一种同时检测吡虫啉和甲基对硫磷的双特异单克隆抗体.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103102415 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103102415 A *CN103102415A* (21)申请号 201210238321.6 (22)申请日 2012.07.11 CCTCC NO:C201274 2012.07.10 C07K 16/44(2006.01) C12N 5/20(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号南京农 业大学植物保护学院刘凤权 (72)发明人 刘凤权 王利民 华修德 李刚 (54) 发明名称 一种同时检测吡虫啉。

2、和甲基对硫磷的双特异 单克隆抗体 (57) 摘要 本发明涉及同时识别吡虫啉和甲基对硫磷农 药的双特异性单克隆抗体及其制备方法， 属于生 物技术领域。用杂交 - 杂交瘤技术将分泌抗甲基 对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞和经吡虫啉抗原 免疫的小鼠脾细胞进行融合， 获得了能稳定分泌 同时抗甲基对硫磷和吡虫啉农药的双特异性单克 隆抗体 FQ-D6。此抗体经过有效性验证证明可用 于农业生产环境和农产品中甲基对硫磷和吡虫啉 残留的快速灵敏检测。本发明涉及的同时抗甲基 对硫磷及吡虫啉农药双特异性单克隆抗体制备技 术简便可行， 抗体的整个制备过程无需特别的仪 器设备， 容易工厂化规模生产。 (83)生物保藏信息 。

3、(51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103102415 A CN 103102415 A *CN103102415A* 1/1 页 2 1. 所述双特异性单克隆抗体， 是保藏编号为 CCTCC NO ： C201274 的三体杂交瘤细胞株 FQ-D6。 2. 权利要求 1 所述三体杂交瘤细胞株 FQ-D6 所分泌的单克隆抗体， 是同时检测甲基对 硫磷和吡虫啉的双特异性单克隆抗体， 为 IgG2b-IgG1 型， 抗体轻链为 kappa。

4、 链。 3.权利要求1所述三体杂交瘤细胞株FQ-D6是通过将分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的 杂交瘤细胞和经吡虫啉抗原免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞进行融合而获得 ； 具体制备方法包 括 (1)HGPRT 酶缺陷型抗甲基对硫磷杂交瘤细胞株的筛选 将分泌抗甲基对硫磷抗体的杂交瘤细胞株置于 5ug/ml 8-AG 培养基中培养， 在培养过 程中逐渐提高培养基中 8-AG 浓度， 最终使细胞株能适应在 50ug/ml 的 8-AG 的培养基中生 长 ； 之后利用 HAT 选择性 DMEM 培养基进行筛选， 通过细胞是否存活来鉴别细胞中的酶是否 缺失， 缺失条件下进行克隆并扩大培养， 并将细胞冻存备用。。

5、 (2) 细胞融合 利用间接非竞争ELISA检测受吡虫啉免疫原免疫过的BALB/C小鼠血清， 取效价高者解 剖获取脾脏， 将脾细胞与生长状态良好的分泌抗甲基对硫磷抗体的 HGPRT 酶缺陷型杂交瘤 细胞株通过杂交 - 杂交瘤技术制备三体杂交瘤细胞。并于 37， 体积比 5二氧化碳培养 箱培养， 待 7 天后通过非竞争 ELISA 检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。 (3) 三体杂交瘤细胞筛选 对融合孔细胞上清采用间接非竞争 ELISA 法进行初步筛选 ： 甲基对硫磷和吡虫啉两种 包被原下， 有融合细胞的上清液读数均等于或大于阴性对照读数的 2.1 倍时， 这样的融合 孔即为阳性孔 ； 为了进一步确。

6、定筛选到阳性孔所分泌抗体是同时识别甲基对硫磷和吡虫啉的双特异 性单克隆抗体， 再通过间接竞争 ELISA 法筛选 ： 设定甲基对硫磷包被原包被下， 不含农药的 细胞上清的读数为 B01， 含有甲基对硫磷农药的细胞上清读数为 B11， 含有吡虫啉农药的细胞 上清液读数为 B12； 吡虫啉包被原包被下， 不含农药的细胞上清的读数为 B02， 含有甲基对硫 磷农药的细胞上清读数为B21， 含有吡虫啉农药的细胞上清液读数为B22。 当同时出现以下现 象时 ： B11B01， B12B01， B21B02， B22B02， 便可以认定其分泌的抗体为双特异性单克隆抗 体， 并利用有限稀释法对细胞进行亚克隆。

