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一种藻类来源的植酸酶PHYN2及其基因和应用.pdf

  • 上传人：狗**
  • 文档编号：5274905
  • 上传时间：2018-12-30
  • 格式：PDF
  • 页数：29
  • 大小：10.41MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201210441235.5

    		 申请日：

    2009.12.15
    公开号：

    CN103114081A

    		 公开日：

    2013.05.22
    当前法律状态：

    驳回

    		 有效性：

    无权
    法律详情：

    发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 9/16申请公布日:20130522|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/16申请日:20091215|||公开
    IPC分类号：

    C12N9/16; C12N15/55; C12N1/21; C12P7/18; C12R1/19(2006.01)N

    		 主分类号：

    C12N9/16
    申请人：

    中国农业科学院饲料研究所
    发明人：

    姚斌; 黄火清; 杨培龙; 罗会颖; 石鹏君; 袁铁铮; 王亚茹; 柏映国; 孟昆; 史秀云
    地址：

    100086 北京市海淀区中关村南大街12号
    优先权：

    专利代理机构：

    北京法思腾知识产权代理有限公司 11318

    		 代理人：

    高宇
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    内容摘要

    本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种藻类来源的植酸酶及其基因、包含该基因的重组载体和应用。根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述藻类蓝藻，优选所述蓝藻为点状念珠藻、无类囊体蓝藻、或念珠藻。本发明首次对藻类来源的植酸酶基因进行了表达及酶学性质的研究，并证明了来源于藻类的植酸酶基因都能够在大肠杆菌表达系统中成功表达。表达得到的重组蛋白都能对植酸具有较好的水解作用，说明本发明获得的藻类来源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。

    权利要求书

    权利要求书一种藻类来源的植酸酶PHYN2，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。
    一种藻类来源的植酸酶基因phyN2，其特征在于，编码权利要求1所述的植酸酶。
    根据权利要求1所述的植酸酶基因phyN2，其特征在于，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
    一种含藻类来源植酸酶的重组菌株，其特征在于，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，其保藏编号为CGMCC No.3495。
    根据权利要求1所述植酸酶PHYN2用于水解植酸的应用。

