表面活性剂相与水相的 重量比可以是1∶1至1∶3，例如1∶1至1∶2.5，或1∶1至1∶2，例如1∶1.4至 1.6。在较高的温度下搅动(例如超声波处理或搅拌)所得溶液，例如在 表面活性剂为聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯，例如Kolliphor HS 15，或具有 与Kolliphor HS 15相似的熔点的情况下，所述较高的温度为55℃至75 ℃，特别是65℃，以获得均质的胶束分散体，然后使均质分散体成形为 珠子。特别地，通过单孔喷嘴喷射均质分散体以形成液滴落入冷却介质中。 适当振动喷嘴有利于形成液滴。喷嘴可以2Hz至200Hz及任选15Hz至 50Hz的频率振动。
冷却介质可以是例如空气或油，油适当是生理学上可接受的油，例 如中链甘油三酯(例如Miglyol 810N)的情况。冷却介质可处于冷却温度 下，通常低于15℃，例如低于10℃但高于0℃。在一些实施方案中，冷 却温度为8℃至10℃。喷嘴尺寸(直径)一般为0.5mm至7.5mm，例 如0.5mm至5mm，任选0.5mm至4mm。在一些实施方案中，喷嘴直 径为1mm至5mm，例如2mm至5mm，任选3mm至4mm，特别地 可以是3.4mm。
通过3.4mm喷嘴的流量为5g/分钟至35g/分钟，任选10g/分钟至 20g/分钟。对于不同尺寸的喷嘴，可对喷嘴面积进行适当调整。
在本说明书上文和其他部分所述之方法的一些具体实施方案中，将 表面活性剂相和水相混合导致形成微乳剂或具有微乳剂特征的组合物，其 中如前文所述含有表面活性剂的自组装结构分散在含有水凝胶形成聚合 物的水相中以提供热力学稳定的透明组合物。例如，将两相混合可导致包 含含有聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(例如Kolliphor HS 15)之胶束的微乳 剂，例如聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯分散在含有诸如明胶的水凝胶聚合物 的水相中。
(D)示例性加工珠子：
回收经历冷却的珠子，例如可在15分钟至60分钟的滞留时间后，例如在 约30分钟后从冷却油回收这些珠子。离心从冷却液(例如油)回收的珠 子以除去过量的冷却液，然后干燥。适当地，在室温(例如15℃至25℃， 任选20℃至25℃)下进行干燥。可在滚筒干燥机中进行干燥一段时间， 例如6小时至24小时，例如约12小时在于室温下干燥珠子的情况下。可 适当地用至少部分与水不混溶的挥发性非水性液体洗涤经干燥的珠子，例 如可用乙酸乙酯洗涤经干燥的珠子。在室温(例如15℃至25℃，任选20 ℃至25℃)下干燥经洗涤的珠子。可在滚筒干燥机中进行干燥6小时至 48小时的一段时间，例如，在于室温下干燥珠子的情况下约24小时。干 燥后，使珠子通过孔尺寸为1mm至10mm、任选2mm至5mm的筛以 除去尺寸过大的珠子，然后使珠子通过孔尺寸为0.5mm至9mm、任选1 mm至4mm的筛以除去尺寸过小的珠子。
可以理解的是，可再循环被筛分过程丢弃的珠子。
Spherex机等可适于利用双同心腔喷嘴来确保两种流体同时挤出，内 腔中的流体形成芯，外腔中的流体形成囊。根据所述方法之一固化形成囊 的流体。理想或不理想的是，形成芯的流体易于经受固化以产生本发明组 合物的一个特定实施方案。
可使用以这种方式适配的上述机器来制备呈囊形式的本发明组合 物，其中组合物的芯填充有上文标题“形状、尺寸和几何形状”部分中所 述的流体(气体或液体)(注意，根据本发明，类似囊材料的芯可以是组 合物，但是任选不同的组合物即易于通过本文所述方法之一固化的组合 物)。可采用三腔喷嘴和合适的管，如需在球体内表面上包括中间内层(例 如非水性材料的内膜层)的话，其中中间层在室温下方便地呈固体。因此， 根据连续层的柔软度/硬度，可将组合物描述为例如固体：固体(在二层 的情况下)或固体：固体：固体(在三层的情况下)或液体/半液体：固 体：固体(在三层的情况下)。
本发明的另一方面提供了通过本文所述任意方法(或具有本文所述 任意方法的特征)可获得的组合物。
前述段落描述了未经包衣珠子的形成。本发明的一个优选实施方案 是具有经包衣的珠子，其在本文其他部分中进行了更详细地描述。所述包 衣可以是单层或多层，并且可以多种方式施加(参见各自部分)。
对于利用双同心孔(中心和外部)的一种上述方法(通过任选振动 的喷嘴喷射乳剂)，外部液体可形成例如聚合物材料包衣(聚合物包衣)， 包衣可包含活性成分或可赋予珠子控释特性，内层(芯)可以是本发明的 组合物。优选利用Freund制造的Spherex机(参见属于Freund的美国 专利5,882,680)(该专利的全部内容通过引用并入文本)。还可利用其 他类似的喷射或挤出设备，例如前述喷射设备。
使用Spherex机获得很高的单分散性。例如，在典型100g中，批次 97g珠子的直径为1.4mm至2mm，或1mm至2mm。期望的尺寸范围 可通过本领域中公知之用于丢弃/筛选不同尺寸颗粒的方法获得。例如可 通过使批次先通过例如2mm网状物，然后使其通过1.4mm网状物来丢 弃/筛选出较大/较小的珠子。
如果期望对珠子进行包衣，那么1.4mm至2mm的直径范围较佳(如 果更小，包衣机的喷雾可越过珠子，如果太大，珠子可能更加难以液化， 而液化是获得一致包衣所必需的)。
珠子优选是内部(即截面)均质的，即单片(monolithic)，但是可 对加工条件进行改变，例如通过改变流体乳剂、固化流体的温度、这些流 体中的组分浓度以及允许某些加工步骤(包括干燥)发生的时间。尽管目 前并不优选，但是可将这些改变应用于获得异质性的珠子制备情况，所述 异质性例如，硬皮和软芯，同时较不完全使油滴固定在与珠子表面相对的 芯。特别的是，可将具有较大(例如非珠子的)外形或形状的本发明组合 物改造成体现这种异质性。然而，目前优选包括内部均质的本发明组合物， 在该珠子实施方案中，这可通过利用均质的介质(例如分散良好的胶束) 进行珠子形成/液滴形成来促成。待形成珠子之胶束分散体的这种均质性 可有助于避免影响对称性的干燥条件。
本发明还提供了具有根据本文所述获得的组合物的特征的产品，所 述产品受被组合物特征限定之特征的限定，而不受其制备方法的限定。 包衣
可向珠子施加包衣以靶向释放、控释和/或缓释活性成分，特别是微 生物和任选的佐剂。例如如果需要结肠释放的话，应用适当的包衣允许例 如少于10％的活性成分在4小时内溶解(于溶解介质中)，然后爆发(突 然释放)并在随后的24小时内趋向最大溶解(接近100％)。很多其他 靶向特性是可能的，该实施例仅出于说明目的。
因此，根据本发明的一个实施方案，本发明提供了含有珠子群的剂 型，其中至少一些珠子(任选所有珠子)具有包衣(即，被包覆)以控制 从珠子释放活性成分(微生物和任选的佐剂)。在一个实施方案中，包衣 为薄膜，在另一实施方案中，包衣为膜。包衣(例如薄膜或膜)可用于延 缓释放直到胃之后，并可用于保护微生物和任何佐剂免受胃酸，包衣因而 可以是肠溶包衣。包衣可包含优选具有聚合物性质的一种或更多种物质 (例如，如下文中更详细描述的甲基丙烯酸酯等；多糖等)或多于一种所 述物质的组合，任选包含其他赋形剂或活性成分，例如增塑剂，如例如上 文中关于活性成分部分所述。如使用增塑剂的话，优选的增塑剂包括亲水 性增塑剂，例如在使用家族聚合物作为包衣时，特别优选柠檬 酸三乙酯(TEC)，如下文所述。相对于利用乙基纤维素包衣，下文更 详细描述之另一优选增塑剂为DBS。任选包含的替代或额外赋形剂为助 流剂。助流剂是一种被添加到粉末或其他介质中以改善其流动性的物质。 典型的助流剂为在使用家族聚合物作为包衣时优选的滑石。
可以有一种或更多种包含本文其他部分所述的活性成分(例如刺激 免疫系统的营养物质，例如营养物质组合)的包衣。所述包衣可以是即刻 释放包衣、延缓释放包衣或持续释放包衣。立即释放包衣含有的此类营养 物质和/或其他活性成分可以超过/或低于控释包衣(例如超过低于肠溶包 衣或可腐蚀包衣)提供。
在本发明的一些实施方案中，组合物包含水凝胶形成聚合物和如下 的其他聚合物，其能够实现有需要地延缓(或其他改变)药物和/或包衣 部分和/或包衣中暴露的组合物的释放从而允许药物外出和/或固定基质 溶解。在一个实施方案中，组合物包含两种类型的聚合物，这两种聚合物 可组合成同一聚合物材料或作为单独包衣提供而应用于组合物。
