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生物催化制备6氰基3R,5R二羟基己酸叔丁酯及菌株.pdf

  • 上传人：狗**
  • 文档编号：5273841
  • 上传时间：2018-12-30
  • 格式：PDF
  • 页数：14
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    • 摘要
    申请专利号：

    CN201310024358.3

    		 申请日：

    2013.01.22
    公开号：

    CN103122320A

    		 公开日：

    2013.05.29
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/16申请日:20130122|||公开
    IPC分类号：

    C12N1/16; C12P13/00; C12R1/84(2006.01)N

    		 主分类号：

    C12N1/16
    申请人：

    浙江工业大学
    发明人：

    郑裕国; 王亚军; 盛骏桢; 罗希; 沈寅初
    地址：

    310014 浙江省杭州市下城区潮王路18号
    优先权：

    专利代理机构：

    杭州天正专利事务所有限公司 33201

    		 代理人：

    黄美娟;冷红梅
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    内容摘要

    本发明提供了一株具有高立体选择性羰基还原酶活性微生物菌种——卡里比克毕赤酵母菌（Pichia caribbic）ZJB-09225，及其在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCC No：M2012411，保藏日期为2012年10月18日。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株具有较好非对映选择性羰基还原酶活性的菌株，为生物催化法生产6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯提供了基础。

    权利要求书

    权利要求书一株具有反‑Prelog非对映选择性羰基还原酶活性的菌株——卡里比克毕赤酵母菌（Pichiacaribbic）ZJB‑09225，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCC No：M2012411，保藏日期为2012年10月18日。
    如权利要求1所述的菌株，其特征在于该菌株的16S rDNA基因序列如下：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CAGTATTCTTTTGCCAGCGC TTAACTGCGC GGCGAAAAAC CTTACACACAGTGTCTTTTT GATACAGAAC TCTTGCTTTG GTTTGGCCTAGAGATAGGTT GGGCCAGAGG TTTAACAAAA CACAATTTAATTATTTTTAT TGATAGTCAA ATTTTGAATT AATCTTCAAAACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAA GTAATATGAA TTGCAGATTTTCGTGAATCA TCGAATCTTT GAACGCACAT TGCGCCCTCTGGTATTCCAG AGGGCATGCC TGTTTGAGCG TCATTTCTCTCTCAAACCCC CGGGTTTGGT ATTGAGTGAT ACTCTTAGTCGAACTAGGCG TTTGCTTGAA AAGTATTGGC ATGGGTAGTACTGGATAGTG CTGTCGACCT CTCAATGTAT TAGGTTTATCCAACTCGTTG AATGGTGTGG CGGGATATTT CTGGTATTGTTGGCCCGGCC TTACAACAAC CAAACAAGTT TGACCTCAAATCAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATAAGCGGAGG。
    如权利要求1所述的菌株在生物不对称还原(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用。
    如权利要求3所述的应用，其特征在于所述不对称还原在pH7~8、32~37℃下进行。

