一种石灰岩高效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌NL7及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103087953 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103087953 A *CN103087953A* (21)申请号 201310018569.6 (22)申请日 2013.01.18 CCTCC NO ： M 2012452 2012.11.09 C12N 1/20(2006.01) C09K 17/14(2006.01) C12R 1/11(2006.01) C09K 101/00(2006.01) (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市龙蟠路 159 号 申请人 广州中茂园林建设工程有限公司 (72)发明人 张金池。

2、 王广林 庄家尧 王群 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 (54) 发明名称 一种石灰岩高效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌NL-7 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种石灰岩高效侵蚀细菌巨大 芽孢杆菌 NL-7 及其应用， 所述高效侵蚀细菌的分 类命名为巨大芽孢杆菌 （Bacillusmegaterium） NL-7， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编 号 CCTCCNO ： M2012452， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 9 日 ； 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学。该高效侵蚀岩 石菌巨大芽孢杆菌 NL-7， 对石灰岩有很。

3、强的侵蚀 能力， 能促进岩石中 Ca、 Mg 等主要离子的释放， 加 速石灰岩侵蚀成土 ； 同时兼有很强的解 K、 P 的潜 能 ； 能降低喷播基质容重， 增强喷播基质的抗冲 性和抗剪性， 具有很好的应用开发前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103087953 A CN 103087953 A *CN103087953A* 1/1 页 2 1. 一种石灰岩高效侵蚀细菌， 其分。

4、类命名为巨大芽孢杆菌 （Bacillus megaterium） NL-7， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号 CCTCC NO ： M 2012452， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 9 日 ； 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学。 2. 权利要求 1 所述的石灰岩高效侵蚀细菌在侵蚀岩石中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的岩石为石灰岩石。 权 利 要 求 书 CN 103087953 A 2 1/4 页 3 一种石灰岩高效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌 NL-7 及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种石灰岩高效侵蚀细菌巨。

5、大芽孢杆菌 NL-7 及其应用。 背景技术 0002 客土喷播技术是将植物种子和生长基质材料的混合物均匀、 高压喷播在岩土坡面 上的绿化技术。该技术主要是针对岩石等硬质边坡研发的一种绿化技术。目前已广泛应用 于水利、 公路、 铁路等工程的坡面绿化中。但是， 该技术针对于岩坡实现绿化必须具备两个 条件 ： 一是岩面上有植物赖以持续生长的种植基质 ； 二是种植基质能长久固定在岩面上， 抗风吹、 暴雨和流水的冲蚀。然而在实际工程中， 目前的客土喷播技术， 难以解决上述两个 技术难题， 喷播基质难以长久的维持在岩石坡面上， 使得这一技术的利用受到很多的限制。 显然喷播基质已经成为岩石边坡客土喷播技术的。

6、核心内容， 这种基质不仅要求提供适宜护 坡植被生长的土壤性质， 还要求具有粘着在岩石坡面上的粘结功能， 与坡面实现完全长久 的融合。 0003 岩石侵蚀微生物菌群能加速岩石的土壤化进程， 快速形成适应植物生存所需的土 壤， 模拟自然生态环境， 促进岩石侵蚀成土的演替， 为植物生长源源不断地提供营养成分。 在岩石侵蚀微生物菌群的作用下， 在岩体和喷播基质间形成了一个界面生育基盘。这 种生育基盘， 既解决了岩面上植物赖以持续生长的种植基质问题 （包括提供营养元素） ， 也 解决了种植基质能永久固定在岩面， 实现岩面和种植基质的融合， 促进了种植基质和岩石 的物质循环。显然， 筛选高效岩石侵蚀微生物。

