一种维甲酸诱导蛋白16N端多肽及其抗体的制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103102392 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103102392 A *CN103102392A* (21)申请号 201310030642.1 (22)申请日 2013.01.28 C07K 7/08(2006.01) C07K 16/18(2006.01) C07K 16/06(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (。

2、71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 王文 任浩 许刚 戚中田 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 赵青 (54) 发明名称 一种维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽及其抗体的 制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及生物医学技术领域， 本发明提供 了一种维甲酸诱导蛋白 16（RAI16） N 端多肽， 其 氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示， 该多肽具有优 异的亲水性结构、 柔性区、 抗原指数及表面概率结 构。本发明还提供了 RAI16N 端多肽的抗体， 及抗 。

3、体的制备方法， 本发明制备的抗 RAI16N 端多肽抗 体效价高， 特异性好， 可与天然人 RAI16 分子发生 特异结合反应。进一步地， 本发明提供了 RAI16N 端多肽及其抗体在制备预防和治疗性急性淋巴细 胞白血病、 肺癌、 肝癌等疫苗或诊断试剂盒中的应 用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103102392 A CN 103102392 A *CN103102392A* 1/1 页 2 1. 。

4、一种维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 2.一种维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体， 其特征在于， 是将如SEQ ID NO:1所示的氨 基酸序列免疫新西兰大白兔， 获得抗维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽的抗体。 3. 一种如权利要求 2 所述的维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽的抗体的制备方法， 其特征在 于， 该方法包括以下步骤 ： (A)RAI16 多肽的合成 ： 多肽自动合成仪合成并纯化如 SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序 列 ； (B)RAI16 多肽与载体蛋白交联 ： RAI16 多肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白采用戊二醛连 接法， 然后用 p。

5、H 值为 8.5 的硼酸缓冲液透析 8-12 小时， 交联形成 RAI16-KLH ； (C) 制备兔抗 RAI16N 端多肽抗体 ： 将乳化后的 RAI16-KLH 在兔背部皮下注射， 并反复 加强免疫， 直至抗体效价等于或高于 1 ： 64000 ； (D) 收集、 分离得到含有兔抗 RAI16 多肽抗体的血清， 采用辛酸 - 硫酸铵法纯化 RAI16 多肽抗体， 即得到抗 RAI16N 端多肽抗体。 4.根据权利要求3所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体的制备方法， 其特征在于， 所述的步骤 (B) 中， RAI16 多肽与钥孔血蓝蛋白采用戊二醛连接法具体为 ： 按重量份数比将 4-6。

6、份经过纯化的RAI16多肽加入到6-8份载体蛋白KLH中， 然后均匀、 缓慢地加入0.5-1.5 份浓度为 3g/L 的戊二醛溶液， 室温环境下作用 2 小时。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽的抗体的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤(C)中， 取RAI16-KLH与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下 注射， 首次免疫注射后第 2 周进行第一次加强免疫注射， 以后每隔两周加强免疫注射一次， 首次免疫注射剂量为 1.2mg， 每次加强免疫注射剂量为 0.6mg ； 加强免疫注射 RAI16-KLH 用 不完全福氏佐剂乳化。 6. 根据权利要求 3。

7、 或 4 所述的维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽的抗体的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤 (D) 中， 采用辛酸 - 硫酸铵法纯化 RAI16 多肽抗体具体为 ： (a) 将含有兔 抗 RAI16 多肽抗体的血清用浓度为 60mmol/L、 pH 值为 4.0 的醋酸钠缓冲液稀释 3-4 倍， 再 用浓度为 0.1mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 4.5 ； (b) 向步骤 (a) 的混合液中缓慢加入含量为 98.5的辛酸至混合液中辛酸浓度为 25mol/L ； (c) 室温条件下搅拌混合液 30min， 在 4、 10000g 的条件下离心 30min， 再用滤孔直径为 0.2。

8、2um 的滤膜过滤上清液 ； (d) 向滤液中加 入滤液 l/10 体积的 10PBS， 并用浓度为 0.1mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 7.4， 然后缓慢加 入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为 45% ； (e) 加入硫酸铵的滤液在 4环境下静 置 8-12h， 然后在 4、 3000g 的条件下离心 30min， 弃去上清夜 ； 沉淀用浓度 0.01mol/L、 pH 值为 7.4 的 PBS 缓冲液重悬， 透析 8-12h。 7. 一种如权利要求 1 所述的维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽在制备免疫原中的应用。 8.一种如权利要求1所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽在制备。