    说明书

    说明书生物催化制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯及菌株
    （一）技术领域
    本发明涉及一株具有反‑Prelog非对映选择性羰基还原酶活性的菌株——卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbic）ZJB‑09225，及其在生物催化法制备光学纯6‑氰基‑（3R,5R）‑二羟基己酸叔丁酯中的应用。
    （二）背景技术
    手性药物在许多疾病的防治中具有重要意义，其合成研究受到学术界、企业以及政府的高度重视。具有特定功能基团的手性醇更是许多手性药物合成的关键手性砌块，并且在制药、农药、香料等精细化工方面有着十分广泛的应用。心血管疾病成为对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过恶性肿瘤性而跃居第一。据世界卫生组织统计，全世界每年有3000多万人死于心脑血管疾病。中国每年因心脑血管疾病及并发症死亡病例超过300万。积极治疗高血脂症是预防心脑血管疾病的关键，降血脂药物开发已经成为全球药物研究的重点和热点。他汀类药物是目前主要的降血脂药物，其对胆固醇生物合成过程中的限速酶——3‑羟基‑3‑甲基辅酶A（HMG‑CoA）还原酶具有显著抑制作用，降低细胞游离胆固醇水平，反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生。
    全球开发和在研的他汀类药物已有十多个品种。第一代他汀药物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一类结构类似的真菌代谢物。第二代他汀包括化学合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光学纯他汀药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀类降脂药占世界降脂药市场的85%以上份额，并仍具有提升空间。
    手性β,δ‑二羟基己酸（酯）结构是合成他汀药物的药效基团、手性砌块，也是合成他汀药物的重点和难点。他汀类药物的最终质量取决于手性侧链对应异构体的光学纯度，各国药监部门要求e.e.值大于99.5%，d.e.值大于99%。6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯是他汀类药物合成的手性砌块，合成工艺包括化学不对称合成和生物不对称合成。6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯化学合成方法存在诸多缺陷，合成需要使用剧毒的三乙基硼和‑85℃深冷条件，而且非对映诱导不充分，产物6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯d.e.值低，该反应形成的硼化物废物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。与化学方法相比，生物合成法具有以下优点：
    （1）立体、区域和化学选择性高，这主要是因为酶对底物、产物的严格的专一性识别；而使用化学合成方法时，只有当羰基两边的基团差异很大时才能获得较高的立体选择性；（2）安全性与环境相容性好，生物催化安全且反应条件温和，通常以水溶液作为反应体系，环境友好。
    具有羰基还原酶（醇脱氢酶）活性微生物广泛存在于自然界中，但他们不对称还原羰基往往遵循Prelog还原规则、产物构型为S构型；具有反‑Prelog立体选择性羰基还原酶活性的微生物在自然界中非常罕见。迄今为止，文献报道的具有不对称还原(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯活性的微生物菌种有Saccharomyces cerevisiae，Pichia angusta NCYC 495，Pichia angusta NCYCR320，Pichia angusta NCYC R322，Pichia haplophila CBS2028，Beauveria bassiana，Pichia pastoris，Pichia membranefaciens，Pichia angusta，Candida humicola，Candida solani，Candida diddensiae，Candida friedrichii，Kluyveromyces drosophilarum。目前，未见Pichia caribbic具有(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯非对映选择性羰基还原酶活性的报道。
    （三）发明内容
    本发明目的是克服现有的6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯生产技术的不足，提供一种从土壤中富集、筛选具有高立体选择性羰基还原酶活性微生物菌种——卡里比克毕赤酵母菌（Pichia caribbic）ZJB‑09225，及其在生物不对称还原(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用。