    说明书

    说明书一种藻类来源的植酸酶PHYN2及其基因和应用
    技术领域
    本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种藻类来源的植酸酶PHYN2及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
    背景技术
    植酸酶是一类能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。单胃畜禽和淡水鱼类饲料中都需要使用植酸酶，但它们对植酸酶的性质有不同的要求。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶。对于淡水养殖的主要鱼类—鲤科鱼类，因为它们无胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性pH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性pH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于鲤科鱼类饲料。
    植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母及曲霉等。藻类生物数量庞大，且其生物特性呈现多样化，利用藻类可以生产许多稀有的天然活性物质，如色素、抗生素、抗病毒和真菌类药物、抗癌药物，以及微藻脂肪酸、多糖、维生素和甾醇等，因此利用藻类获得新型植酸酶也将是其开发应用的重要领域之一。据了解，到目前为止，还没有来源于藻类的植酸酶基因的表达及性质研究的报道。
    从整个植酸磷的循环模式来看，植酸磷可从陆地环境转移进入水体环境中，特别是在养殖业密集的区域，由于大量植物性日粮中的植酸，在单胃动物消化道中没有被水解，而随着粪便被排泄到体外，这些高植酸含量的粪便直接进入农田，但大部分植物并不能直接利用植酸，这些植酸会随着雨水流入附近的水域，而水域中的藻类可以利用植酸磷作为磷源，迅速生长造成赤潮和水体富营养化。所以，我们推测养殖业密集的区域的水体环境发生赤潮和富营养化，与藻类能直接利用植酸有一定的关系。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种藻类来源的植酸酶。
    本发明的再一目的是提供上述藻类来源的植酸酶的基因。
    本发明的再一目的是提供包括上述植酸酶基因的重组载体。
    本发明的再一目的是提供上述植酸酶基因的重组菌株。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1，其保藏编号为CGMCC No.3496。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.2，其保藏编号为CGMCC No.3494。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.3，其保藏编号为CGMCC No.3495。
    本发明的再一目的是提供制备上述植酸酶的方法。
    本发明的再一目的是提供上述植酸酶的用途。
    根据本发明的藻类来源的植酸酶，为中性、其结构域为β‑折叠桶状。
    根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述藻类蓝藻，优选所述蓝藻为点状念珠藻、无类囊体蓝藻、或念珠藻。
    根据本发明的藻类来源的植酸酶，其中，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示。
    本发明提供了编码上述藻类来源的植酸酶的基因，其中，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、或SEQ ID NO.6所示。
    本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组载体。
    本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组菌株。
    根据本发明的制备上述植酸酶的方法包括以下步骤：
    1）构建上述包含植酸酶基因的重组载体；
    2）转化宿主菌，并表达；
    3）分离纯化得到所述植酸酶。
    根据本发明的藻类来源的植酸酶可以用于鱼类饲料。
    本发明首次对藻类来源的植酸酶基因进行了表达及酶学性质的研究，并证明了来源于藻类（如点状念珠藻N.punctiforme和无类囊体蓝藻G.violaceus）的植酸酶基因都能够在大肠杆菌表达系统中成功表达。表达得到的重组蛋白都能对植酸具有较好的水解作用，说明本发明获得的藻类来源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。酶学性质的分析，表明该植酸酶结构域具有典型的BPP（beta‑折叠桶状植酸酶）植酸酶的特性，在中性条件下具有较高的催化活性，Ca2+对其的活性和热稳定性都具有重要影响，最适反应Ca2+浓度为1.5mM，最适反应pH为6.0，最适反应温度为45°C。从以上结果，我们可以推测出藻类来源的植酸酶为中性植酸酶，可以用于水产动物的饲养。
    附图说明
    图1植酸酶结构域PhyN1‑pd（图1‑a）、植酸酶PhyN1（图1‑b）、PhyG（图1‑c）、PhyN2（图1‑d）在大肠杆菌中表达及纯化的SDS‑PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；1:PhyN1‑pd；2:PhyN1；2：PhyG；3:PhyN2。
    图2重组植酸酶的最适Ca2+浓度，图2a：PhyN1‑pd；图2b：PhyN1；图2c：PhyG；图2d：PhyN2。
    图3重组植酸酶的最适pH，图3a：PhyN1‑pd；图3b：PhyN1；图3c：PhyG；图3d：PhyN2。