7、， 其分泌的上清即为所制的双特异性单克隆抗体。 4. 产生权利要求 1 或 2 所述的三体杂交瘤细胞株 FQ-D6 于 2012 年 7 月 10 日保藏于中 国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： C201274。 权 利 要 求 书 CN 103102415 A 2 1/5 页 3 一种同时检测吡虫啉和甲基对硫磷的双特异单克隆抗体 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及应用于同时检测吡虫啉和甲基对硫磷双特异性单克隆抗体及制备方 法， 属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中吡虫啉、 甲基对硫磷残留的灵敏、 快速检测， 特别适用于大批量样品检测。 ( 二 ) 背景。

8、技术 0002 吡虫啉 (imidacloprid， 1-(6- 氯 -3- 吡啶甲基 )-N- 硝基 -2- 咪唑啉亚胺 ) 和甲 基对硫磷 (Parathion-methyl， O， O- 二甲基 -O-(4- 硝基苯基 ) 硫代磷酸酯 ) 是农业生产中 被广泛使用的杀虫剂， 吡虫啉属于中等毒性新型烟碱类杀虫剂， 而甲基对硫磷属于高毒有 机磷酸酯类杀虫剂。目前， 对这两种农药在农产品中的残留检测采用的是气相色谱法 (GC) 和高效液相色谱法 (HPLC) ； 对这两种农药残留免疫分析方法也有相关报道， 但同时针对这 两种农药的免疫多残留检测方法却仍未见报道。 0003 农药多残留免疫分析技。

9、术主要有以下三种 ： 1. 将多种半抗原偶联到一个载体蛋 白上， 免疫动物获得抗血清进行农药多残留分析 ； 2. 提取一系列农药的公共结构， 设计出 通用半抗原， 免疫动物获得单克隆抗体用于农药多残留分析 ； 3. 双特异性抗体法。第一种 方法因只能够得到多克隆抗体而使其在生产上受到一定局限 ； 第二种方法所制备的单克隆 抗体只能够识别一类农药， 对于不同种类的农药并不能同时检测 ； 而双特异性抗体很好地 解决了这个问题， 双特异性抗体因其具有两个不同的抗原结合位点， 而达到同时检测不同 种类农药的目的。 0004 制备双特异性抗体主要有以下三种方法 ： 化学交联法、 杂交 - 杂交瘤技术和基。

10、因 工程抗体技术。本发明利用甲基对硫磷杂交瘤细胞与受吡虫啉免疫原免疫的 BALB/C 小鼠 脾细胞融合的技术， 制备出分泌同时抗吡虫啉 - 甲基对硫磷单克隆抗体的三体杂交瘤细 胞。 ( 三 ) 发明内容 0005 技术问题本发明的目的是提供一种可用于同时检测甲基对硫磷和吡虫啉农药残 留的双特异性单克隆抗体及其制备方法。通过将分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤 细胞与受吡虫啉免疫原免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞融合的策略来制备能分泌抗甲基对硫 磷 - 吡虫啉双特异抗体的三体杂交瘤细胞。 0006 技术方案 0007 1. 抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体， 是由三体杂交瘤细胞株 FQ-D。

11、6 产 生的， 为 IgG2b-IgG1 型， 抗体轻链为 kappa 链。 0008 2. 抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体的制备方法， 包括 ： 0009 (1) 分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的 HGPRT 酶缺陷型杂交瘤细胞株筛选 0010 将分泌抗甲基对硫磷抗体的杂交瘤细胞株置于 5ug/ml8-AG 培养基中培养， 在培 养过程中逐渐提高培养基中 8-AG 浓度， 最终使细胞株能适应在 50ug/ml 的 8-AG 的培养基 说 明 书 CN 103102415 A 3 2/5 页 4 中生长 ； 之后利用 HAT 选择性 DMEM 培养基进行筛选， 通过细胞是否存活来鉴别细胞中。