受控释放可在不添加包衣的情况下实现。在此情况下，聚合物基质 包含旨在控制活性成分释放的其他聚合物。尽管本发明包括水凝胶形成聚 合物的混合物，但是在很多实施方案中，本发明的组合物包含基本单一或 单一类型的聚合物基质材料(尤其是本文所述材料中的单一或单一类型材 料)和/或可在水相中不包含特定的额外聚合物组分的情况下固化的基质。 但是，可优选获得特定表现特性的混合物。因此，可能需要向水溶性聚合 物基质中引入特定的限制或延缓物质(延缓剂)。在某些实施方案中，所 述引入允许省去包衣。在另一些实施方案中，当限制剂或延缓剂包含在水 溶性聚合物基质中时，可存在包衣并且是期望的。例如，选择引入不溶于 酸性环境(例如胃)的延缓剂来预防或延缓在胃内释放，可无需进行包衣， 即组合物可不包含包衣。或者，可选择引入溶于酸性环境(例如胃)的延 缓剂来延缓在远离胃的肠道内释放。同样可无需进行包衣，即组合物可不 包含包衣。然而，可利用例如耐酸聚合物来对引入溶于酸性介质之延缓剂 的本发明组合物进行包衣以获得特定的优点。由于耐酸聚合物包衣的作 用，可防止(完成)所述组合物发生胃释放(或延缓胃释放)。在失去包 衣后，由于远离的胃小肠和大肠的环境不再呈酸性，所述酸溶性试剂延缓 释放。
不溶于酸性环境的延缓剂或限制剂包括具有pH依赖性溶解性(即在 高pH下是可溶的)的聚合物。所述聚合物在下文标题“包衣”部分中进 行了详细描述，所述聚合物可用作包衣或用作延缓剂加入到水溶性聚合物 基质中。下文标题“包衣”部分中提及的合适延缓剂的一个实例为用于防 止在胃环境中释放的HPMCP(羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸，也称为 羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯)，因为在高于pH 5.5时，其是可溶的-参见 溶于非酸性(碱性)介质之聚合物之其他实例的部分。HPMCP还可用作 成孔剂。溶于酸性环境的延缓剂或限制剂包括具有pH依赖性溶解性(即 在低pH下是可溶的)的聚合物。所述聚合物包括阳离子聚合物，例如基 于二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸甲酯的共 聚物。根据本发明可使用的所述阳离子共聚物的一个实例购自Evonik  Industry的Eudragit E PO。
之前已声明，本发明的剂型可包含多于一种珠子群。在包衣实施方 案中，群间的不同之处可在于包衣，即两(或更多)群珠子可在很多方面 不同，其中之一为包衣。
包衣可按照下文所述施加，并且可对其厚度和密度进行改变。包衣 的量受本发明干组合物(例如珠子)中添加(增加)的额外重量限定。重 量增加优选为珠子干重的0.1％至50％，优选1％至15％，更优选3％至 10％或5％至12％或8％至12％。
聚合物包衣材料可包含甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸铵共聚物或 其混合物。诸如EUDRAGITTM S和EUDRAGITTM L(Evonik)的甲基 丙烯酸共聚物尤其适用。这些聚合物是抗胃溶并且可肠溶的聚合物。这些 聚合物膜不溶于纯水和稀酸。这些聚合物可在高pH下溶解，基于其羧酸 含量。EUDRAGITTM S和EUDRAGITTM L单独或任意比例的组合可用 作聚合物包衣中的组分。通过使用聚合物组合，聚合物材料可在多种pH 水平下表现出溶解性，例如EUDRAGITTM L和EUDRAGITTM S各自均 可溶解的pH之间的pH。具体地，包衣可以是含有本段所述之一种或更 多种共聚物的肠溶包衣。提及的具体包衣材料为Eudragit L 30D-55。
下文中使用商标“EUDRAGIT”来指代甲基丙烯酸共聚物，特别是 由Evonik以EUDRAGITTM销售的甲基丙烯酸共聚物。
包衣可包含含有大比例(例如为总聚合物包衣含量的大于50％)的 至少一种可药用水溶性聚合物和任选少量(例如为总聚合物包衣含量的低 于50％)的至少一种可药用水不溶性聚合物的聚合物材料。或者，膜包 衣可包含含有大比例(例如为总聚合物含量的大于50％)的至少一种可 药用水不溶性聚合物和任选少量(例如为总聚合物含量的低于50％)的 至少一种可药用水溶性聚合物的聚合物材料。
诸如EUDRAGITTM RS和EUDRAGITTM RL(Evonik)的甲基丙烯 酸铵共聚物适用于本发明。这些共聚物不溶于纯水、稀酸、缓冲液和/或 遍布整个生理pH范围的消化液。聚合物在水和消化液中的溶胀不依赖于 pH。然后，溶胀状态的这些聚合物对水和溶解的活性剂可渗透。聚合物 的渗透性基于聚合物中丙烯酸乙酯(EA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)和 三甲基铵乙基甲基丙烯酸酯氯化物(TAMCI)基团的比例。例如， EA∶MMA∶TAMCI比例为1∶2∶0.2的聚合物(EUDRAGITTM RL)比比例 为1∶2∶0.1的聚合物(EUDRAGITTM RS)具有更高的渗透性。聚合物 EUDRAGITTM RL为具有高渗透性的不溶性聚合物。聚合物 EUDRAGITTM RS为具有低渗透性的不溶性膜。该家族中的一种扩散控 制pH依赖性聚合物为RS 30D，其为丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和少 量甲基丙烯酸酯的共聚物，其中季铵基以盐的形式存在以使聚合物具有渗 透性。RS 30D可以水性分散体的形式获得。
甲基丙烯酸铵共聚物可以任意期望的比例组合，并且可改变该比例 来改变药物的释放速率。例如可使用90∶10的EUDRAGITTM RS： EUDRAGITTM RL比例。或者，EUDRAGITTM RS：EUDRAGITTM RL的 比例可为约100∶0至约80∶20，或约100∶0至约90∶10，或它们之间的任意 比例。在所述配制中，渗透性较低的聚合物EUDRAGITTM RS通常与溶 解性更高的RL一起构成聚合物材料的大部分，当RL溶解时，其允许形 成间隙，通过该间隙溶质可与珠子接触从而使得预先溶解的药物活性成分 可以受控的方式逃脱。
甲基丙烯酸铵共聚物可与聚合物材料中的甲基丙烯酸共聚物组合来 实现有需要地延缓(或其他改变)药物和/或包衣部分和/或包衣中暴露的 组合物的释放从而允许药物外出和/或固定或水溶性聚合物基质溶解。可 使用的甲基丙烯酸铵共聚物(例如EUDRAGITTM RS)：甲基丙烯酸共 聚物的比例为约99∶1至约20∶80。还可将这两种类型的聚合物组合成同一 聚合物材料或作为单独包衣提供而应用于珠子。
EudragitTM FS 30D是一种由甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸 甲酯组成的pH敏感性阴离子水基丙烯酸聚合物分散体。该聚合物包含少 量的羧基，因此其可在较高的pH(＞6.5)下溶解。这种体系的优点是其 可简单地利用常规的粉末成层技术和流化床包衣技术在合理的加工时间 内大规模制备。另一实例是L 30D-55，其是以甲基丙烯酸 作为官能团的阴离子聚合物的水性分散体。L 30D-55可作 为30％水性分散体获得。
除上文所述EUDRAGITTM聚合物之外，可使用大量其他这样的共聚 物来控释药物释放。这些共聚物包括甲基丙烯酸酯共聚物，例如 EUDRAGITTM NE和EUDRAGITTM NM系列。关于EUDRAGITTM聚合 物的更多信息可见于Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical  Dosage Forms，编著.James Mcginity，Marcel Dekker Inc.，New York，第 109-114页中的“Chemistry and Application Properties of  Polymethacrylate Coating Systems”，其通过引用整体并入本文。