    本发明采用的技术方案是：
    一株具有反‑Prelog非对映选择性羰基还原酶活性的菌株——卡里比克毕赤酵母菌（Pichia caribbic）ZJB‑09225，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCC No：M2012411，保藏日期为2012年10月18日。经鉴定，该菌株属于毕赤酵母属（Pichia）的caribbic种，菌株编号为ZJB‑09225。
    菌株菌落形态：菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形，不透明，表面光滑、隆起。
    细胞形态：细胞呈卵圆形，大小约1.5μm×2.5μm,形态示于图1。
    生理生化特征：利用Vitek2微生物自动鉴定系统测定菌株ZJB‑09225对46种鉴定试验的鉴定结果，经Vitek2读数仪分析代谢指标，确定菌株ZJB‑09225属于毕赤酵母属（Pichia）的caribbic种，同源性98%（详见表1）。
    表1：利用Vitek2微生物自动鉴定系统分析菌种ZJB‑09225碳/氮源利用
    结果
    实验结果实验结果L‑赖氨酸芳胺酶‑D‑山梨糖同化+L‑苹果酸同化+L‑鼠李糖同化‑亮氨酸芳胺酶+木糖醇同化+精氨酸GP+D‑山梨醇同化+赤藻糖醇同化+蔗糖同化+丙三醇同化‑尿素酶‑酪氨酸芳胺酶‑α‑葡萄糖苷酶+β‑N‑乙酰葡萄糖胺酶‑D‑羽红糖同化+杨梅酸同化+D‑海藻糖同化+苦杏仁苷同化‑硝酸盐同化‑α‑半乳糖同化+L‑阿拉伯糖同化+龙胆二糖同化+D‑半乳糖醛同化+D‑葡萄糖同化+七叶灵水解‑乳糖同化‑L‑谷氨酸盐同化+甲基葡萄糖苷同化+木糖同化+D‑纤维二糖同化+DL‑乳酸盐同化+γ‑谷氨酰转移酶‑醋酸盐同化+D‑麦芽糖同化+柠檬酸盐同化+D‑棉子糖同化+普糖醛酸同化+PNP‑N‑乙酰‑BD‑半乳糖氨酶‑L‑脯氨酸同化+D‑甘露糖同化+2‑酮基‑葡萄糖酸盐同化+D‑蜜二糖同化‑N‑乙酰‑氨基葡萄糖同化+D‑松三糖同化+D‑葡萄糖酸盐同化+
    18S rDNA序列分析：以提取到的菌株ZJB‑09225细胞总DNA为模板，利用引物：pITS1:5'‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3'和pITS4:5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3'扩增菌株ZJB‑09225的16SrDNA基因，将经PCR扩增的片段克隆到T载体后，抽提质粒后的含有获得的18S rDNA片段的重组质粒，经测序确认该片段实际长度为606bp，具体如下：
    TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CAGTATTCTTTTGCCAGCGC TTAACTGCGC GGCGAAAAAC CTTACACACAGTGTCTTTTT GATACAGAAC TCTTGCTTTG GTTTGGCCTAGAGATAGGTT GGGCCAGAGG TTTAACAAAA CACAATTTAATTATTTTTAT TGATAGTCAA ATTTTGAATT AATCTTCAAAACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAA GTAATATGAA TTGCAGATTTTCGTGAATCA TCGAATCTTT GAACGCACAT TGCGCCCTCTGGTATTCCAG AGGGCATGCC TGTTTGAGCG TCATTTCTCTCTCAAACCCC CGGGTTTGGT ATTGAGTGAT ACTCTTAGTCGAACTAGGCG TTTGCTTGAA AAGTATTGGC ATGGGTAGTACTGGATAGTG CTGTCGACCT CTCAATGTAT TAGGTTTATCCAACTCGTTG AATGGTGTGG CGGGATATTT CTGGTATTGTTGGCCCGGCC TTACAACAAC CAAACAAGTT TGACCTCAAATCAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATAAGCGGAGG。
    将获得的基因序列与GenBank数据进行相似性分析，菌株ZJB‑09225与Pichiacaribbic（FN428931.1）同源性达到100%（homology，100%/606bps，based on18SrDNA）。因此，确定菌株ZJB‑09225属于Pichia属的caribbic种，中文名称为卡里比克毕赤酵母。
    综合上述结果，该菌株属于经分子遗传学鉴定，菌株ZJB‑09225确定为卡里比克毕赤酵母菌，拉丁名为Pichiacaribbic。
    所述的菌株在生物不对称还原(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用。
    该反应涉及的反应式如下：