    图4重组植酸酶的最适反应温度，图4a：PhyN1‑pd；图4b：PhyN1；图4c：PhyG；图4d：PhyN2。
    图5重组植酸酶的热稳定性，图5a：PhyN1‑pd；图5b：PhyN1；图5c：PhyG；图5d：PhyN2。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株：大肠埃希氏菌phyN1（Escherichiacoli phyN1），所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，其保藏编号为CGMCC No.3496，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），保藏日期2009年12月3日。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株：大肠埃希氏菌phyG（Escherichiacoli phyG），所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，其保藏编号为CGMCC No.3494。
    根据本发明的含藻类来源植酸酶的重组菌株：大肠埃希氏菌phyN2（Escherichiacoli phyN2），所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，其保藏编号为CGMCC No.3495。
    具体实施方式
    实验条件：
    1、菌株及载体：
    点状念珠藻Nostocpunctiforme美国标准菌种收藏所ATCC29133，无类囊体蓝藻Gloeobacter violaceus美国标准菌种收藏所ATCC 29082，及念珠藻Nostoc sp.美国标准菌种收藏所ATCC 27893为公知菌株。大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、表达载体pET‑22b(+)（购自Novagen公司）。
    2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。
    3.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
    本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人,Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel等人编,1994)。
    实施例1点状念珠藻Nostoc punctiforme ATCC 29133的培养及其基因组DNA的提取
    用250mL三角瓶装100mL BG11培养基（100mL中含有NaNO3150mg,KH2PO44mg,MgSO4·7H2O 7.5mg,CaCl23.6mg,柠檬酸0.6mg，柠檬酸铁铵0.6mg，EDTA0.1mg,Na2CO32mg,H3BO3286ng,MnCl2·4H2O 181ng,ZnSO4·7H2O 22.2ng,CuSO4·5H2O 7.4ng,MoO3 1.5ng）,接种0.1g湿藻泥，4000lux连续光照，温度为24℃，反复式摇床培养20天，纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分用作DNA提取的材料。
    培养获得藻泥重悬于1ml 0.25mol/l的EDTA缓冲液中（pH8.0）,37℃温育30min，加入0.1ml 10%的N‑十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)溶液，继续温育15min,离心收集细胞沉淀，重悬于0.4ml重蒸水中，加入0.1ml溶菌酶（10mg/ml），37℃温育2小时，再加入0.1ml 10%SDS溶液并轻轻晃动至样品澄清，加入等体积的苯酚抽提，再用苯酚/氯仿混合液抽提，最后用氯仿抽提2次。加入2倍体积的预冷乙醇沉淀DNA,离心后溶于TE缓冲液，用于基因的克隆。
    实施例2点状念珠藻Nostoc punctiforme ATCC 29133植酸酶编码基因的克隆
    使用Pfam蛋白质家族网站(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)的β‑折叠桶植酸酶家族的所有植酸酶序列进行比对分析，可以发现在BPP植酸酶中存在两个相对比较保守的区域：D‑A‑[A/T/E]‑D‑D‑P‑A‑[I/L/V]‑W和N‑N‑[V/I]‑D‑[I/L/V]‑R‑[Y/D/Q]。在BBP植酸酶中，前一个保守区域是钙离子的结合位点，后一个保守区域在BBP植酸酶序列是催化活性中心，这两个区域在BPP植酸酶中非常保守。利用CODEHAPprimer设计的基本原理，根据这两个保守区域设计一组简并引物。在保证特异性扩增植酸酶基因的前提下，为了使引物能够与潜在的更多植酸酶基因配对结合，将设计的简并引物利用Harvard Medical School的MS‑BLAST(http://genetics.bwh.harvard.edu/msblast/)进行BLAST比对分析，然后根据比对结果优化引物序列使之能与更多的植酸酶基因配对结合。最终设计确定了BPP植酸酶的简并引物BPP‑F,5′‑GACGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG‑3′和BPP‑R,5′‑CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT‑3′。(Y代表C或T；R代表A或G；S代表C或G；N代表A，C，G或T；I代表A，C，G或T)。
    以念珠藻基因组DNA为模板，利用降落PCR的方法来扩增目标植酸酶基因片段对引物的可行性进行验证。反应体系包括：

