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1、(10)申请公布号 CN 103122335 A (43)申请公布日 2013.05.29 CN 103122335 A *CN103122335A* (21)申请号 201210315986.2 (22)申请日 2012.08.30 CCTCC NO:C201297 2012.08.15 C12N 5/073(2010.01) A01N 1/02(2006.01) (71)申请人 中国科学院广州生物医药与健康研 究院 地址 510000 广东省广州市科学城开源大道 190 号 (72)发明人 李鹏 刘志新 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 刘孟斌 (54) 。
2、发明名称 小鼠胎肝细胞 PL08 及其建立方法和在成熟 红细胞保存中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种新的小鼠胎肝细胞系PL08 （CCTCC NO:C201297）在红细胞体外保存中的应 用。 该细胞系作为基质细胞， 能很好地支持红细胞 的体外保存， 可以应用于体外常温保存成熟人体 红细胞。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103122335 A CN 103122335 A *CN103122335。
3、A* 1/1 页 2 1. 小鼠胎肝细胞 PL08 CCTCC No.C201297。 2. 小鼠胎肝细胞 PL08 的建立方法 ： a. 取 C57/BL6 小鼠第 11 天的胎肝， 用带有 27G 针头的无菌注射器反复吹打， 以使组织 解离， 分散为单个细胞 ； b. 用红细胞裂解液去除红细胞后， 将细胞培养在 0.1明胶包被过的细胞培养板上， 培养基成分为 ： aMEM 培养基， 添加 10 -15的胎牛血清 ； c. 经过 4 到 5 天的培养， 去除上清， 将贴壁细胞用 0.05的胰酶消化下来， 常规方法扩 大培养、 传代， 每次传代过程中保留 30的原培养液， 添加 70的新鲜培养。
4、液。 3. 根据权利要求 2 所述的建立方法， 其特征在于细胞培养、 传代的温度为 37 摄氏度， PH 值为 7.2。 4. 小鼠胎肝细胞 PL08 在成熟红细胞保存中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于在体外常温保存成熟人体红细胞。 权 利 要 求 书 CN 103122335 A 2 1/2 页 3 小鼠胎肝细胞 PL08 及其建立方法和在成熟红细胞保存中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及利用一种新细胞系， 特别是小鼠胎肝细胞 PL08 保藏日期 ： 2012 年 8 月 3 日、 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） 、 保藏编号 ： C20。
5、1297 及其建立方法 和应用。 背景技术 0002 成分输血技术在现代医学中广泛应用， 红细胞保存的研究在临床医学中有巨大应 用价值。 红细胞保存的质量及保存期的长短已成为衡量一个国家临床输血水平的一个重要 指标。目前红细胞的保存方法主要有液体保存法、 冰冻保存法和冰冻干燥保存法。其中液 体法一般指的是4低温保存法， 冰冻保存指-80或-196深低温保存。 常温条件下保存 红细胞还是目前临床应用中的一个空白。 发明内容 0003 本发明的目的为 ： 提供一种新的小鼠胎肝细胞系 PL08 及其建立方法， 以及该细胞 系在体外常温保存成熟人体红细胞中的应用。 0004 技术方案为 ： 使用 PL。
6、08 细胞系作为基质细胞， 与成熟人体红细胞共培养。 0005 PL08 细胞系是发明人建立的一株小鼠胎肝细胞系。其建立的过程如下 ： 0006 取 C57/BL6 小鼠第 11 天的胎肝， 用带有 27G 针头的无菌注射器反复吹打， 以使组 织解离， 分散为单个细胞。用红细胞裂解液去除红细胞后， 将细胞培养在 0.1明胶包被过 的细胞培养板上， 培养基成分为 ： aMEM 培养基， 添加 15的胎牛血清。经过 4 到 5 天的培 养， 去除上清， 将贴壁细胞用 0.05的胰酶消化下来， 常规方法扩大培养、 传代， 每次传代过 程中保留 30的原培养液， 添加 70的新鲜培养液。在本实验室， 。
7、PL08 细胞系已经稳定传 代 60 代以上， 培养时间超过 1 年， 细胞大小均一， 生长速度稳定。 0007 PL08 细胞系为亚三倍体核型， 染色体条数为 58-62 条 （见图 1） 。该细胞系在添加 10胎牛血清的 aMEM 培养基中生长良好， 接种后 1 至 2 天的细胞群体倍增时间为 22.4 小 时， 最适生长温度为 37 摄氏度， 最适生长 PH 值为 7.2。 0008 经反复实验证实， PL08 细胞系可以很好的维持成熟人体红细胞的活性， 在体外常 温保存成熟人体红细胞中有巨大的应用价值。 附图说明 0009 图 1 为该细胞系 124 代核型分析图像。 0010 图 2。
8、 是培养细胞显微图像。 0011 图 3 是脐带血在 37 摄氏度， 5 CO2的培养条件下和与 PL08 共培养条件下培养 12 天， 细胞形态比较示意图。 0012 图 4 是脐带血在在 37 摄氏度， 5 CO2的培养条件下培养 18 天， 细胞形态比较示 说 明 书 CN 103122335 A 3 2/2 页 4 意图。 0013 小鼠胎肝细胞 PL08 保藏日期 ： 2012 年 8 月 3 日 ； 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏 中心 （CCTCC） ； 保藏编号 ： C201297 ； 保藏地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学。 具体实施方式 0014 下述实施例中， 所用。
9、试剂材料及其来源包括 ： 0015 PL08 细胞系由发明人构建， 脐带血由广州脐带血干细胞库提供。流式抗体 GPA/ CD71 为 eBioscience 产品， StemSpan 无血清培养基为 STEMCELL 公司产品， 细胞因子 human Insulin-like growth factor(hIGF)、 Human Erythropoietin(hEPO)、 human stem cell factor(hSCF)、 human interleukin 3(hIL3) 为 PeproTech 公 司 产 品， Lipids 和 Dexametasone 为 Sigma-Aldri。
10、ch 公司产品， 细胞培养板为 Corning Costar 公司产品。 0016 实施例 1 PL08 作为基质细胞与脐带血细胞共培养实验 0017 脐带血解冻后， 重悬于 10ml PBS 缓冲液中， 对分离到的细胞进行计数。将细胞稀 释至 1X106个 /ml， 分两组培养。第一组作为对照组， 培养在 stemspan 培养基中， 添加的细 胞因子及浓度如下 ： lipids(40ug/ml)， Dexametasone(1um)， hEPO(20ng/ml)， hSCF(100ng/ ml)， hlGF1(40ng/ml)， hlL3(10ng/ml)。第二组作为实验组， 与 PL08。
11、 基质细胞共培养， 培养 基及细胞因子成分与第一组相同。 0018 如图 3 细胞照片所示， 在培养第 12 天， 实验组的细胞 （图 3B） 状态良好， 同时可见 生长状态良好的成熟红细胞 （红色箭头所示） ； 对照组 （图 3A） 有大量细胞发黑变暗， 显示正 在凋亡。 0019 如图4， 在培养第18天， 实验组 （图4B） 仍然可看到状态良好的成熟红细胞 （红色箭 头所示） ， 对照组 （图 4A） 则发现大量细胞正在裂解、 死亡。 说 明 书 CN 103122335 A 4 1/2 页 5 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103122335 A 5 2/2 页 6 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103122335 A 6 。