羟丙基甲基纤维素(HPMC)的一些衍生物也表现出pH依赖性溶解 性，因此可在本发明中用于形成包衣。这些衍生物包括在上端肠道中快速 溶解的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)和羟丙基甲基纤维素 乙酸琥珀酸酯(HPMCAS)，其中可电离羧基的存在导致聚合物在高pH (＞5.5针对LF级，＞6.8针对HF级)下溶解。这些聚合物可从Shin-Etsu  Chemical Co.Ltd商购。对于本文描述之用于形成包衣的其他聚合物，可 将HPMC和衍生物与其他聚合物(例如，EUDRAGIT RL-30D)组合。
可使用其溶解特性和/或其释放本发明组合物中引入的活性成分的能 力依赖于pH的聚合物包衣物质。已给出实例(例如Eudragit RS和RL)。 pH依赖性聚合物包衣物质的另一实例是乙基纤维素。应当理解的是，除 乙基纤维素和液体载剂(在液体组合物的情况下)之外，用于形成剂型包 衣的乙基纤维素组合物可包含一种或更多种其他组分。所述其他组分可用 于调节组合物的特性，例如稳定性。乙基纤维素可以是所述组合物中的单 独控释聚合物。用于包衣剂型的乙基纤维素的量可以是组合物干重的按重 量计至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。 因此，乙基纤维素包衣可包含除乙基纤维素之外的其他组分。乙基纤维素 的量可以是乙基纤维素包衣的按重量计至少50％、至少60％、至少70％、 至少80％、至少90％或至少95％。
可应用于本发明组合物的特定乙基纤维素包衣组合物为颗粒尺寸范 围为亚微米至微米，例如尺寸为0.1微米至10微米的乙基纤维素分散体， 其借助于诸如油酸铵的乳化剂均匀悬浮于水中。乙基纤维素分散体可任选 并优选包含增塑剂，例如癸二酸二丁酯(DBS)或中链甘油三酯。所述乙 基纤维素分散体可例如根据美国专利No.4,502,888制备，其通过引用并 入文本。适用于本发明且可商购的一种这样的乙基纤维素分散体由 Colorcon of West Point，Pa.USA以商标市售。在该市售产品 中，乙基纤维素颗粒例如与油酸和增塑剂混合在一起，然后经历任选挤出 和熔化。然后，任选地在高剪切混合装置中，例如在压力条件下直接例如 用氨化水乳化熔融的增塑乙基纤维素。油酸铵可以原位形成，例如以稳定 和形成增塑的乙基纤维素颗粒的分散体。然后，可添加额外的纯化水以获 得最终的固体内容物。另参见美国专利No.4,123,403，其通过引用并入文 本。
下文中使用商标来指代乙基纤维素包衣材料，例如颗 粒尺寸范围为亚微米至微米(例如尺寸为约0.1微米至10微米)的乙基 纤维素分散体，其借助于诸如油酸铵的乳化剂(例如，油酸铵)均匀悬浮 于水中。特别地，本文所用的商标指由Colorcon以 商标市售的产品。
分散体是膜形成聚合物、增塑剂和稳定剂组合的一个实 例，其可用作包衣以调节活性成分的释放速率，并且具有对pH相对不敏 感的可再现(reproducible)特性。药物释放的主要方式是借助于通过 分散膜扩散，并受膜厚度直接控制。特别优选使用可能的是增加或降低用作包衣之的量以改进经包衣组合物的 溶解。除非另有限定，否则术语“″Surelease”的用途可适用于Surelease  E-7-19020、E-7-19030、E-7-19040或E-7-19050。E-7-19020包括乙基纤 维素与油酸和癸二酸二丁酯相混合，然后经历挤压和熔化。然后，在高剪 切混合装置中，在压力条件下直接用氨化水乳化熔融的增塑乙基纤维素。 油酸铵可以原位形成，例如以稳定和形成增塑的乙基纤维素颗粒的分散 体。然后，另外添加经纯化水以获得最终固体物质。E-7-19030额外地包 含分散在材料中的胶态无水二氧化硅。E-7-19040与E-7-19020类似，不 同之处在于E-7-19040包含中链甘油三酯而非癸二酸二丁酯。E-7-19050 来源于在熔化和挤出之前将乙基纤维素和油酸混合。然后，在高剪切混合 装置中，在压力条件下直接用氨化水乳化熔融的增塑乙基纤维素。油酸铵 可以原位形成以稳定和形成增塑的乙基纤维素颗粒的分散体。但是优选 E-7-19040。
本发明还包括使用Surelease与其他包衣组分(例如海藻酸钠，例如 以商品名NutratericTM市售的海藻酸钠)的组合。
除上文讨论的EUDRAGITTM和聚合物之外，还可使用其 他聚合物，特别是肠溶或pH依赖性聚合物。这样的聚合物可包含邻苯二 甲酸酯、丁酸酯、琥珀酸酯和/或苯六甲酸酯基团。此类聚合物包括但不 限于纤维素醋酸酯邻苯二甲酸酯、纤维素醋酸酯琥珀酸酯、纤维素羟基邻 苯二甲酸酯、纤维素醋酸酯偏苯三酸酯、羟丙基-甲基纤维素邻苯二甲酸 酯、羟丙基甲基纤维素醋酸酯琥珀酸酯、淀粉醋酸酯邻苯二甲酸酯、直链 淀粉醋酸酯邻苯二甲酸酯、聚乙烯醋酸酯邻苯二甲酸酯和聚乙烯丁酸酯邻 苯二甲酸酯。此外，在相容的情况下，可将任意的聚合物组合混合以提供 额外的控制或靶向释放特性。
包衣还可包含至少一种可溶性赋形剂以提高聚合物材料的渗透性。 适当地，所述至少一种可溶性赋形剂选自可溶性聚合物、表面活性剂、碱 金属盐、有机酸、糖类和糖醇。所述可溶性赋形剂包括但不限于聚乙烯吡 咯烷酮、聚乙二醇、氯化钠、表面活性剂例如月桂基硫酸钠和聚山梨酯、 有机酸例如乙酸、己二酸、柠檬酸、富马酸、戊二酸、苹果酸、琥珀酸和 酒石酸、糖类例如右旋糖、果糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖、糖醇例如乳糖醇、 麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇和木糖醇、黄原胶、糊精以及麦芽糖糊精。 在一些实施方案中，可使用聚乙烯吡咯烷酮、甘露糖醇和/或聚乙二醇作 为可溶性赋形剂。所述至少一种可溶性赋形剂的使用量可以是基于组合物 总干重的按重量计约1％至约10％。
改变释放速率例如来产生延缓或延长释放可以任意数量的方式实 现。机制可依赖于或不依赖于肠内的局部pH，并且还可依赖于局部酶活 性来获得期望的效果。经改性释放制剂的实例在本领域中是公知的，并且 在例如美国专利No.3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、 4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5120,548、5,073,543、5,639,476、 5,354,556和5,733,566中进行了描述，这些专利均通过引用整体并入文本。
向SureleaseTM或其他pH依赖性聚合物物质中添加易经结肠细菌酶 (任选地或者可替选地经胰腺酶或其他相关酶)降解的第二聚合物(例如 多糖，特别是杂多糖)提供活性成分在第二聚合物发生降解的一个或更多 个部位靶向释放，并可灵活调节聚合物在本发明组合物中的添加量以获得 最佳的溶解特性。
因此，本发明还提供了针对用于在结肠内释放活性有效载荷的组合 物(不管是否属于本发明)的包衣，其是乙基纤维素(优选与诸如油酸铵 的乳化剂和/或诸如癸二酸二丁酯或中链甘油三酯的增塑剂一起配制而 成)和易经通常见于结肠中的细菌酶降解的多糖的组合。所述多糖包括硫 酸软骨素、果胶、葡聚糖、瓜尔胶和淀粉酶、壳聚糖等以及前述物质中任 一种的衍生物。关于获得结肠特异性释放性能，特别优选壳聚糖。本发明 还包括含有乙基纤维素(优选与诸如油酸铵的乳化剂和/或诸如癸二酸二 丁酯或中链甘油三酯的增塑剂一起配制而成)和易经通常见于结肠中的细 菌酶降解的多糖的组合物，该组合物可包含液体载剂，例如水。