    PCR扩增程序：94℃变性4min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，10个循环，每循环降落0.5°C；继续94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，27个循环；最后72℃保温10min。得到植酸酶保守性片段，长度为240bp，将该片段回收后测序。
    根据获得的已知序列，采用TAIL‑PCR方法分别设计上下游特异性引物（T‑5‑1:CGCCACAAATGCTGCTGATA；T‑5‑2:AATGCTGGATTGCGGGTTTA；T‑5‑3:CAAACAGTTAATCCTGGTGGT；T‑3‑1：CAGCAGCATTTGTGGCGTTA；T‑3‑2：CAGCAGCATTTGTGGCGTTA；T‑3‑3：ACCAGACAGGTCATAAACCC），扩增得到基因的全部序列。最后经过正确的拼接，最终得到全长植酸酶基因phyN1。该基因序列如SEQ ID NO.4所示。该基因编码的植酸酶由1417个氨基酸组成（SEQ ID NO.1），是一个高分子量蛋白。进一步对其蛋白结构域进行分析，初步可以确定在该完整序列中存在4个明显的结构域，它们分别是磷酸酶结构域，植酸酶结构域，碱性磷酸酶结构域，和钙离子结合域。
    实施例3无类囊体蓝藻Gloeobacter violaceus和念珠藻Nostoc sp.植酸酶编码基因的克隆
    选用无类囊体蓝藻Gloeobacter violaceus ATCC 29082和念珠藻Nostoc sp.ATCC27893，其培养方法和基因克隆方法分别如前实施例所述。结果从无类囊体蓝藻Gloeobacter violaceus ATCC 29082中克隆得到基因phyG（SEQ ID NO 5），其编码BPP植酸酶含有374个氨基酸（SEQ ID NO 2）。
    从念珠藻Nostoc sp.ATCC 27893中分离得到基因phyN2（SEQ ID NO.6），其编码BPP植酸酶含有1821个氨基酸（SEQ ID NO.3）。
    实施例4含有藻类来源BPP植酸酶编码基因异源表达载体的构建
    1.全长植酸酶基因中植酸酶结构域phyN1‑pd表达载体的构建
    由于获得的全长phyN1序列中包含4个不同的结构域，我们设计分别进行全长基因和植酸酶结构域的表达。首先根据N.punctiforme完整植酸酶基因phyN1中的单独的植酸酶结构域序列，设计扩增的表达引物，N73‑Ph‑F，5′‑CTTGCCATGGATGACTTGGTTCCAACTGCTGCACC‑3′和N73‑Ph‑R，5′‑CAGGCGGCCGCTTATGTCAGGTTAACAGGATTGCGG‑3′，并在引物末端分别引入酶切位点Nco I和Not I，以N.punctiforme的基因组DNA为模版进行PCR扩增。PCR反应参数为：95°C 5min；94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，32个循环；72°C 10min。扩增获得片段用Nco I和Not I酶切后，连接到载体pET‑22b‑lic中，获得含有该植酸酶编码基因的重组质粒pET‑PhyN1‑pd。
    2.全长植酸酶基因phyN表达载体的构建
    根据N.punctiforme完整植酸酶基因phyN1的序列，对该基因采用了分段克隆的办法来构建表达载体。具体步骤如下：(1)将PhyN基因分成A，B，C三片段，分别进行PCR扩增。所用引物分别如下表1所示。
    表1