9、预防和治疗性急性淋巴 细胞白血病、 肺癌、 肝癌的疫苗或诊断试剂盒中的应用。 9.一种如权利要求2所述的维甲酸诱导蛋白16N端多肽的抗体在制备预防和治疗性急 性淋巴细胞白血病、 肺癌、 肝癌的疫苗或诊断试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103102392 A 2 1/5 页 3 一种维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽及其抗体的制备方法和应 用 技术领域 0001 本发明涉及生物医学技术领域， 具体涉及一种一种维甲酸诱导蛋白 16N 端多肽及 其抗体的制备方法和应用。 背景技术 0002 维甲酸诱导蛋白 16（Retinoic acid induced protein16,RAI16）的 。

10、NCBI 登 录号为 NP_073586.5， Swissprot 登录号为 Q86V87， IPI 号为 IPI00654780.2。RAI16 是 维甲酸诱导产生的蛋白分子， 其结构与功能目前尚未清楚。RAI16 最初是在维甲酸诱导 细胞分化时分离出来的， 而维甲酸具有抑制细胞增殖、 促进细胞调亡和促进细胞分化的 作用， 已被应用于急性淋巴细胞白血病、 肺癌及肝癌等多种癌症的治疗 （Okuno M,Kojima S,Matsushima-Nishiwaki R,Tsurumi H,MutoY,Friedman SL,Moriwaki H.Retinoids in cancer chemop。

11、revention.Curr Cancer Drug Targets.2004;4:285-98） 。因此， 维甲酸诱 导蛋白 RAI16 很可能也参与一系列生理过程， 在细胞增殖、 分化、 以及细胞凋亡等方面发挥 重要作用。 0003 现有研究表明 RAI16 在肝细胞再生 （Wang G， Deng J,Yang J,Zheng JJ,Wang HZ,Hu Q,Zhang ZM,Chen C,Wang D,Li ZP.Analysis on the protein structure and function of retinoic acid induced16.World J Gastr。

12、oenterol.2007;15:1342-1346） 和 促 进 肝 细 胞 癌 发 生 发 展 （Wen Wang,Lan-Juan Zhao,Yuan Yang,Ruo-Yu Wang,Hao Ren,Ping Zhao,Wei-Ping Zhou,Zhong-Tian Qi.Retinoic acid induced16enhances tumorigenesis and serves as novel tumor marker in hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis.2012Oct7.Epub ahead of print） 中发挥重要。

13、作用。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种维甲酸诱导蛋白 16（RAI16） N 端多肽、 相应抗体及其 制备方法和应用。 0005 本发明的主要技术方案是， 通过免疫实验特异性检测 RAI16 的表达和天然存在， 并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题， 继而提供的一种特异性针对 RAI16N 端的合成多肽、 相应抗体及其制备方法和应用。 0006 本发明还解决了目前使用的 RAI16 价格昂贵， 制备的抗体成本过高， 而且抗体不 能同时满足用于免疫印迹、 免疫组织化学实验和免疫荧光实验的问题。 0007 本发明的第一方面， 是提供一种维甲酸诱导蛋白 16 （RAI16） N。

14、 端多肽， 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO:1 所示 ： 0008 Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-Ile-Pro-Trp-Arg 0009 本发明利用 DNAStar 软件分析 RAI16N 端抗原表位 ： 确定 RAI16 蛋白 N 端的 40-55 位 16 个氨基酸抗原活性较好。 说 明 书 CN 103102392 A 3 2/5 页 4 0010 本发明的第二方面， 是提供一种维甲酸诱导蛋白 16 （RAI16） N 端多肽的抗体， 是将 如 SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列免疫新西兰大白兔， 获得抗维甲。

15、酸诱导蛋白 16N 端多肽 的抗体。 0011 本发明的第三方面， 是提供一种维甲酸诱导蛋白 16（RAI16） N 端多肽的抗体的制 备方法， 包括以下步骤 ： 0012 (A)RAI16 多肽的合成 ： 多肽自动合成仪合成并纯化如 SEQ ID NO:1 所示的氨基酸 序列 ； 0013 (B)RAI16 多肽与载体蛋白交联 ： RAI16 多肽与载体蛋白钥孔血蓝蛋白 （keyhole limpet hemocyanin， KLH） 采用戊二醛连接法， 然后用 pH 值为 8.5 的硼酸缓冲液透析 8-12 小时， 交联形成 RAI16-KLH ； 0014 (C) 制备兔抗 RAI16N。