出于形成包衣目的，已尝试使用多糖本身并取得了有限的成功。大 多数的非淀粉多糖具有缺乏良好薄膜形成特性的缺点。此外，这些非淀粉 多糖易于在胃肠道内溶胀并变成多孔，导致药物早期释放。甚至是耐受胰 腺α-淀粉酶降解但能够经结肠细菌酶降解的无定形直链淀粉也具有在水 性介质中溶胀的缺点，但是该缺点可通过向直链淀粉薄膜中引入诸如乙基 纤维素和丙烯酸酯的不溶性聚合物而受到控制。尽管直链淀粉不是水溶性 的，但是不排除水溶性多糖(WSP)，本发明人发现当使用易经细菌酶 降解的水溶性多糖(WSP)作为根据本发明该实施方案的包衣时导致特 别有利的结果。在本发明的该实施方案中，特别优选的多糖为果胶。可使 用多种果胶，包括具有不同可选择等级，即具有不同甲基化度(DM)， 即具有不同的经甲醇酯化的羧基百分比的果胶，例如DM大于50％的果 胶，也称为高甲氧基(High Methoxy，HM)果胶或低甲氧基(Low  Methoxy，LM)果胶，或含有HM果胶和LM果胶的果胶组合。在该实 施方案中，还可使用具有不同乙酰化度(DAc)的果胶。总之，将DM和 DAc或取代度一起称为酯化度(Degree of Esterification，DE)。根据本 发明，可使用具有不同DE的果胶。根据本发明的一个实施方案，可将海 藻酸钠用作多糖来作为果胶的替代选择。但是，另一些实施方案可方便地 包括直链淀粉和/含有直链淀粉的淀粉。可使用多种等级的淀粉，其含有 不同百分比直链淀粉，包括直链淀粉百分比为56％的Hylon V(National  Starch Food Innovation)或直链淀粉百分比为70％的Hylon VII。剩余的 百分比为支链淀粉。特别优选多糖果胶、直链淀粉和海藻酸钠以实现结肠 递送，即获得用于在结肠内释放活性成分的组合物。
已发现果胶可在乙基纤维素以其他方式(优选Surelease)提供之包 衣中用作成孔剂。“孔”不是指从组合物表面到芯的轴状洞，而是指在本 发明的包衣上或包衣内部随机发生的缺少或不存在包衣的区域。
成孔剂已在前文结合Surelease(参见例如US 2005/0220878)进行了 描述，但是相对于“胃不溶性”物质(例如海藻酸盐)。
根据本发明的一个具体实施方案，在水溶性多糖(WPS)为果胶时， SureleaseTM：果胶的百分比理想地为90∶10至99∶1，优选95∶5至99∶1， 更优选98∶2至99∶1。
在该特别优选的组合(SureleaseTM+WSP例如果胶)中，可对 SureleaseTM和WSP之间的重量增加和比例进行改变以改进本发明包衣和 组合物(在包有包衣时)的特性。因此，令发明人/申请人意外的是，该 优选的包衣聚合物组合的优点通过选择0％至30％(优选5％至10％)的 重量增加范围和95∶5至99.5∶0.5，优选包括97∶3至99∶1的Surelease： 果胶范围而更显著。使用Surelease的特别有利重量增加是在5％至12％ 或8％至12％范围内的重量增加。
尽管上文一直关注活性成分延长和/或持续从根据本发明的组合物中 释放，但是也包括未经包衣或经单纯肠溶包衣的组合物，其利用足以只使 组合物免于在胃内溶解的肠溶包衣来提供早期小肠活性成分释放。
在用合适的聚合物包衣对组合物进行包衣之前，优选干燥本发明组 合物(如上文/下文更详细所述)。在某些实施方案中，还优选在施加第 一包衣之后施加第二包衣。一般情况下，第一包衣和第二包衣可具有相同 或不同材料，并且可选自本文所述包衣材料中的任意一类。在一些具体实 施方案中，第一包衣任选保护芯(例如珠子)不与第二包衣相互作用，和 /或防止组合物组分浸入第二包衣中。例如，第一包衣可包含羟丙甲纤维 素或者是羟丙甲纤维素，例如第一包衣可由羟丙甲纤维素、二氧化钛和聚 乙二醇的混合物制成；第一包衣可包含至少50重量％羟丙甲纤维素和任 选至少75重量％羟丙甲纤维素，例如至少80重量％或至少85重量％或 90重量％羟丙甲纤维素。因此，用于形成第一包衣的包衣材料可包含前 句提及的干重百分比的羟丙甲纤维素。第二(外层)包衣可为如上所述的 肠溶包衣或包含聚合物(包括经细菌酶或其他酶降解的聚合物)的混合物， 例如由上文所述的Surelease-果胶混合物制成。如果期望第一包衣使用羟 丙甲纤维素、二氧化钛和聚乙二醇的混合物，可获得对应于这些混合物的 市售产品，包括Opadry White，一种由Colorcon市售的产品。更一般地， 可提及以商品名Opadry和Opadry II市售的多种产品。另一些非限制性 实例包括Opadry YS-1-7706-G white、Opadry Yellow 03B92357、Opadry  Blue 03B90842。这些组合物可以干薄膜包衣组合物的形式获得，在临用 前可将这些组合物用水稀释。Opadry和Opadry II制剂包含纤维素膜形 成聚合物(例如HPMC和/或HPC)，并且可包含聚葡萄糖、麦芽糖糊 精、增塑剂(例如三醋精、聚乙二醇)、聚山梨酸酯80、着色剂(例如 二氧化钛，一种或更多种染料或色淀)和/或其他合适的薄膜形成聚合物 (例如丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物)。合适的Opadry或Opadry II 制剂可包含增塑剂和一种或更多种麦芽糖糊精和聚葡萄糖(包括但不限于 a)三醋精和聚葡萄糖或麦芽糖糊精或乳糖，或b)聚乙二醇和聚葡萄糖 或麦芽糖糊精)。特别优选的市售产品为Opadry White(基于 HPMC/HPC)和Opadry II White(基于PVA/PEG)。用于初始保护性 包衣的替代产品(非Opadry)包括以商品名Kollicoat IR市售的聚乙烯 醇-聚乙二醇接枝共聚物和以商品名Eudragit E市售的基于甲基甲基丙烯 酸铵之共聚物。另一优选实例为低分子量HPMC。任选的内层包衣以与 外层(或单独的)包衣(或包衣层)相同的方式施加。
包衣工艺可通过任意合适的方式进行，例如通过利用向组合物施加 聚合物包衣溶液(特别如上所述)的包衣机。用于包衣的聚合物由生厂商 以用于直接使用的现成溶液的形式提供或者可在使用前按照生厂商的使 用说明配制而成。
合适的包衣机为本领域的技术人员所熟知，其包括例如基于带孔锅 或流化床的系统，例如GLATT、Vector(例如CF 360EX)、 ACCELACOTA、Diosna、O′Hara和/或HICOATER加工设备。需要 提及的是以“底部喷雾”(Bottom Spray)配置使用的MFL/01流化床包 衣机(Freund)。
典型的包衣条件如下：
工艺参数 数值 流化空气流(m3/h) 20至60(优选30至60) 进气温度(℃) 20至65 排气温度(℃) 20至42 产品温度(℃) 20至42 雾化气压(巴) 至多1.4，例如0.8至1.2 喷雾速率(g/分钟) 2至10，和3至25RPM
可利用药学领域中的常规方法(例如利用刚描述的包衣机)用活性 (营养物质和/或药物)层对本发明的组合物进行包衣以制备具有一层或 更多层的组合物，其中每一层均包含本文其他部分所述的一种或更多种活 性营养物、药物或其他成分/赋形剂。药物成层指溶液、混悬液或干粉形 式的至少一层或连续层的药物实体在诸如本文所述珠子的核上沉积。活性 成分可任选地不含赋形剂或与一种或更多种赋形剂组合。
药物成层包括溶液/混悬液成层、粉末成层和粉状药物成层。在溶液/ 混悬液成层中，药物颗粒溶解或悬浮于粘合液体中。在粉末成层中，由于 较低的液体饱和度，无论活性剂在粘合液体中的溶解性如何，均不发生完 全溶解。在粉状药物成层中，先将粘合剂溶液喷雾到预先制备的晶粒 (seed)，例如本文所述的珠子上，然后添加粉末。如上文所述，可使用 常规的锅包衣机来进行聚合物包衣，但是优选改进形式的锅包衣机，包括 流化床和离心旋转式造粒机。合适的造粒机的实例包括Rotor造粒机 (Glatt)、Rotor-加工机(Aeromatic)、Spir-a-Flow(Freund)和CF造 粒机(Freund)。
可应用于本发明组合物和/或引入本发明制备方法中的药物成层技术 的其他实例为Luo等所述的干法包衣(International Journal of  Pharmaceuticals，358，(2008)，第16-22页)。Luo等描述了大量适用于本 发明的干法包衣方法：静电-干法-包衣、增塑剂-干法-包衣、热-干法-包衣 以及增塑剂-静电-热-干法-包衣。热-干法-包衣利用加热得到表面部分熔融 的粉状颗粒作为底部粘合力。包衣工艺通将含有活性成分的包衣材料涂在 滚圆机(spheroniser)中的珠子上来实现。通过例如螺杆电动给料机将包 衣材料涂在珠子上。可通过本领域中公知的任意方法(例如利用红外灯) 对包衣材料进行加热。该技术可用于纯包衣材料或预先加有增塑剂的包衣 材料。