7、菌株是客土喷播覆绿技术长期维持和广泛应 用的关键。目前， 国内针对不同岩石， 筛选适宜的高效岩石侵蚀微生物菌株还未见报道。 发明内容 0004 发明目的 ： 针对上述现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种石灰岩高 效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌 NL-7， 为岩石高效侵蚀微生物菌库的建立提供菌种支持。本发明 的另一目的是提供上述石灰岩高效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌 NL-7 的应用。 0005 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 一种石灰岩高效侵蚀细菌， 其分类命名为巨大芽孢杆菌 （Bacillus megaterium） NL-7， 已保藏于中国典型培养物保藏中心，。

8、 保藏编号 CCTCC NO ： M 2012452， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 9 日 ； 保藏地址 ： 中国武汉武汉大学。 0006 所述的石灰岩高效侵蚀细菌在侵蚀岩石中的应用。 0007 所述的岩石为石灰岩石。 0008 巨大芽孢杆菌NL-7， 是从南京市幕府山裸露岩壁 （其为石灰岩， 主要由CaCO3组成， 富含 Ca） 表面筛选获得的， 能加速石灰岩石中 Ca、 Mg、 K、 P 等元素释放。 0009 巨大芽孢杆菌 NL-7 菌株主要生物学特征 ： 在牛肉膏蛋白胨固体培养基上 28条 件下培养， 菌体杆状， 末端圆， 革兰氏染色阳性， 有芽孢， 好氧菌。 说 明 书 C。

9、N 103087953 A 3 2/4 页 4 0010 巨大芽孢杆菌 NL-7 菌株 16S rDNA 基因序列， 见 SEQ ID No 1 所示。将所测 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的序列进行 BLAST 比对。结果表明， 巨大芽孢杆菌 NL-7 菌 株与Bacillus megaterium的相似度为 99%。结合形态、 生理生化特征及 16S rDNA 序列分 析， 鉴定为巨大芽孢杆菌 （Bacillus megaterium） 。 0011 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明筛选出的高效侵蚀岩石菌巨大芽孢杆菌 NL-7， 对石灰岩有很强的侵蚀能力， 能促进。

10、岩石中 Ca、 Mg 等主要离子的释放， 加速石灰岩侵 蚀成土 ； 同时兼有很强的解 K、 P 的潜能 ； 能降低喷播基质容重， 增强喷播基质的抗冲性和抗 剪性， 具有很好的应用开发前景。 附图说明 0012 图 1 是幕府山裸露岩壁上的采样菌落图 ； 图 2 是牛肉膏蛋白胨固体培养基上的巨大芽孢杆菌 NL-7 菌落图 ； 图 3 是巨大芽孢杆菌 NL-7 发酵培养 15d， 加菌发酵液与不加菌对照的可溶性 Ca、 Mg 的 比较结果图 ； 图 4 是巨大芽孢杆菌 NL-7 发酵培养 15d， 加菌发酵液与不加菌对照的可溶性 K、 P 的比 较结果图。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施。

11、例对本发明做进一步的说明。 0014 实施例 1 菌株的获得和鉴定 ： 采集石灰岩 （江苏省南京市幕府山）裸岩表面的菌落 （见图 1） ， 采用稀释平板法， 在 28培养箱中， 以筛选培养基 （5g 蔗糖， 2g Na2HPO4， 0.5g MgSO47H2O， 0.005g FeCl3， 0.1g CaCO3， 1g 石灰岩石粉 （清洗过的幕府山岩石， 过 200 目筛， 主要相关化学见表 1） ， 18g 琼脂 粉， 1000mL 蒸馏水） 培养 48h 左右， 挑取单菌落， 反复划线纯化， 并将所得菌株分别接种于牛 肉膏蛋白胨固体培养基斜面上， 4冰箱保存， 获得纯菌株。 该菌株主要生物。

12、学特征 ： 在牛肉 膏蛋白胨固体培养基上 28条件下培养， 菌体杆状， 末端圆， 革兰氏染色阳性， 有芽孢， 好氧 菌 （见图 2） 。 0015 表 1 幕府山石灰岩的主要相关化学成分 成分CaOMgOP2O5K2O 含量 （%）50.02 4.17 0.68 0.31 用接种环取少量纯菌株接种于装有 50mL 筛选培养基 （培养基同上， 不加琼脂粉）的 250mL 三角瓶中， 28， 180r/min 震荡培养 72h。按照常规方法， 提取菌株 DNA 测序。得 16S rDNA 基因序列， 见 SEQ ID No.1 所示。将所测 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的序列。