16、 端多肽抗体 ： 将乳化后的 RAI16-KLH 在兔背部皮下注射， 并 反复加强免疫， 直至抗体效价等于或高于 1 ： 64000 ； 0015 (D) 收集、 分离得到含有兔抗 RAI16 多肽抗体的血清， 采用辛酸 - 硫酸铵法纯化 RAI16 多肽抗体， 即得到抗 RAI16N 端多肽抗体。 0016 所述的步骤 (B) 中， RAI16 多肽与钥孔血蓝蛋白 （KLH） 采用戊二醛连接法具体为 ： 按重量份数比将 4-6 份经过纯化的 RAI16 多肽加入到 6-8 份载体蛋白 KLH 中， 然后均匀、 缓 慢地加入 0.5-1.5 份浓度为 3g/L 的戊二醛溶液， 室温环境下作用 。

17、2 小时。 0017 所述的步骤 (C) 中， 取 RAI16-KLH 与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背 部皮下注射， 首次免疫注射后第 2 周进行第一次加强免疫注射， 以后每隔两周加强免疫 注射一次， 首次免疫注射剂量为 1.2mg， 每次加强免疫注射剂量为 0.6mg ； 加强免疫注射 RAI16-KLH 用不完全福氏佐剂乳化。 0018 所述的步骤 (D) 中， 采用辛酸 - 硫酸铵法纯化 RAI16 多肽抗体具体为 ： (a) 将含有 兔抗RAI16多肽抗体的血清用浓度为60mmol/L、 pH值为4.0的醋酸钠缓冲液稀释3-4倍， 再 用浓度为 0.1mol/L 的 NaOH 。

18、调节 pH 值至 4.5 ； (b) 向步骤 (a) 的混合液中缓慢加入含量为 98.5的辛酸至混合液中辛酸浓度为 25mol/L ； (c) 室温条件下搅拌混合液 30min， 在 4、 10000g 的条件下离心 30min， 再用滤孔直径为 0.22um 的滤膜过滤上清液 ； (d) 向滤液中加 入滤液 l/10 体积的 10PBS， 并用浓度为 0.1mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 7.4， 然后缓慢加 入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为 45% ； (e) 加入硫酸铵的滤液在 4环境下静 置 8-12h， 然后在 4、 3000g 的条件下离心 30min， 弃去上。

19、清夜 ； 沉淀用浓度 0.01mol/L、 pH 值为 7.4 的 PBS 缓冲液重悬， 透析 8-12h。 0019 本发明的第四方面， 是提供一种维甲酸诱导蛋白 16（RAI16） N 端多肽在制备免疫 原中的应用。 0020 进一步地， 提供一种维甲酸诱导蛋白 16（RAI16） N 端多肽及其抗体在制备预防和 治疗性急性淋巴细胞白血病、 肺癌、 肝癌等疫苗或诊断试剂盒中的应用。 0021 本发明中的 RAI16N 端多肽具有优异的亲水性结构、 柔性区、 抗原指数及表面概率 结构。 0022 本发明制备的抗 RAI16N 端多肽抗体效价高， 特异性好， 可与天然人 RAI16 分子发 生。

20、特异结合反应 ； 本发明抗体制备成本低， 而且能够满足免疫印迹、 免疫组织化学实验和 免疫荧光实验的要求， 可用于建立体外免疫分析。本发明制备的抗 RAI16N 端多肽抗体， 为 说 明 书 CN 103102392 A 4 3/5 页 5 RAI16 分子的研究及相关疾病的研究 （如诊断策略的制定、 与疾病相关性分析、 流行病学调 查、 预防和控制） 提供一个有力工具， 以及在生物医学研究中对靶蛋白的特性、 含量的测定、 分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要意义和价值。 附图说明 0023 图 1 是 RAI16 蛋白 N 端氨基酸序列采用 DNAstar 软件分析的结果。 0024 。

21、图 2 是合成的 RAI16 多肽通过 HPLC 纯化的结果。 0025 图 3 是抗 RAI16 抗体效价测定结果。 0026 图4是抗RAI16抗体与人肝癌细胞系HepG2、 肝细胞肝癌组织中RAI16表达的免疫 印记结果。 0027 图 5 是抗 RAI16 抗体用于检测人肝癌细胞系 HepG2 细胞中 RAI16 表达的免疫荧光 结果。 0028 图 6 是抗 RAI16 抗体用于检测正常人多器官组织中 RAI16 表达和分布情况的免疫 组织化学结果 0029 其中 A 为睾丸 ； B 为肺 ； C 为前列腺 ； D 为肾。 具体实施方式 0030 现结合实施例， 对本发明作进一步描述。