在某些实施方案中，药物成层材料包含活性成分(例如，营养物质) 和表面活性剂，特别是本文所述的表面活性剂，例如用于此过程自组装结 构的表面活性剂和任选的与与水凝胶形成聚合物组合的自组装结构形成 表面活性剂相同的活性剂。用于药物成层的表面活性剂优选为至室温下呈 固体的蜡质表面活性剂(特别是在25℃下呈固体，理想地在30℃下呈固 体)。所述药物成层可通过上文详述的溶液/混悬液或固体方法进行。药 物成层可按照Luo等在International Journal of Pharmaceuticals，358， (2008)，第16-22页中描述的技术进行。表面活性剂可选自上文公开的这 些，因而例如表面活性剂可以是聚乙二醇酯，例如脂肪酸的聚乙二醇酯， 特别是聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，更特别地是Kolliphor HS 15。在一个 代表性实施方案，本发明的组合物可用活性成分和聚乙二醇-15-羟基硬脂 酸酯成层，因此本发明包括具有一或更多个层的组合物，其包含至少一个 含有诸如聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯的表面活性剂和药物的层。在某些实 施方案中，利用上文所述的热-干法-包衣技术使聚乙二醇-15-羟基硬脂酸 酯或其他表面活性剂成层在珠子上。所述至少一个层中并入的表面活性剂 可与形成自组装结构的表面活性剂相同或有时与其不同。
使用本发明的珠子作为用于药物成层的晶粒优于利用传统母粒 (non-pareil)作为通过药物成层工艺制备颗粒的初始基底。一个原因是 本发明珠子的最佳尺寸。另一原因是是传统母粒的主要组分蔗糖存在公知 的缺点，包括对糖尿病具有不利影响和潜在的致龋性。根据现有技术，还 已测试使用微晶纤维素(MCC)作为药物成层的基底，尽管本发明人/ 申请人未意识到在离心造粒工艺中成功使用MCC制备初始芯/珠子，如 可用于本发明的一些实施方案中，因此，在一个实施方案中，本发明提供 了用于制备药物包衣颗粒的方法，其包括使用本文所述的珠子作为药物可 涂覆在其上的晶粒或母粒(即替代颗粒)。在一个相关实施方案中，本发 明的组合物包含包覆有一个或更多个药物层之本文公开的珠子。另一实施 方案为通过利用一种或更多种上文所述的药物成层方法(包括基于喷雾干 燥的方法)来提高水溶性差的活性成分的可溶性的方法。可以将也可以不 将上文详述的聚合物包衣施加到药物成层珠子。但是如果期望的话，可在 经历所述药物成层之后施加聚合物包衣。在施加药物层时，可将待在珠子 上成层的药物任选地先与合适的赋形剂(例如本文其他部分所述的粘合 剂)混合。本发明中特别优选的粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮(还称为聚乙烯 基吡咯烷酮，也称为PVP或聚维酮)。可使用多种K值的PVP。PVP 的K值是其平均分子量、聚合度和固有粘度的函数。特别优选使用PVP  K-32。在该实施方案中，本发明组合物干重的至多5％可由所述粘合剂组 成。优选约1％或更少。可用于药物成层的其他合适粘合剂包括明胶、羧 甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和水解淀粉(例如麦芽糖糊精)。如上文 更一般地所的含有药物层的组合物还可任选地包覆有聚合物包衣或包含 聚合物层，包括任选在该聚合物包衣中包含相同或不同的活性成分。
因此，本发明包括成层珠子，其包含：
含有水凝胶形成聚合物基质或由其组成的芯，其中(i)胶束和/或前 胶束以及(ii)含有选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭 活微生物之抗原的活性成分分散在所述基质中；和
围绕芯并含有活性成分的层，所述活性成分可与芯中包含的活性成分 相同或不同，活性成分层还任选具有控释特性或其他功能。
芯可任选地包含佐剂。任何佐剂和抗原均可包含在胶束和/或前胶束中或 包含在聚合物基质中或包含在这两者中。
成层珠子可具有多个含有活性成分的层，例如2、3、4或5个层， 其中每层中的活性成分可独立于各个其他层中的活性成分而被选择。在一 个实施方案中，各层相互之间均包含相同的活性成分，在另一实施方案中， 任意两层均不包含相同活性成分。本段中的术语“活性成分”涵盖单一活 性实体和活性实体的组合。如上文更一般地描述，成层珠子可包含一个或 更多个控制释放的聚合物层。所述聚合物层可包含活性成分，因而，其包 含药物层以及控释层。或者，聚合物层可不含活性成分。不管聚合物层是 否含有活性成分，其均可位于芯和聚合物层外部的药物层之间，或位于两 个药物层之间或可形成外层。
因此，本发明包括含有以下的成层珠子：
芯，其包含含有水凝胶形成聚合物的基质或由该基质组成，和包含在 基质中的选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的 微生物、表面活性剂和佐剂；
活性成分层，其围绕芯，并且含有活性成分，该活性成分可与芯中包 含的活性成分相同或不同，活性成分层还任选具有控释特性或其他功能； 和
不含活性成分的聚合物层。
聚合物层可位于芯和活性成分层之间。聚合物层可位于活性成分层 的外部。成层珠子可包含多个活性成分层，另外地或替代地，成层珠子可 包含多个聚合物层。在一些实施方案中，至少一个活性成分层包含控释聚 合物。在一些实施方案中，最外层包含所述控释聚合物，其可包含活性成 分，或者在另一实施方案中，其可不含活性成分。
本发明的任选包衣珠子可直接根据上文所述的制备方式配制而成。 在一个替代实施方案中，可期望赋予珠子和/或最终剂型不同的特性。根 据本发明，达到该目的的一个方法是通过造粒来例如改进珠子与例如上文 所述其他与粘合剂有关组分的粉状混合物的流动性。如现有技术所述，完 整或破碎珠子的颗粒可通过添加液体(例如粘合剂或溶剂溶液)和发生造 粒步骤获得。更大量的造粒液体导致更窄的颗粒尺寸范围和更粗糙且更硬 的颗粒，即精细颗粒的比例降低。可使用获得指定颗粒尺寸所需的最佳液 体量以使批次间的变化最小化。根据该实施方案，湿法造粒可被用于改进 以固体剂型形式存在的本发明组合物的流动性、可压缩性、生物利用度、 同质性、静电特性和稳定性。颗粒的粒径可通过造粒液体的量和给料速率 确定。湿法造粒被用于改进低剂量混合物的流动性、可压缩性、生物利用 度和同质性，粉末的静电特性和剂型的稳定性。根据该实施方案的湿法造 粒工艺可采用低或高剪切混合装置，其中低粘性液体(优选水)被添加到 包含预先干混有配方剩余物质(包括珠子)的粘合剂的粉末混合物中。可 利用的其他造粒方法包括高剪切造粒法、挤出造粒法和常规的湿法造粒。 剂型
在另一方面，本发明提供了含有本发明珠子群的剂型。剂型中的珠 子包含水凝胶形成聚合物、表面活性剂和活性成分。剂型中的珠子可被任 选地包衣(如上文所述)。在某些实施方案中，剂型可包含至少两个珠子 群。
在剂型珠子包含的活性成分为活性药物成分的情况下，剂型适于药 用。
剂型可通过制备含有水凝胶形成聚合物、以胶束形式分散在聚合物 中的表面活性剂和活性成分的珠子获得。任选地，珠子是包衣过的，任选 的包衣可以提供胃肠道(GIT)内已知或所需的释放特性的方式配制。然 后，通过本领域技术人员已知的制备剂型的方法将珠子群配制成合适的单 一单位剂型(如下文所述)。可对剂型进行进一步加工(例如通过包衣) 以使活性成分在GIT内具有改进的释放速率。
在某些实施方案中，剂型包含呈适于向例如人或动物施用的单位剂 型的本发明的珠子群。该单位剂型选自胶囊剂、片剂、喷剂、袋剂、栓剂、 阴道栓剂或其他合适的单位剂型。
在一些实施方案中，包含珠子群的剂型可以单一单位剂型存在，例 如包含于在胃内释放珠子的单一硬凝胶胶囊中。或者，珠子可以存在于袋 或允许珠子散置在食品或饮料中或通过进料管(例如鼻饲管或十二指肠进 料管)施用的其他容器中。或者，例如如下文所述，如果将珠子群压制 成单个片剂的话，珠子可以作为片剂施用。或者，可将珠子填充(例如压 制)到专用的瓶帽中或以其他方式填充到密封容器(或待密封容器)专用 的瓶帽或其他元件的空间中使得例如在扭转瓶帽时，珠子被释放到瓶或小 瓶内的流体或其他内容物中，从而使珠子在搅动或不搅动的条件下分散 (或溶解)在这些内容物中。一个实例为由Humana Pharma International (HPI)S.p.A，Milan，Italy制造的智能递送帽(Smart Delivery Cap)。