    PCR反应参数为：95°C 5min；94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，32个循环；72°C 10min。扩增获得的A，B，C三片段分别与pUC19载体连接，阳性克隆通过测序正确后用于下一步的拼接。先将测序正确的B段从pUC19‑B载体中用BamHI和Pst I切下来，再通过BamH I和Pst I连接到测序正确的pUC19‑A上，构建好pUC19‑AB载体。再将C片段通过Pst I和Not I酶切下来与构建好pUC19‑AB载体通过Pst I和Not I连接，最终构建成为pUC19‑ABC载体。该载体上含有测序正确的完整的PhyN基因。最后通过Nco I和Not I与pET30a(+)连接获得完整的表达载体pET‑PhyN1。
    3.植酸酶基因PhyG表达载体的构建
    根据已克隆的G..violaceus植酸酶基因的成熟蛋白编码基因序列设计表达引物：Glv‑mF，5′‑GACGGATCCACTGCTCCGGTGGCAACCGTCC‑3′（含有BamH I位点）和Glv‑mR，5′‑GACGCGGCCGCTTAGAGCCCGTAGCCGGTGCGCGGATTCC‑3′（含有Not I位点），以G.violaceus的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：95°C 5min；94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，32个循环；72°C 10min。扩增获得片段酶切后，连接到载体pET‑22b‑lic中，获得含有该植酸酶编码基因的重组质粒pET‑PhyG。
    4.植酸酶基因PhyN2表达载体的构建
    构建方法同上，获得含有该植酸酶编码基因的重组质粒pET‑PhyN2。
    实施例5藻类来源BPP植酸酶编码基因在大肠杆菌中的异源表达
    实施例4中所述四种表达载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，分别获得重组菌株pET‑PhyN1‑pd/DE3，pET‑PhyN1/DE3，pET‑PhyN2/DE3和pET‑PhyG/DE3。
    取含有重组质粒的BL21（DE3）菌株和含有pET‑22b（+）空质粒的BL21（DE3）菌株（作对照），分别接种于3mL LB（加有100μg/mL的氨苄青霉素和1mM CaCl2）培养液中，37℃快速振荡培养过夜；按照1/100体积接种过夜培养液于含有100μg/mL氨苄青霉素的20mLLB（1mM CaCl2）培养液中（100mL三角瓶），快速振荡培养约2h（OD600达到0.6），加入1/1000体积1mol/L的诱导剂IPTG，同时加入过滤灭菌的Ca2+，使Ca2+的终浓度达到2mM，25℃振荡培养10‑24h，使其表达目的蛋白。取1mL诱导液10,000rpm离心5min，收集上清和沉淀。上清液直接检测BPP植酸酶的活性。沉淀菌体用蒸馏水洗两次，再用1mL pH 7.0Tris‑HCl缓冲液洗一次，用600μL pH7.0Tris‑HCl缓冲液洗悬浮，用约100Hz的频率超声波击打细胞，每次6sec，每次击打后的间隔时间15sec，直至菌液变为澄清。13,000rpm离心5min，去除细胞碎片，检测胞内BPP植酸酶的活性。同时各种提取液取出20μL加入5×电泳上样缓冲液，沸水煮5min，与同样处置的含有空质粒pET‑22b(+)‑lic的菌体BL21进行SDS‑PAGE电泳检测。
    经过诱导表达后，各重组菌株表达情况如下表2所示。
    表2
    所含载体胞外酶活性(U/mL)胞内酶活性(U/mL)pET‑PhyN1‑pd1.160.43pET‑PhyN1/0.84pET‑TfxA‑PhyG0.390.21pET‑PhyN2/0.72
    SDS‑PAGE结果也表明，三个基因在大肠杆菌中得到了表达。如图1所示，分别为三个菌株诱导表达的电泳结果。以上结果证明藻类来源的三种基因均具有植酸酶活性。
    实施例6重组植酸酶的纯化
    1.植酸酶结构域PhyN1‑pd的纯化
    将菌液于4°C、12,000rpm离心10min，留上清(粗酶液)；过膜包(截流大小3kD)：将1L粗酶液浓缩到50mL左右；疏水柱层析：将浓缩后的酶液过Phenyl SepharoseHP column(1mL)疏水层析柱。平衡缓冲液为含有20%(w/v)的硫酸铵的50mM，pH 7.0Tris‑HCl缓冲液。利用降落梯度的硫酸铵浓度(20‑0%)的洗脱柱子。收集洗脱峰，得到电泳纯的目标蛋白，再利用Nanosep Centrifugal 10K Device超滤管浓缩收集洗脱峰。然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。如图1所示，显示纯化后的植酸酶蛋白仅有一条单一的条带，表明得到了电泳纯植酸酶，得率为7.5%。
    2.植酸酶PhyN1、PhyN2和PhyG的纯化
    将三种植酸酶的重组菌液诱导培养液于4℃、12,000rpm离心10min，获得上清（粗酶液）；根据NEB的装柱说明书将1mL的NTA柱质加到空柱子中，并准备如下pH 7.6缓冲液：