12、的酶 是否缺失， 缺失条件下进行克隆并扩大培养， 并将细胞冻存备用。 0011 (2) 受吡虫啉免疫原免疫 BALB/C 小鼠脾细胞的准备 0012 将受吡虫啉免疫原 5 免， 血清效价达到 1 32000 以上的 BALB/C 小鼠加强免疫 3 天后， 眼眶取血并制备血清， 作为三体杂交瘤细胞筛选时的阳性对照 ； 将放血后的小鼠拉颈 脱臼处死， 并处于 75酒精体表消毒 10 分钟， 随后移入超净工作台内， 放置于无菌培养皿 内， 左侧腹部朝上 ； 利用无菌手术镊和眼科剪取出小鼠脾脏， 用 DMEM 基础培养基轻轻洗涤， 尽可能剥去脾脏周围的脂肪和结缔组织 ； 将脾脏置于 120 目的尼龙滤。

13、袋内， 并放入另一个 盛有 DMEM 基础培养液的培养皿中 ； 将尼龙滤袋中的脾脏扎破并不断挤压， 使脾细胞完全释 放到 DMEM 基础培养液中 ； 将脾细胞悬液转移到 50ml 离心管中， 1000rpm 离心 10 分子， 弃上 清， 将沉淀用约 30mlDMEM 培养液再洗一次后悬浮， 备用 0013 (3) 细胞融合 0014 将脾细胞与生长状态良好的分泌抗甲基对硫磷抗体的 HGPRT 酶缺陷型杂交瘤细 胞株通过杂交 - 杂交瘤技术制备三体杂交瘤细胞。并于 37， 体积比 5二氧化碳培养箱 培养， 待 7 天后通过非竞争 ELISA 检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。 0015 (4) 三。

14、体杂交瘤细胞的筛选 0016 对融合孔细胞上清采用间接非竞争 ELISA 法进行初步筛选， 方法为 ： 0017 用碳酸盐包被缓冲液分别稀释甲基对硫磷及吡虫啉包被原， 96 孔酶标板中每孔加 入50ul， 于4下孵育过夜， 将酶标板中包被液倒尽， 并用含0.05吐温20的磷酸盐缓冲液 洗涤 3 次 ； 将明胶用超纯水配置成 1的封闭液， 96 孔酶标板中每孔加入 200ul， 37孵育 1.5 小时， 将酶标板中封闭液倒尽， 并用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 0018 96 孔酶标板中每孔加入 50ul 收集到的待测融合孔细胞上清 ； 将受免疫小鼠血清 用含 0.05吐温。

15、 20 的磷酸盐缓冲液稀释， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul 作为阳性对照 ； 96 孔酶标板中每孔加入 50ul 未融合细胞上清作为阴性对照。37孵育 1 小时， 将酶标板中反 应液倒尽， 并用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0019 用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37下孵育 45 分钟， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含 0.05 吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0020 用柠檬酸钠底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37黑暗条。

16、 件下反应 10 分钟 ； 0021 96 孔酶标板中每孔加入 2mol/L 硫酸 25ul， 终止显色 ； 0022 终止显色后的酶标板立即在 450nm 下测定各孔单波长吸光值 ； 0023 两种包被原下， 有融合细胞的上清液读数均等于或大于阴性对照读数的 2.1 倍 时， 这样的融合孔即为阳性孔 ； 0024 为了进一步确定筛选到阳性孔所分泌抗体是同时识别甲基对硫磷和吡虫啉的双 特异性单克隆抗体， 再通过间接竞争 ELISA 法筛选， 方法为 ： 0025 用碳酸盐包被缓冲液分别稀释甲基对硫磷、 吡虫啉包被原， 96 孔酶标板中每孔加 入50ul， 于4下孵育过夜， 将酶标板中包被液倒尽。