剂型可以使得本发明的珠子可进一步被开发并产生比相同形状的单 一模制形式具有更大质量的珠子的方式配制，例如通过压制多个在不同条 件下以不同速率崩解的珠子(与药物配制领域的技术人员已知的合适油或 粉末基粘合剂和/或的填充剂一起压制，任选包括额外量的与本发明组合 物中的API相同或不同的API，一个优选实例是在本发明的组合物采用 含有立即释放或控释环孢霉素的珠子形式时，结合剂或填充剂包含MMF 霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)，一种免疫抑制剂)。更大的(例如 压制的)质量本身可采取多种形状，包括丸剂形状、片剂形状、胶囊剂形 状等。这种形式的珠子实施方案解决的一个特别问题是通常见于填充有粉 末或颗粒的硬凝胶胶囊中的“死空间”(在固定颗粒状内容物的上方)和 /或“空隙空间”(在颗粒状内容物元素之上)。与胶囊不包含所述死空 间的情况下相比，在颗粒或粉末填充的胶囊具有死/空隙空间的情况下， 患者需要吞服更大的胶囊。本发明该实施方案的珠子可被容易地压制成这 样的胶囊，其可采用任意的内部形式，只要囊或壳可期望地留下大量减少 的(例如基本无)死空间/空隙空间即可。或者，死空间/空隙空间可用于 通过使珠子悬浮于诸如油的载剂中而有利化，例如，所述油可以是惰性的 或者可具有功能特性，例如提高渗透性或提高溶解或者可包含与珠子中的 任意活性成分相同或不同的活性成分。例如，硬明胶胶囊可填充有液体介 质与无包衣和/或包衣珠子的组合。液体介质可以是本文所述的一种或更 多种表面活性剂相组分或者其可以是一种或更多种表面活性剂。特别优选 但不受限制的实例是玉米油、脱水山梨醇三油酸酯(以商标SPAN 85市 售)、丙二酸二辛基癸酸酯(以商标Labrafac市售)、2-(2-乙氧基乙氧 基)乙醇(以商标Trancutol P市售)和聚山梨酯80(以商标Tween 80市 售)。可用于该实施方案并包含活性成分的液体介质的一个实例是市售的 环孢菌素前微乳剂NeoralTM。特别优选在Neoral中配制根据本发明的珠 子，并且优选填充到硬凝胶胶囊中。
如此存在的珠子可以是单一类型(或群体)或可以是多种类型(或 群体)，相对于本文所述的一个或更多个特性而言，群间的不同之处在于 例如不同的活性成分或不同的赋形剂或不同的物理几何形状、包衣、多层 包衣、无包衣等。
在一个代表性实施方案，剂型的珠子通过将至少下列材料混合在一 起并任选地额外将其与佐剂混合在一起预先形成自组装结构分散体来形 成：水凝胶形成聚合物、表面活性剂和选自活微生物、经杀灭微生物、经 减毒微生物和经灭活微生物的微生物。通过将分散体从单孔喷嘴喷射到合 适的冷却液中来将其固定在固化珠子中。去除干燥液并进行任意任选的包 衣，然后将珠子填充到适于药用的明胶胶囊中。
在一些实施方案中，可以使一种或更多种活性成分在GIT内的指定 点(例如结肠)释放的方式适当配制剂型。
在剂型包含至少两个珠子群的情况下，至少一些珠子(例如第一群) 可包含一种(或多于一种)活性成分，其他珠子(例如第二群)可包含一 种(或多于一种)活性成分。至少一个群包含含有选自活微生物、经杀灭 微生物、经减毒微生物和经灭活微生物的抗原的活性成分，任选包含佐剂。 一个群可不含活性成分或包含“去活”成分，例如酶或毒素螯合剂或者包 含可提高、缓和或增强另一群中活性成分的作用的活性赋形剂，例如渗透 性增强剂。在相关实施方案中，本发明的剂型可包含多个珠子群。群之间 可具有相同或不同的活性成分。在某些实施方案中，无论单次或多次，可 对两个珠子群进行有差别地包衣，以提供相同或不同活性成分的不同释放 性能。
本发明的剂型适于经口施用。
因此，本发明包括含有多个本发明成形单元(例如珠子)的口服剂 型。
如前所述，当组合物包含至少两种活性剂时，组合物可在水凝胶形 成聚合物珠子或成形单元中(无论在聚合物相或表面活性剂相中或两者 中)包含至少两种药剂(一种为选自活微生物、经杀灭微生物、经减毒微 生物和经灭活微生物的微生物)以用于共同释放，和/或组合物可在组合 物的不同部分中包含至少两种药剂以用于顺序释放，例如脉冲释放。从顺 序释放方面考虑。组合物可在水凝胶形成聚合物珠子或成形单元中(无论 在聚合物相或表面活性剂相或两者中)包含一种活性剂，并在包衣层中包 含一种活性剂，任选地，组合物可在不同的包衣层中包含两种或更多种活 性剂，或者在两个或更多个不同的包衣层中包含相同的活性剂。
实施例
在下述实施例中，所有的百分比和比例均为按重量计。
实施例描述了通常呈球形且直径通常为1mm至2mm的珠子的制 备。珠子根据下述一般方法制备：
制备方法
表面活性剂相
将抗原(即微生物)和佐剂溶解/分散在Kolliphor HS 15中。当抗原 或佐剂以水溶液形式提供时，将该溶液与Kolliphor HS 15混合，直至获 得均匀的混合物。将温度保持在35℃至40℃以使Kolliphor HS保持为液 体。
明胶相
在室温下，将D-山梨糖醇溶于水中，然后添加明胶，并将温度升高 至至多60℃至70℃。搅拌溶液直至组分完全溶解。(如果期望的话，可 使用佐剂水溶液来制备明胶相，任选与水组合，但是该选择不是所述实施 例的特征)
混合两相
将表面活性剂相和明胶相以不同的w/w比率混合(如表1所示)。 于60℃至70℃下搅拌得到的混合物以获得均匀性。通过单孔喷嘴喷射均 匀溶液以形成液滴，液滴落入8℃至10℃的冷却油介质(Miglyol 810N) 中。孔尺寸(直径)可以为0.5mm至3.5mm。
约30分钟后，从冷却油溶液中回收珠子，离心以除去过量的油，然 后于室温下将其干燥。
所有的制剂均包覆有Eudragit L 30 D 55。
在本文的实施例中，通过下述制备获得的最终干珠子中存在的细胞 数目并不确定。因此，用于实验的珠子中引用的抗原水平为假定用于制备 珠子的所有细胞均存在于最终干珠子中的目标水平。因此，由于在制备珠 子期间的损失，用于小鼠研究之最终干珠子中的实际细胞数目可能一直低 于目标水平。
ETEC组合物
具体地，如下获得制剂1和2：
制剂1。
表面活性剂预混合物：Kolliphor HS 15(18.02％)、ETEC混悬液＊ (81.98％)。
水性预混合物：明胶(17.15％)、D-山梨糖醇(1.68％)、ETEC混 悬液＊(81.18％)。
＊ETEC混悬液包含1×10^10细胞/g。
以1∶1.69的表面活性剂预混合物：水性预混合物重量比将两相混合。
干组合物：
组分 ％ Kolliphor HS 15 36.21 明胶 58.11 D-山梨糖醇 5.68 ETEC细包 参见下文注释
注释：使用4.8×10^10ETEC细胞来制备制剂1，给定的批量为 1093.1mg，1个珠子的平均重量等于2.1mg，批次中的珠子总数为1093.1 mg/2.1＝521个珠子。因此，每个珠子的ETEC细胞浓度为4.8×10^10/521 ＝9.2×10^7细胞/珠子。
经包衣的珠子获得5.9％的Eudragit L 30D-55重量增加。
制剂2。
表面活性剂预混合物：Kolliphor HS 15(14.81％)、α-GalCer(0.08％) ETEC混悬液＊(85.11％)。
水性预混合物：明胶(17.17％)、D-山梨糖醇(1.71％)、ETEC混 悬液＊(81.12％)。
＊ETEC混悬液包含1×10^10细胞/g。
以1：1.43的表面活性剂预混合物：水性预混合物重量比将两相混合。
干组合物：
组分 ％ Kolliphor HS 15 35.31 明胶 58.66 D-山梨糖醇 5.85 α-Ga1-Cer 0.18 ETEC细胞 参见下文注释
注释：使用4.8×10^10ETEC细胞来制备制剂1，给定的批量为 1084.4mg，1个珠子的平均重量等于2.1mg，批次中的珠子总数为1084.4 mg/2.1＝517个珠子。因此，每个珠子的ETEC细胞浓度为4.8×10^10/521 ＝9.3×10^7细胞/珠子。
给定的批量为1084.4mg干重，批次中每种组分的绝对量(干重)如 下：
组分 量 Kolliphor HS 15 382.90mg 明胶 636.11mg D-山梨糖醇 63.48mg α-Gal-Cer 1.95mg ETEC细胞 4.8×10^10
制剂2的多种比例总结示于下表中：
比例(干重mg：1×10^10细胞) 比值 Kolliphor HS 15：ETEC细胞 79.77mg：1×10^10细胞 明胶：ETEC细胞 132.52mg：1×10^10细胞 D-山梨糖醇：ETEC细胞 13.23mg：1×10^10细胞 α-Gal-Cer：ETEC细胞 0.41mg：1×10^10细胞