13、进 行 BLAST 比对。结果表明， 该菌株与Bacillus megaterium的相似度为 99。结合形态、 生 理生化特征及 16S rDNA 序列分析， 鉴定为巨大芽孢杆菌 （Bacillus megaterium） NL-7。 0016 实施例 2 菌株的石灰岩侵蚀能力 ： 用接种环取少量纯菌株接种于装有 50mL 筛选培养基 （培养基同上， 不加琼脂粉）的 250mL 三角瓶中， 28， 180r/min 震荡培养 72h， 得到活化菌种。 0017 取上述菌液 2mL， 接种于装有 50mL 发酵培养基 （15g 蔗糖， 0.2g MgSO47H2O， 0.1g CaSO42H2。

14、O， 0.2g NaCl， 0.2g 酵母膏， 0.5g (NH4)2SO4， 10g 石灰岩石粉， 1000mL 蒸馏水， pH 说 明 书 CN 103087953 A 4 3/4 页 5 7.07.5） 的 250mL 三角瓶中， 25， 180r/min 震荡培养。 0018 发酵培养第 15d， 将菌悬液倒入灭菌的离心管中， 4， 5000r/min 离心 10min， 用无 菌注射器吸取上清液， 经细菌过滤器 （滤膜孔径为 0.22um） 过滤后得到无菌滤液。 0019 取上述无菌滤液 20mL 加 3 滴浓硝酸酸化后， 利用 ICP Optima 4300DV （美国） 测试 溶。

15、液中可溶性 Ca、 Mg、 K、 P 浓度。巨大芽孢杆菌 NL-7 对岩石的侵蚀结果如图 3、 图 4 和表 2 所示， 与不加菌的对照相比， 加菌后发酵液中可溶性 Ca、 Mg、 K、 P 浓度分别是不加菌对照的 2.8、 3.3、 2.7、 10.9 倍。 0020 按照解钾率 (%)=( 菌液中钾含量对照液中钾含量 ) 菌液体积 ( 岩石粉 量 岩石粉钾含量 )100% 计算其解钾率为 25.07%。 0021 由于目前国内尚无细菌对岩石侵蚀能力的评价标准， 一方面本发明参照丁丽君等 （2009 年） 关于岩石微生物对碳酸盐岩石的风化作用研究等有关文献及其我们的实验数据， 确定细菌对于石。

16、灰岩的主要元素Ca等释放到培养液中的浓度是不加菌对照的2倍以上， 即 确定为石灰岩的高效侵蚀细菌菌株 ； 另一方面， 依据农业部关于硅酸盐细菌生产菌种标准 的要求， 解钾能力 20% 的菌株为高效解钾菌株 ； 同时依据郝晶等 （2006 年） 关于高效解磷 细菌菌株的分离、 筛选等资料， 确定培养液中 P 的浓度是不加菌对照的 8 倍以上， 即为高效 解磷菌株。可见， 该菌对石灰岩有很强的侵蚀能力， 能促进岩石中 Ca 等主要离子的释放， 加 速石灰岩侵蚀成土 ； 同时兼有很强的释放岩石粉中 K、 P 的能力， 是很有应用前景的高效石 灰岩侵蚀、 高效解钾和高效解磷细菌菌株。 0022 表 2。