17、， 并用含0.05吐温20的磷酸盐缓冲液 洗涤 5 次 ； 说 明 书 CN 103102415 A 4 3/5 页 5 0026 将明胶用超纯水配置成 1的封闭液， 96 孔酶标板中每孔加入 200ul， 37孵育 1.5 小时， 将酶标板中封闭液倒尽， 并用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0027 分别配置一系列浓度的甲基对硫磷和吡虫啉农药标准品甲醇溶液， 用含 0.05吐 温20的磷酸盐缓冲液稀释20倍后， 与细胞培养上清液等体积充分混合 ； 将两种农药-细胞 上清混合液以每孔 50ul 加入酶标板中 ； 以为融合细胞上清与含 0.05吐温 20 磷酸盐缓冲 液等。

18、体积混合液作为阴性对照 ； 37孵育 1 小时， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含 0.05吐 温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0028 用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37下孵育 45 分钟， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含 0.05 吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0029 用柠檬酸钠底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37黑暗条件下反应 10 分钟 ； 0030 96 孔酶标板中每孔加入 2mol/L 硫酸 25ul， 终止显色 ； 终止显色后酶。

19、标板立即在 450nm 下测定各孔单波长吸光值。设定甲基对硫磷包被原包被下， 不含农药的细胞上清的 读数为 B01， 含有甲基对硫磷农药的细胞上清读数为 B11， 含有吡虫啉农药的细胞上清液读数 为 B12； 吡虫啉包被原包被下， 不含农药的细胞上清的读数为 B02， 含有甲基对硫磷农药的细 胞上清读数为 B21， 含有吡虫啉农药的细胞上清液读数为 B22。当同时出现以下现象时 ： B11 B01， B12 B01， B21 B02， B22 B02， 便可以认定其分泌的抗体为双特异性单克隆抗体， 并利 用有限稀释法对细胞进行亚克隆， 其分泌的上清即为所制的双特异性单克隆抗体。 0031 产生。

20、上述双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株分类命名为 ： 杂交瘤细胞株 FQ-D6 ； 2012 年 7 月 10 日保藏于中国典型培养物保藏中心 ( 中国， 武汉， 武汉大学 )， 保藏编 号为 ： CCTCC NO ： C201274 0032 有益效果 0033 实用性好 ： 传统的农药分析主要在实验室进行， 其前处理过程烦琐， 分析速度慢、 成本高， 同时使用的大量有机溶剂易造成环境污染， 且对实验室的仪器化程度和人员专业 素质要求较高， 不能满足农产品贸易中对快速、 简便、 准确、 大量检测的要求。 而我们提供的 以抗原抗体反应为基础的 ELISA( 酶联免疫吸附分析 ) 方法具有操作简便。

21、、 快速、 分析成本 低、 安全可靠等优点， 一般不需要贵重仪器， 可大量简化样品前处理过程， 对使用人员的专 业技术要求不高， 容易普及和推广， 特别适用于大批量样本检测和现场检测。 0034 检测范围广 ： 利用杂交 - 杂交瘤技术制备的双特异性单克隆抗体， 具有同时检测 两类农药结构的特性， 相比常规单克隆抗体而言， 检测范围更宽， 应用前景更好。 0035 抗体稳定性好 ： 此法所获得的杂交瘤细胞在液氮条件下至少可以保存 3 年， 所纯 化的抗体在 -20条件下可存放 2 年 附图说明 0036 (1) 吡虫啉、 甲基对硫磷的标准工作曲线 具体实施方式 0037 实施例 1 自来水样品。

22、中吡虫啉、 甲基对硫磷残留量检测 说 明 书 CN 103102415 A 5 4/5 页 6 0038 ELISA 反应体系主要条件 0039 吡虫啉包被原浓度为 4.88ug/ml， 腹水稀释倍数为 2000 倍 ； 甲基对硫磷包被原浓 度为 2.3ug/ml， 腹水稀释倍数为 4000 倍。1明胶作封闭液， 抗原抗体反应液 ( 含 0.05 吐温 20 的磷酸盐缓冲液 ) 中甲醇含量为 5、 pH 值为 8.5、 离子强度为 0.8mol/L， 微量分析 板中每孔 50ul。 0040 待测样品准备 0041 自来水样品 ： 将吡虫啉和甲基对硫磷农药配成不同浓度的甲醇溶液， 吡虫啉浓度 。