    优选的，所述不对称还原反应在pH7~9、32~37℃下进行。
    具体的，所述应用可如下：在pH7~9的缓冲液中，加入(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯作为底物，以卡里比克毕赤酵母菌（Pichia caribbic）ZJB‑09225含酶菌体细胞作为催化剂，在32~37℃下反应10~20h，反应液分离纯化获得6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯；底物初始浓度为10~50g/L缓冲液，含酶菌体细胞添加量为10~50g DCW/L缓冲液。
    为促进反应进行，所述缓冲液中还可添加10~50g/L的辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、甲醇、乙醇、甘油、甲酸、异丙醇、正丁醇、葡糖酸钠、果糖、山梨醇、甘露糖、甘露醇，优选为葡萄糖。
    所述含酶菌体细胞可按如下方法获得：将卡里比克毕赤酵母菌（Pichia caribbic）ZJB‑09225接种至适宜卡里比克毕赤酵母菌的发酵培养基，于pH7~9、28~37℃下振荡培养2~3天，发酵液离心，收集菌体生理盐水洗涤，即得所述含酶菌体细胞。
    所述发酵培养基组成可如下：麦芽浸粉10~50g/L，葡萄糖10~50g/L，CuSO41~5mg/L，KH2PO41~5g/L，K2HPO4·3H2O1~5g/L，NaCl0.5~2g/L，溶剂为水，pH7~9。
    本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株具有较好非对映选择性羰基还原酶活性的菌株，为生物催化法生产6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯提供了基础。
    （四）附图说明
    图1为卡里比克毕赤酵母菌的细胞形态照片；
    图2为发酵培养基初始pH对菌株酶活的影响；
    图3为发酵培养温度对菌株酶活的影响；
    图4为转化温度对不对称还原反应的影响；
    图5为反应pH值对不对称还原反应的影响；
    图6为反应时间对不对称还原反应的影响。
    （五）具体实施方式
    下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
    实施例1：筛选具有催化(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯还原活性微生物菌株
    将采集于全国各地的土样用生理盐水按一定的比例分散后接种至含有0.40g/L(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯的富集培养基（配制：50.0g葡萄糖，100.0g黄豆芽煮沸30分钟，加入0.40g(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯，加水补足至1.0L，不调节pH值）中，在30℃、150rpm条件下，摇床振荡培养直至培养液变浑浊后，按照2.0%（v/v）接种量转接到含有0.80g/L(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯的富集培养基中，继续在30℃、150rpm条件下培养。依次提高富集培养基中(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯浓度，直至达到2.0g/L。
    将最后一次的富集培养液逐级稀释、涂布到平板培养基上30℃培养至形成可观察到的单菌落。挑取单菌落转接至无菌斜面（配制：50.0g葡萄糖，100.0g黄豆芽煮沸30分钟，琼脂20.0g，加水补足至1.0L，不调节培养基pH值；115℃灭菌30分钟，冷却制成斜面），30℃培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。
    将保藏在试管斜面中的菌株逐一接种到发酵培养基（配制：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH2PO40.50g/L，K2HPO40.50g/L，MgSO40.50g/L，NaCl1.00g/L，pH8.0，115℃灭菌30分钟）中，在30℃、150rpm条件下培养48小时。分别移取20.0mL培养物，离心，收集菌体，并用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）洗涤菌体3次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加的(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到5.0~20.0g/L，35℃转化2小时，转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析羰基还原酶活性。在筛选菌株中，Pichia caribbic ZJB‑09225，即CCTCC No：M2012411，活力最强，非对映体选择性较好。
    羰基还原酶活力定义为：35℃，pH7.5条件下，每分钟催化生成1μmol6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1个酶活单位。
    实施例2：发酵培养基初始pH值对P.caribbic ZJB‑09225羰基还原酶体积酶活的影响
    对将保存在试管斜面上的P.caribbic ZJB‑09225菌种挑取一接种环菌体接种到无菌发酵培养基中，发酵培养基的组分配方如下：麦芽浸粉30.0g/L，葡萄糖20.0g/L，CuSO43.0mg/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，NaCl1.0g/L，溶剂为水，温度28℃，发酵培养基初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，150rpm条件下培养2天，收集发酵液。
    将发酵液12000rpm离心8分钟，弃上清，收集菌体，用生理盐水洗涤3次后称取1g湿菌体，再用10.0mL、pH7.0的磷酸缓冲液（50mM）将洗涤过的细胞分散在转化瓶中，加入0.14g(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯与0.20g葡萄糖，置于水浴摇床30℃，反应24小时，取1.0mL转化液，12000rpm离心6分钟，上清液采用0.45μm微滤膜过滤。得到的澄清的滤液进行液相色谱分析6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯浓度，计算各条件下的羰基还原酶活力，结果见图2。结果表明，在pH7.0下，菌株羰基还原酶活性最强，生物量为28.80g/L，体积酶活达到5.90U/L，d.e.值＞95.0%。
    实施例3：培养温度对P.caribbic ZJB‑09225羰基还原酶体积酶活的影响
    对将保存在试管斜面上的P.caribbic ZJB‑09225菌种挑取一接种环菌体接种到无菌发酵培养基中，发酵培养基组分配方如下：麦芽浸粉30.0g/L，葡萄糖20.0g/L，CuSO43mg/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，NaCl1.0g/L，溶剂为水，pH7.0，在温度分别为23℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃，150rpm条件下培养2天，收集发酵液。
    将发酵液12000rpm离心8分钟，弃上清，收集菌体，用生理盐水洗涤3次后称取1g湿菌体，再用10.0mL、pH7.0磷酸缓冲液（50mM）将洗涤过的细胞分散在转化瓶中，加入0.14g(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯与0.20g葡萄糖，置于水浴摇床30℃，反应24小时，取1.0mL转化液，12000rpm离心6分钟，上清液采用0.45μm微滤膜过滤。得到的澄清的滤液进行液相色谱分析6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯浓度，计算各条件下的羰基还原酶活力，结果见图3。结果表明，在30℃条件下，菌株羰基还原酶活性最强，生物量达到29.90g/L，体积酶活达到6.62U/L，d.e.值＞95.0%。