17、 巨大芽孢杆菌 NL-7 对石灰岩的元素释放 处理 钙 （mg/L）镁 （mg/L）钾 （mg/L）磷 （mg/L） 加菌 452.28106.9210.3113.39 对照 160.4232.253.861.23 注 ： P 0.05。 0023 实施例 3 菌株对喷播基质的影响 ： 将菌株活化后 （方法同实施例 2） ， 按照 100mL/kg 拌入喷播基质 （林地土壤， 添加腐植酸 有机肥 25%、 石灰岩石粉 （过100目筛） 4%、 喷播木纤维 0.3 %、 保水剂 0.3 %、 绿化喷播粘合 剂 0.03%） ， 对照则在喷播基质中拌入相同体积的培养基， 进行上盆试验 （盆钵直径 。

18、17cm， 深 15cm） ， 置于 25温室中， 保持喷播基质湿润。4 个月后， 采用环刀法测试喷播基质容重 ； 采 用 CC 索波夫斯基抗冲仪测定喷播基质抗冲性 ； 采用土壤剪力测定仪测定喷播基质抗剪性。 0024 土壤容重反映土壤的质地、 结构及肥力等综合物理状况， 直接影响土壤的蓄水透 水性能和通气性能。由表 3 可知， 加菌基质的容重为对照的 84.69%。加菌降低了喷播基质 容重， 有利于提高其透水通气性能。 0025 土壤抗冲性是指土壤抵抗径流的机械破坏和推动下移的能力， 表征土壤抗侵蚀能 力的强弱。由表 3 可知， 加菌喷播基质的抗冲指数较对照提高了 11.63%。 0026 。

19、土壤的抗剪强度反映了土体的稳定性。 抗剪能力强， 说明土壤稳固性好， 能提高坡 体的稳定性 ； 反之， 土壤稳固性差， 边坡容易失稳。 由表3可知， 加菌喷播基质的抗剪强度较 对照提高了 20.44%。 0027 表 3 巨大芽孢杆菌 NL-7 对喷播基质的影响 处理 容重 （g/cm3）抗冲指数抗剪强度 （kPa） 加菌 0.831.9287.8 说 明 书 CN 103087953 A 5 4/4 页 6 对照 0.981.7272.9 注 ： P 0.05。 说 明 书 CN 103087953 A 6 1/2 页 7 SEQUENCE LISTING 南京林业大学 广州中茂园林建设工程。

20、有限公司 一种石灰岩高效侵蚀细菌巨大芽孢杆菌 NL-7 及其应用 100 1 PatentIn version 3.3 1 1424 DNA Bacillus megaterium misc_feature (334)(334) n is a, c, g, or t 1 cttaggcggc tagctcctta cggttactcc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60 tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120 ttactagcga ttccagcttc atg。

21、taggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg 180 ttttatggga ttggcttgac ctcgcggtct tgcagccctt tgtaccatcc attgtagcac 240 gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300 ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actnaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360 gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga g。

22、ctgacgaca accatgcacc 420 序 列 表 CN 103087953 A 7 2/2 页 8 acctgtcact ctgtcccccg aaggggaacg ctctatctct agagttgtca gaggatgtca 480 agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540 ggcccccgtc aattcctttg agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt 600 aatgcgttag ctgcagcact aaagggcgga a。

23、accctctaa cacttagcac tcatcgttta 660 cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagcgt 720 cagttacaga ccaaaaagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc 780 accgctacac gtggaattcc gcttttctct tctgcactca agttccccag tttccaatga 840 ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct。

24、 gcgcgcgctt 900 tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960 agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtacg agcagttact ctcgtacttg 1020 ttcttcccta acaacagagt tttacgaccc gaaagccttc atcactcacg cggcgttgct 1080 ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140 c。

25、cgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctatgca tcgttgcctt 1200 ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcaccgcggg cccatctgta agtgatagcc 1260 gaaaccatct ttcaatcatc tcccatgaag gagaagatcc tatccggtat tagcttcggt 1320 ttcccgaagt tatcccagtc ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380 ctaacgtcat agaagcaagc ttctaatcag ttcgctcgac tgca 1424 序 列 表 CN 103087953 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103087953 A 9 2/2 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 103087953 A 10 。