23、分别为 6， 12ug/ml， 甲基对硫磷浓度分别为 0.64， 1.28ug/ml。将以上农药甲醇溶液用自来 水稀释 20 倍后， 农药浓度分别为 ： 吡虫啉 300， 600ng/ml， 甲基对硫磷 32， 64ng/ml。 0042 采用 ELISA 检测方法对以上样品进行检测， 操作如下 ： 0043 (1) 包被 0044 吡虫啉包被原浓度为 4.88ug/ml， 甲基对硫磷包被原浓度为 2.3ug/ml， 在 96 孔酶 标板中每孔加入 50ul， 4孵育过夜， 倒尽， 0045 (2) 封闭 0046 1明胶作封闭物， 96 孔酶标板中每孔加入 200ul， 37孵育 1.5 小。

24、时， 倒尽， 以含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次， 并拍干 ； 0047 (3) 加样 0048 将上述准备的吡虫啉、 甲基对硫磷溶液与保藏编号为 CCTCC NO ： C201274 三体杂 交瘤细胞所分泌的抗体溶液等体积混合后加入酶标板中， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37孵育1小时， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含0.05吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次 ； 0049 (4) 加酶标二抗 0050 用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37下孵育 45 分钟， 将酶标板中反应液倒尽，。

25、 并用含 0.05 吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0051 (5) 数据处理 0052 将所获得的结合率 (B/B0) 代入图 1 中吡虫啉、 甲基对硫磷的标准曲线中， 获得吡 虫啉和甲基对硫磷的浓度， 将所获得的浓度数据乘以倍数 2。并与添加浓度相比， 获得吡虫 啉在自来水中的添加回收率为 97 -104， 甲基对硫磷的添加回收率为 87 -99。 0053 实施例 2 池塘水样品中吡虫啉、 甲基对硫磷残留量检测 0054 ELISA 反应体系主要条件同实施例 1 0055 待测样品准备 0056 池塘水样品 ： 将收集到的池塘水离心， 取上清液进行实验。 吡虫啉和甲基对硫磷农。

26、 药配成不同浓度的甲醇溶液， 吡虫啉浓度分别为 6， 12ug/ml， 甲基对硫磷浓度分别为 0.64， 1.28ug/ml。将以上农药甲醇溶液用池塘水稀释 20 倍后， 农药浓度分别为 ： 吡虫啉 300， 600ng/ml， 甲基对硫磷 32， 64ng/ml。 0057 采用 ELISA 检测方法对以上样品进行检测， 操作如下 ： 0058 步骤 (1)、 (2) 同实施例 1 0059 (3) 加样 0060 将上述准备的吡虫啉、 甲基对硫磷溶液与抗体溶液等体积混合后加入酶标板中， 说 明 书 CN 103102415 A 6 5/5 页 7 96孔酶标板中每孔加入50ul， 37孵育。

27、1小时， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0061 (4) 加酶标二抗 0062 用含 0.05吐温 20 的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体， 96 孔酶标板中每孔加入 50ul， 37下孵育 45 分钟， 将酶标板中反应液倒尽， 并用含 0.05 吐温 20 的磷酸盐缓冲液洗涤 5 次 ； 0063 (5) 数据处理 0064 将所获得的结合率 (B/B0) 代入图 1 中吡虫啉、 甲基对硫磷的标准曲线中， 获得吡 虫啉和甲基对硫磷的浓度， 并将所获得的浓度数值乘以倍数 2。并与添加浓度相比， 获得吡 虫啉在池塘水中的添加回收率为102-104， 甲基对硫磷的添加回收率为102-104。 说 明 书 CN 103102415 A 7 1/1 页 8 说 明 书 附 图 CN 103102415 A 8 。