    1)NTA‑0，20mmol/L Tris‑HCl；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    2)NTA‑20，20mmol/L Tris‑HCl；20mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    3)NTA‑40，20mmol/L Tris‑HCl；40mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    4)NTA‑60，20mmol/L Tris‑HCl；60mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    5)NTA‑80，20mmol/L Tris‑HCl；80mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    6)NTA‑100，20mmol/L Tris‑HCl；100mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油；
    7)NTA‑200，20mmol/L Tris‑HCl；200mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10%(w/v)甘油。
    具体纯化步骤是：
    1)将粗酶液溶于用NTA‑0溶液中用于镍柱纯化；
    2)菌体部分经过离心后加入NTA‑0溶液重悬，12,000rpm离心10min去上清，然后用5mL NTA‑0重悬细胞(约200mL培养物所得到的细胞)。超声破碎条件为冰浴中破碎，破碎3sec停止4sec每组80次。13,000rpm离心15min。仔细吸取上清液作为上柱样品；
    3)柱子用10‑20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加；
    4)再用15‑20mLNTA‑0平衡，加样品5mL并开始收集穿透峰；
    5)20‑25mL NTA‑0洗脱去杂蛋白，然后依次加入NTA‑20、NTA‑40、NTA‑60、NTA‑80、NTA‑100、NTA‑200、NTA‑300每种缓冲液5mL洗脱并收集洗脱液；
    然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。如图1所示，显示得到了电泳纯植酸酶。
    实施例7重组植酸酶PhyN‑pd酶学性质的分析
    植酸酶的活性分析方法
    酶活测定方法为：将酶液用含有0.05%BSA和0.05%Triton X‑100的0.1mol/L的pH7.0 Tris‑HCl并且加入1mM CaCl2的缓冲液稀释，取50μL稀释酶液加底物1.5mmol/L植酸钠950μL（用0.1mol/L的pH7.0 Tris‑HCl缓冲液配制，并且加入1mMCaCl2），37℃反应15min，加1mL10%TCA终止反应，加2mL显色液（10g四水合钼酸铵+32mL硫酸+73.2g硫酸亚铁，加水定容至1L）。对照则加酶液后先加TCA混匀，再加底物。显色后700nm下测其OD值，计算酶活。
    一个酶活性单位(U)定义为:在一定条件下,每分钟释放出1nmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。
    1.最适Ca2+浓度测定
    在1.5mmol/L pH 7.5的植酸钠底物中加入不同浓度的CaCl2，在37°C中测定酶活性，研究Ca2+浓度对酶活性的影响。结果表明在不添加Ca2+的情况下基本测不到活性，在Ca2+浓度为1.5mM时能够检测到最大的活性，且随着Ca2+浓度增加，酶活性有所降低，结果如图2a所示，进一步说明β‑折叠桶植酸酶的活性是依赖一定浓度Ca2+的存在。
    2.最适反应pH值的测定
    最适pH的测定为底物植酸钠用一系列不同pH值的缓冲液(pH2.0‑3.5，HCl‑Gly缓冲液;pH4.0‑5.8，HAc‑NaAc缓冲液;pH6.0‑6.5，咪唑‑HCl;pH7.0‑9.0，Tris‑HCl缓冲液)配制,37℃下在这些不同的缓冲体系中进行酶促反应，测定酶活性。结果如图3a所示，表明,该酶的最适pH为6.0，在pH 5.5‑8.0范围内，酶活性维持在60%以上，pH在5.0以下及9.5以上，基本检测不到植酸酶活性，说明该酶在中性条件下具有较高的植酸酶活性。
    3.最适反应温度及热稳定性
    在最适pH及最适Ca2+浓度下，在不同温度(30°C–85°C)条件下进行酶促反应以确定最适温度；热稳定性测定为在65°C及含有5mM Ca2+浓度下将酶液分别处理5、10、20、30min后迅速置于冰上，在37°C及最适pH和Ca2+浓度条件下进行酶活性测定；每次测定重复3次,取平均值。反应最适温度测定结果表明，重组植酸酶PhyN1‑pd最适温度为45°C，当温度超过65°C时，基本检测不到植酸酶活性(结果如图4a)。热稳定性实验结果表明在处理酶液时加入Ca2+可以明显提高酶的稳定性，在酶液中添加终浓度为5mM的Ca2+时，65°C保温15min，仍有60%的相对活性。而不添加Ca2+时，65°C保温2min酶的活性全部损失(如图5a)。
    实施例8植酸酶PhyN1、PhyG和PhyN2的酶学性质的分析
    利用实施例7提供的方法，及操作流程。分别对PhyN1、PhyN2和PhyG的酶学性质进行分析，其最适合钙离子浓度如图2b‑d所示；其最适合反应pH如图3b‑d所示；其最适合反应温度如图4b‑d所示；其65°C时的热稳定性如图5b‑d所示。

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    一种 藻类 来源 植酸酶 PHYN2 及其 基因 应用
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