22、， 但本发明的实施并不仅限于此。 实施例1 ： 抗 RAI16N 端多肽抗体的制备 0031 抗 RAI16N 端多肽抗体按以下步骤制备 ： 0032 RAI16N端抗原表位的分析 ： 利用DNAStar软件分析RAI16蛋白N端的氨基酸序列， 分析结果如图 1 所示， RAI16 蛋白 N 端的 40-55 位氨基酸 ( 多肽 ) 具有优异的亲水性结构、 柔性区、 抗原指数及表面概率结构。确定 RAI16 蛋白 40-55 位 16 个氨基酸作为合成多肽氮 基酸序列 ： 0033 Cys-Thr-Asp-Glu-Ser-Thr-Pro-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-Ile-Pro-。

23、Trp-Arg 0034 RAI16 多肽的合成 ： 多肽自动合成仪合成， 采用常规 C18 的 RP-HPLC 柱进行纯化， 纯化后纯度为 95%， 可作为抗原免疫动物， 多肽合成及纯化质谱结果如图 2 所示。 0035 RAI16 多肽与载体蛋白交联 ： RAI16 多肽与载体蛋白 KLH 采用戊二醛连接法， 按重 量份数比将 4-6 份经过纯化的 CWlA2 多肽加入到 6-8 份载体蛋白 KLH 中， 然后均匀、 缓慢地 加入0.5-1.5份浓度为3g/L的戊二醛溶液， 室温环境下作用2h， 然后用pH值为8.5的硼酸 缓冲液透析 8-12h， 交联形成 RAI16-KLH ； 003。

24、6 免疫动物 ： 取 RAI16-KLH 与等体积的完全福氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注 射， 注射点为 5 点， 每点注射 100pg， 首次免疫注射后第 2 周进行第一次加强免疫注射， 以 后每隔两周加强免疫注射一次， 每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同 ： 加强免 疫注射 RAI16-KLH 用不完全福氏佐剂乳化。反复加强免疫， 直至抗体效价等于、 高于 1 ： 64000 ； 0037 抗体纯化 ： 采用颈动脉取血收集含有兔抗 RAI16 多肽抗体的兔血， 得到含有兔抗 RAI16 多肽抗体的血清， 采用辛酸 - 硫酸铵法纯化 RAI16 多肽抗体 ： 0038 (1) 将含有。

25、兔抗 RAI16 多肽抗体的血清用浓度为 60mmol/L、 pH 值为 4.0 的醋酸钠 说 明 书 CN 103102392 A 5 4/5 页 6 缓冲液稀释 3-4 倍， 再用浓度为 0.1mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 4.5 ； 0039 (2)向步骤(1)的混合液中缓慢加入含量为98.5的辛酸至混合液中辛酸浓度为 25mol/L ； 0040 (3) 室温条件下搅拌混合液 30min， 在 4、 10000g 的条件下离心 30min， 再用滤孔 直径为 0.22um 的滤膜过滤上清液 ； 0041 (4) 向滤液中加入滤液 1/10 体积的 10PBS， 并用浓度为。

26、 0.1mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 7.4， 然后缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至滤液中硫酸铵饱和度为 45 ； 0042 (5) 加入硫酸铵的滤液在 4静置 8-12h， 然后在 4、 3000g 条件了离心 30min， 弃去上清液， 沉淀用浓度 0.01mol/L、 pH 值为 7.4 的 PBS 缓冲浓重悬， 透析 8-12h， 即得到抗 RAI16 多肽抗体。 0043 实施例 2 ： 抗 RAI16N 端多肽抗体效价的确定 0044 本实施方式采用 ELISA 检测抗 RAI16N 端多肽抗体的效价 ： ELISA 检测板用浓度为 1mg/L 的 RAI16-BSA 包被。

27、， 每孔 100ul， 在 4条件下孵育 8-12h， 然后每孔加入 200ul 浓度 为100ul的牛血清， 在37的条件下封闭2h， 洗涤后加入倍比稀释的抗RAI16多肽抗体(对 照组加入正常兔血清 )， 37条件下孵育 60min， 3 次洗涤后每孔加入 1 ： 5000 稀释的 HRP 标 记的羊抗兔 IgG100ul， 37条件下孵育 30min， 洗涤 3 次后进行 TMB 显色， 用酶标仪测定样 品在 A450 的吸光值， 计算抗体效价， 本实施方式抗体效价为 1 ： 64000（如图 3 所示） 。 0045 实施例 3 ： 抗 RAI16N 端多肽抗体用于 RAI16 蛋白表。