    实施例4：生物催化剂P.caribbic ZJB‑09225细胞制备
    从本发明选育得到的新羰基还原酶产生菌种P.caribbic ZJB‑09225的试管斜面上挑取一环菌体，接种至30.0mL无菌种子培养基（配制:50.0g葡萄糖，黄豆芽100.0g煮沸30分钟，过滤，水补足至1.0L，培养基pH自然。培养基121℃灭菌20分钟）中，30℃、150rpm条件下振荡培养基24小时，获得种子液。3.0mL种子液接种至100.0mL无菌发酵培养液（配制：麦芽浸粉30.0g/L，葡萄糖20.0g/L，CuSO43mg/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，NaCl1.0g/L，溶剂为水，pH7.0），30℃，150rpm条件下培养2天，收集发酵液。发酵液12000rpm离心8分钟后，弃上清收集菌体，菌体用0.85%生理盐水洗涤3次，收集获得3.60gP.caribbic ZJB‑09225菌体，该菌体对(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯具有反‑Prelog非对映选择性羰基还原酶活性。
    实施例5：转化温度对催化工艺的影响
    选用本发明制备的生物催化剂P.caribbic ZJB‑09225含酶菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH7.0磷酸缓冲液（50.0mM），P.caribbicZJB‑09225细胞终浓度为20.0g DCW/L，14g/L(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯，20g/L葡萄糖，分别在20℃、23℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、45℃下转化3小时，转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析各支菌种的羰基还原酶活性，分析不同转化温度对催化过程酶活力的影响，结果见图4。结果显示，35℃时P.caribbic ZJB‑09225催化效率最高，得率达到7.71%，比酶活达到0.89U/g，d.e.值95.5%。
    实施例6：转化pH对催化工艺的影响
    选用本发明制备的生物催化剂P.caribbic ZJB‑09225菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH值分别为3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0磷酸钾缓冲液（50.0mM），P.caribbic ZJB‑09225细胞终浓度为20.0g DCW/L，添加(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯至终浓度为14.0g/L，35℃转化3小时。经液相检测6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯浓度和d.e.值，结果见图5。结果显示，pH7.5条件下P.caribbic ZJB‑09225催化效率最高，得率达到9.68%，比酶活达到1.41U/g，d.e.值96.3%。
    实施例7：辅助底物对催化工艺的影响
    选用本发明制备的生物催化剂P.caribbic ZJB‑09225菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH7.0磷酸缓冲液（50mM），ZJB‑09225细胞终浓度为20.0g DCW/L，14g/L的(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯，分别加入20g/L葡萄糖、甲醇、乙醇、甘油、甲酸、异丙醇、正丁醇、葡糖酸钠、果糖、山梨醇、甘露糖、甘露醇作为辅助底物，在30℃下转化24h，转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析各株菌种的羰基还原酶活性，分析不同辅助底物对催化过程酶活力的影响。
    结果显示，20g/L葡糖酸钠酶活最高，比酶活达到1.62U/g，催化24h生成11.85g/L产物，得率84.6%，d.e.值96.0%；其它辅助底物存在对(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯不对称还原效率的影响如下：无辅助底物时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.91U/g，d.e.值97.6%；20g/L葡萄糖时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.71U/g，d.e.值96.4%；20g/L甲酸时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.29U/g，d.e.值90.6%；20g/L乙醇时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.53U/g，d.e.值87.5%；20g/L甲醇时，ZJB‑09225羰基还原酶体积酶活0.65U/g，d.e.值88.9%；20g/L甘油时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.42U/g，d.e.值67.8%；20g/L异丙醇时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.68U/g，d.e.值87.4%；20g/L果糖时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.70U/g，td.e.值95.8%；20g/L正丁醇时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.30U/g，d.e.值84.9%；20g/L甘露糖时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.54U/g，d.e.值96.8%；20g/L甘露醇时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.35U/g，d.e.值87.8%；20g/L山梨醇时，ZJB‑09225羰基还原酶比酶活0.98U/g，d.e.值77.2%.
    实施例8：(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯不对称还原工艺
    6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯合成选用本发明制备的生物催化剂P.caribbic ZJB‑09225菌体细胞。转化体系选择100.0mL、pH7.0磷酸缓冲液（50.0mM），P.caribbic ZJB‑09225细胞终浓度为20.0g DCW/L，50.0g/L(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯，50.0g/L葡萄糖酸钠，35℃下300rpm磁力搅拌转化1小时。经HPLC检测，底物得率1.47%，6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯d.e.值>99.9％，P.caribbic ZJB‑09225的比酶活为2.84U/g；35℃下300rpm磁力搅拌转化12小时后，经HPLC检测，产物得率19.4%，6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯d.e.值93.8%（结果见图6）。

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    生物 催化 制备 氰基 羟基 己酸 叔丁酯 菌株
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