注释：上述计算的数值是忽略ETEC混悬液中的水质量和珠子中任 何残留水的质量的近似值。
本段的教导适用于本申请的全部公开内容，包括本说明书所有适合 的实施方案和所有适合的权利要求。本发明包括具有选自下表中特征1、 特征2、特征3和特征4之特征的组合物。在该表中，词语“细胞”指组 合物所涉及的微生物细胞，例如本文提及的任何细菌、真菌或单细胞病原 体的细胞。
特征 比例(干重mg：10^10细胞) 范围1 范围2 1 表面活性剂：细胞 25-125mg：10^10细胞 50-100mg：10^10细胞 2 水凝胶形成聚合物：细胞 75-175mg：10^10细胞 100-150mg：10^10细胞 3 增塑剂：细胞 2-25mg：10^10细胞 5-20mg：10^10细胞 4 佐剂：细胞 0.1-10mg：10^10细胞 025-5mg：10^10细胞
在其全部公开内容(如在前面的段落中所述的)中，本发明还包括 具有上表特征的任一种下列组合的组合物：
针对范围1：特征1+特征2、特征1+特征3、特征1+特征4、特征 2+特征3、特征2+特征4、特征3+特征4、特征1+特征2+特征3、 特征1+特征3+特征4、特征1+特征2+特征4、特征2+特征3+特 征4、特征1+特征2+特征3+特征4。针对范围2：特征1+特征2、 特征1+特征3、特征1+特征4、特征2+特征3、特征2+特征4、特 征3+特征4、特征1+特征2+特征3、特征1+特征3+特征4、特征 1+特征2+特征4、特征2+特征3+特征4、特征1+特征2+特征3+ 特征4。
在其全部公开内容中，本发明还包括具有任意下列佐剂：细胞比例 (干重mg：10^10细胞)的组合物：0.1至100mg：10^10细胞，0.2至 10mg：10^10细胞、0.25至10mg：10^10细胞、0.4至10mg：10^10细胞、 0.2至5mg：10^10细胞、0.25至5mg：10^10细胞、0.4至5mg：10^10细 胞、1至10mg：10^10细胞、2至10mg：10^10细胞、4至10mg：10^10 细胞、10至100mg：10^10细胞、25至100mg：10^10细胞、50至100mg：10 ^10细胞、10至50mg：10^10细胞、10至30mg：10^10细胞、10至20mg：10 ^10细胞。关于范围1和2，本段的教导适用于例如上表中特征1、2和3 中的每一个和上段中提及的特征1、2和3中两个或三个的组合。微生物 可由例如选自细菌和单细胞真菌的一种或更多种单细胞微生物组成，在此 情况下，佐剂与单细胞微生物总量的比例(佐剂干重mg：10^10细胞) 可如在本段之前或本文其他部分列举的比例。微生物可包含或是任意一种 或更多种，例如一种、两种或三种本说明书中提及的微生物。微生物可包 含或是任意一种或更多种，例如一种、两种或三种本说明书中提及的细菌。 微生物可包括ETEC或者是ETEC。微生物可包含或是幽门螺旋杆菌(h. pylori)。微生物可包括霍乱弧菌(V.Cholerae)或者是霍乱弧菌。
因此，在其全部公开内容中，本发明包括其中微生物由一种或更多 种单细胞微生物组成的组合物。在所述组合物中，表面活性剂与单细胞微 生物总量的比例(表面活性剂干重mg：10^10细胞)可以是，例如10至 200mg：10^10细胞，任选25至125mg：10^10细胞，例如25至150mg：10 ^10细胞、25至100mg：10^10细胞、50至200mg：10^10细胞、50至100 mg：10^10细胞或60至90mg：10^10细胞。
在一些实施例中，佐剂与表面活性剂(Kolliphor HS)的干重比为约 175比1，并且这是可适用于本公开内容全部范围的任选比例。同样作为 适用于本发明全部范围提及的任选比例为200比1或更小、150比1或更 小、100比1或更小和50至1或更小。
包衣在MFL01上的珠子获得5.5％的Eudragit L 30D-55重量增加。
制备的制剂1和2的总结示于下表中。

上表中示出的抗原(ETEC)包含经福尔马林杀灭的E.coli K12细菌 (在表面上表达CFA/I菌毛)。
上述组合物用于确定用这些组合物(在存在和不存在α-GalCer作为 佐剂的情况下)经口免疫小鼠是否能够诱导有效的粘膜和全身抗体应答及 其程度。
在第0天和第1天，通过经口管饲法，用碳酸氢盐缓冲剂作为对照 或者用碳酸氢盐缓冲剂中的ETEC(3×108细胞/剂量)单独或与作为佐 剂的α-GalCer(10μg/剂量)或霍乱毒素(CT，10μg/剂量)一起对雌性 BALB/c小鼠进行免疫，或者用仅含ETEC(3×108细胞/剂量)或含有 ETEC以及α-GalCer(10μg剂量)的对雌性BALB/c小鼠进 行经口免疫。在第13、14、27和28天，用相同系列的免疫接种小鼠。在 加强免疫接种前1天和最后一次剂量后12天对小鼠组(n＝5)采血以用 于确定IgG和IgA抗体滴度。在加强免疫接种前1天和最后一次剂量后 12天收集粪粒以测定黏膜抗体应答。在最后免疫接种前两周，处死小鼠 并收集肠洗液。此外，还利用皂苷从肠中提取蛋白质来获得小鼠小肠和大 肠两者的提取物，并将其冷冻于含有蛋白酶抑制剂的缓冲剂中以进行随后 分析粘膜抗体。
实验组
1.碳酸氢盐缓冲剂
2.ETEC
3ETEC+α-GalCer
4.ETEC+CT
5.(ETEC)
6.(ETEC+α-GalCer)
与经无佐剂的疫苗或经溶液中的ETEC免疫的小鼠相比， 在经含有ETEC和α-GalCer的免疫之小鼠的血清、粪粒、唾液 和肠洗液中发现增强的抗体应答。
关于ETEC组合物的结果
请参考图1至8
溶液中的单独ETEC：用溶液中的ETEC疫苗经口免疫小鼠未诱导 抗原特异性IgA抗体应答，CFA/I特异性IgA仅可在1/5经该疫苗免疫小 鼠的粪粒(图2)或血清(图4)中检测到。
溶液中的ETEC+α-GalCer：与溶液中的单独ETEC相比，不管是 粘膜还是全身，溶液中添加作为佐剂的α-GalCer未导致显著增强的抗原 特异性抗体滴度。
(仅ETEC)：递送无佐剂制剂中的ETEC疫苗未 导致任何经免疫小鼠的粪粒(图1和2)或肠中(图6、7和8)具有可检 测的粘膜抗体。此外，与经口施用溶液中的ETEC疫苗的小鼠相比(图3 和4)，全身抗体应答在经该制剂免疫的小鼠中未得到显著增强。
(ETEC+α-GalCer)：在最后经口免疫接种后，递送中的ETEC和作为佐剂的α-GalCer诱导所有经免疫小鼠的粪粒(图2)、 血清(图4)和肠(图7)中的特异性IgA抗体应答。与溶液中的 ETEC+α-GalCer或中的单独ETEC相比，来自经该制 剂免疫之小鼠的粪粒包含显著更高的粘膜IgA和IgG(图1)。尽管在第 二疫苗接种系列后检测到特异性IgA抗体，但是制剂的增强效果 在经第3疫苗接种系列后最显著。此外，与施用溶液或中的无佐 剂疫苗的小鼠相比，通过皂苷提取肠蛋白质后，在用含有ETEC和 α-GalCer的经口免疫之小鼠的肠中观察到显著更高的抗原特异 性IgG和IgA抗体滴度(图7和8)。此外，在经含有ETEC和α-GalCer 的免疫的小鼠的小肠洗液中观察到显著增强的CFA/I特异性IgG 抗体(图6)。
对于全身IgA和IgG，在用含有ETEC和α-GalCer的经口 免疫的小鼠中再次检测到最强的应答(图3、4和5)。在经历两个或三 个系列的经口免疫接种后，与溶液中的ETEC+α-GalCer或中的 单独ETEC相比，来自经中的ETEC+α-GalCer免疫之小鼠血清 的抗原特异性IgG抗体显著更多(图3)。对该制剂诱导之抗体亚类的分 析揭示IgG1是主要的被诱导亚型(图5)。
结论
●与用溶液中的ETEC或不含α-GalCer的中的ETEC的免 疫接种相比，用被配制成含有α-GalCer的的ETEC经口免疫小 鼠诱导粪粒和肠中显著更强的粘膜IgA和IgG抗体应答。
●用含有ETEC和α-GalCer的免疫小鼠同样诱导血清中抗 原特异性抗体应答，并且该抗体应答要显著强于经溶液或中的无 佐剂ETEC疫苗经口免疫之小鼠中产生的抗体应答。