28、达的检测 0046 1、 免疫印记法 （Western blotting） 检测人肝癌细胞系 HepG2 细胞和肝细胞癌组 织样本中 RAI16 的表达 0047 HepG2 细胞和肝细胞癌组织蛋白样本制备 ： 1107HepG2 细胞或 100mg 肝细胞癌 组织 （HCC， 匀浆后 )， 加入裂解液 （50mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.5mM EDTA， 蛋白酶抑制剂 cocktail） 在 4裂解 30min， 4、 10000g 的条件下离心 20min， 取上清液蛋白定量、 分装后 置于 -80保存。本实施方式进行抗体的免疫印迹分析， 采用合成多肽竞争法鉴定抗体的。

29、 特异性。用 5xSDS 上样缓冲液悬浮制备的人 HepG2 细胞或肝细胞癌组织， 95加热 10min， 置于冰上冷却 10min 后上样 ； 经 SDS-PAGE 胶分离后， 以湿转法电转至 PVDF 膜上 ； 经脱脂奶 粉封闭 ( 室温 2h) 后加入 1:1000 稀释的纯化后 RAI16 抗体和 1:1000 稀释纯化后抗体加等 量合成多肽 4过夜 ； PBST 洗膜 3 次， 然后加入 1:2000HRP 标记山羊抗兔 IgG 室温孵育 1h， PBST洗膜3次， 之后用化学发光剂试剂盒(ECL Plus)处理5min后， 于暗室曝光到X光胶片 上， 显影、 定影。本实施方式抗体免。

30、疫印迹结果如图 4 所示， HepG2 细胞和 HCC 样本都检测 到明显条带， 而加入了RAI16合成多肽的HepG2细胞样本未检测到任何条带， 说明所制备的 抗体可特异性的识别人 HepG2 细胞以及 HCC 样本中的 RAI16 蛋白。 0048 2、 免疫荧光法 （Immunostaining） 检测人肝癌细胞系 HepG2 细胞中 RAI16 的表达 0049 本实施方式进行抗体的免疫荧光染色， 1105HepG2 细胞用 20% 甲醇 -20固定 20min， PBS 洗涤 3 次， 用含有 5%BSA 的 PBST 室温封闭 1h, 加入 1:1000 稀释的纯化后 RAI16 。

31、抗体 , 室温孵育 1h， 以含 0.05 Tween-20 的 PBS 洗涤 3 次， 然后加入 1:2000FITC 标记山 羊抗兔 IgG 室温孵育 1h， PBST 洗涤 3 次， 使用细胞核染料 DAPI 染色 10min 后置于荧光显微 镜下观察。本实施方式抗体免疫印迹结果如图 5 所示， HepG2 细胞胞浆中有绿色荧光信号， 说明所制备的抗体可特异性的识别人 HepG2 细胞 RAI16 蛋白， RAI16 蛋白主要存在于细胞 说 明 书 CN 103102392 A 6 5/5 页 7 胞浆中。 0050 3、 免疫组织化学法 （Immunohistochemistry）检测。

32、人正常多器官组织样本中 RAI16 的表达 0051 本实施方式进行抗体的免疫组织化学染色， 取出用丙酮固定的冰冻人正常多器官 组织切片， 滴加 5 BSA， 室温下 5 BSA 封闭 20min， 加入 1 ： 500 稀释兔抗 RAI16 多肽抗体， 4孵育过夜， 再用 PBS 洗片后加入羊抗兔 IgG， 37孵育 20min， PBS 洗片后进行 DAB 显色， 苏木素复染， 返蓝后， 脱水、 透明、 封片， 镜检， 放大 100 倍和 400 倍拍照记录结果。本实施方 式抗体免疫组化染色实验结果如图 6 所示， 免疫组化实验表明， RAI16 多肽抗体可与正常人 多个器官组织细胞胞浆中。

33、的 RAI16 蛋白结合 （棕色染色） 。 0052 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。 说 明 书 CN 103102392 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 103102392 A 8 1/4 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103102392 A 9 2/4 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103102392 A 10 3/4 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103102392 A 11 4/4 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 103102392 A 12 。