总之，这些数据证实，根据本发明的含有ETEC和作为佐剂的α-GalCer 的制剂诱导有效的粘膜和全身抗体应答。此外，该研究表明通过 利用皂苷提取肠蛋白质，可从用根据本发明之含有ETEC和α-GalCer的 经口免疫之小鼠的肠中检测到抗原特异性抗体，并且这些应答要 显著强于通过无佐剂疫苗诱导的应答。
霍乱弧菌组合物
在下述实施例中，微生物为JS1569霍乱弧菌的经福尔马林杀灭之遗 传改造菌株，其过表达Inaba LPS。
实施例和附图中提及的“JS1569”和“JS1569霍乱弧菌”指上文提 到的JS1569霍乱弧菌的改造菌株，其过表达Inaba LPS。
JS1569霍乱弧菌制剂
使用与上述针对ETEC制剂的方法类似的方法制备制剂3和4以提 供下列组合物。

简言之，如下制备制剂3和4：
制剂3(霍乱弧菌)
在室温下，将1.40g的霍乱弧菌水性混悬液(浓度＝2.24×1010细菌 /mL)与0.41g的Kolliphor HS 15混合，直至获得均匀的分散体(“表 面活性剂相”)。表面活性剂相包含22.1％的Kolliphor HS 15和77.9％ 的霍乱弧菌水性混悬液(按重量计％)。
在不同的小瓶中，将0.71g的霍乱弧菌水性混悬液(浓度＝2.24×1010细菌/mL)与2.3g的纯化水混合，添加0.063g山梨糖醇，并混合溶液直 至所有的山梨糖醇均溶解。添加0.63g明胶，并升温直至55℃，搅拌混 合物直至所有的明胶熔融(“明胶相”)。明胶相由17.1％明胶、1.7％ 山梨糖醇、62.1％纯化水和19.1％霍乱弧菌混悬液组成(按重量计％)。
将表面活性剂相添加到明胶相中，于55℃下混合得到的组合物直至 获得均匀的组合相，然后通过1mm喷嘴将组合物喷射到于4℃下冷却的 中链甘油三酯油中以形成球形珠子。产生所有珠子后，排出冷却油并于室 温下过夜干燥珠子。
如下为珠子形成之前的乳剂批料的预计干组合物：

上表中的组合物表示珠子形成之前的总批料的组合物。因此，每个 珠子的平均细胞数可根据针对以上制剂1和2的上述平均珠子尺寸和重量 确定。
然后，用5.4％(重量增加)Eudragit L-30D 55对珠子进行包衣。 得到的组合物包含1.3×108细菌/珠子剂量的霍乱弧菌细菌作为抗原。
制剂4(霍乱弧菌和α-GalCer)
在室温下，将1.41g的霍乱弧菌水性混悬液(浓度＝2.24×1010细菌 /mL)与0.41g的Kolliphor HS 15和2mg的α-GalCer混合，直至获得 均匀的分散体(“表面活性剂相”)。表面活性剂相包含22.1％的Kolliphor  HS 15、0.1％的α-GalCer和77.8％的霍乱弧菌水性混悬液(按重量计％)。
在不同的小瓶中，将0.72g的霍乱弧菌水性混悬液(浓度＝2.24× 1010细菌/mL)与2.3g的纯化水混合，添加0.064g山梨糖醇，并混合溶 液直至所有的山梨糖醇均溶解。添加0.63g明胶，并将温度升高至55℃， 搅拌混合物直至所有的明胶熔融(“明胶相”)。明胶相由17.1％明胶、 1.7％山梨糖醇、61.8％纯化水和19.4％霍乱弧菌混悬液组成(按重量计 ％)。
将表面活性剂相添加到明胶相中，于55℃下混合得到的组合物直至 获得均匀相。然后，如制剂3中所述，使组合物成形为珠子并干燥。
如下为珠子形成之前的乳剂批料的预计干组合物：

用7.4％(重量增加)Eudragit L-30D 55对珠子进行包衣。珠子包 含理论剂量为1.25×108细菌/珠子的霍乱弧菌细菌作为抗原以及理论剂 量为5.3μg/珠子的α-GalCer作为佐剂。
制剂5、6和7以及比较制剂A和B
利用与用于制备制剂3和4所用的方法类似的方法制备下列组合物。

制剂3和4用于进行下文的实验1至3。制剂5、6、7和比较制剂A 和B用于进行实验4和5。
小鼠和给药
使用雌性C57/bl6小鼠(Harlan UK)进行研究。如下用溶液和/或 组合物免疫小鼠。溶液：用200μL碳酸氢盐溶液(0.35M，pH 9) 中含有细菌+/-佐剂的溶液管饲经麻醉的小鼠。组合物(一般两个 珠子)：通过柔性管饲针以小体积递送缓冲剂(PBS，pH 5)向经麻醉的 小鼠施用组合物。
霍乱弧菌实验1：粪粒中的免疫应答
连续两天用单独碳酸钠溶液或含有2.5×108细菌与/不与10μg霍乱毒素 或10μg αGalCer的碳酸钠溶液或制剂中的2.5×108细菌与/不与 10μgαGalCer经口接种小鼠，以两周为间隔，持续总共三轮。在每轮疫 苗接种前1天和最后一轮疫苗接种后2周获得粪粒样品，测量抗 Inaba-LPS IgA和IgG应答。在每轮疫苗接种前1天和最后一轮疫苗接种 后2周获得粪粒样品，测量抗Inaba-LPS IgA和IgG应答。图13示出了 经历(a)1轮、(b)2轮、(c)3轮免疫接种后在粪粒中观察到的IgA 滴度，(e)示出了经历3轮免疫接种后在粪粒中观察到的IgG滴度，滴 度通过ELISA测量。图13(a)至(c)和(e)中的结果表示各组中所 有小鼠的平均值和SD。图14示出了对应的时间进程，并说明经历每轮疫 苗接种后IgA应答的诱导动力学。
霍乱弧菌实验2：肠中的局部免疫应答
按照霍乱弧菌实验1所述经口接种小鼠。在经历最后一轮疫苗接种 后2周，使小鼠安乐死，并对其进行灌注以从内部器官取血。切开小肠， 并取出小部分上端部分，并将该部分放置在皂苷溶液中以提取内组织抗 体。图15示出了通过ELISA测量的Inaba特异性LPS IgA(a)和IgG (b)滴度。结果表示各组中所有小鼠的平均值和SD。
霍乱弧菌实验3：全身免疫应答
按照霍乱弧菌实验1所述经口接种小鼠。在经历最后一轮疫苗接种 后2周，通过尾部取血获得血清。图16示出了通过ELISA测量的Inaba 特异性LPS IgA(a)、IgG(b)和IgG1(c)滴度。结果表示各组中所 有小鼠的平均值和SD。
霍乱弧菌实验4：高剂量免疫接种-粪粒
连续一天或两天用安慰剂(明胶)或含有如下物质的SmPill 或含有12×108细菌与/不与10μg α-GalCer的SmPill经口接种小鼠，以 2周为间隔，持续总共三轮：i)4.5×108细菌无佐剂；ii)4.5×108细菌 和10μg霍乱毒素；iii)4.5×108细菌和10μgα-GalCer。在每轮疫苗接 种前1天和最后一轮疫苗接种后2周获得粪粒样品，测量抗Inaba-LPS IgA和IgG应答。图17示出了在经历1、2和3轮免疫接种后观察到的多 种IgA滴度，其通过ELISA测定。结果表示经历一系列稀释的样品的 OD492吸光度值。
霍乱弧菌实验5：高剂量免疫接种-肠IgA应答
按照霍乱弧菌实验4所述经口接种小鼠。在经历最后一轮疫苗接种 后2周，使小鼠安乐死，并对其进行灌注以从内部器官移出血。切开小肠， 并取出小部分上端部分，将该部分放置在皂苷溶液中以提取内组织抗体。 图18示出了经历3轮免疫接种后观察到的通过ELISA测定的多种Inaba LPS特异性IgA滴度。结果表示经历一系列稀释的样品的OD492吸光度 值。
结论-请参照图13至18
与含有单独JS1569霍乱弧菌的组合物相比，含有αGalCer和JS1569 霍乱弧菌的组合物显示出增强的免疫应答，说明αGalCer对含 有微生物的SmPill组合物来说是一种有效佐剂(图13至18)。
与以溶液形式或单独抗原或抗原和CT的溶液形式递送的相同制剂 相比，含有JS1569以及αGalCer的组合物诱导更强的全身应答 和肠中的局部应答(图15和16)。
与递送单独抗原的相同制剂相比，含有JS1569以及α-GalCer的 组合物诱导更强的粪粒抗体滴度(图17)。
与每轮疫苗接种只进行一天疫苗接种相比，连续两天用含有αGalCer 和JS1569霍乱弧菌的组合物进行免疫接种未显示出益处(图17 和18)。
参考研究1和2
使用含有作为抗原的霍乱毒素B亚基(CTB)和α-GalCer的组合物来在小鼠中进行参考研究1和2，其结果示于图10至12中。利用 与上述方法类似的方法制备组合物以提供下列预期的干重组合物。

参考研究1和2表明含有亚基抗原的组合物相对于根据本发明的“全细胞” 微生物的作用。
纵横比
微珠子一般按照上述方法通过从喷嘴挤出落到冷却介质中制备。但 是，该实例中的珠子不落入具有微生物作为活性成分的本发明的范围内。 然后，如本文所述，用SureleaseTM和果胶混合物对一些珠子进行包衣。 当使用EyeconTM颗粒表征器测量时，典型地发现包衣珠子的样品群和未 包衣珠子的样品群两者均具有1.2的平均纵横比。