一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103012542 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103012542 A *CN103012542A* (21)申请号 201210557534.5 (22)申请日 2012.12.20 C07J 63/00(2006.01) (71)申请人 山东省中医药研究院 地址 250014 山东省济南市历下区燕子山西 路 7 号 申请人 济南亿兆临科技有限公司 (72)发明人 徐新刚 生立嵩 闫雪生 李义召 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 李桂存 (54) 发明名称 一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的方法 (57) 摘要 。

2、本发明公开了一种从泡桐叶中提取高纯度 熊果酸的方法， 包括 ： 将泡桐叶粉碎， 醇提得提取 物 ； 向提取物中加水煮沸， 取下层水沉物 ； 将水沉 物用乙醇溶解， 在 40-70下用氢氧化钠水溶液 调节 pH 至 9.0-11.0， 过滤除去沉淀， 然后用盐酸 调节pH至1.0-3.0， 过滤取沉淀物， 重复一次取沉 淀物质 ； 将沉淀物质用乙醇溶解， 活性炭脱色， 析 晶， 得熊果酸。本发明提取方法简便快捷， 所使用 的试剂仅限于乙醇、 氢氧化钠、 盐酸、 活性炭等药 典收载批准使用的辅料， 不使用有机溶剂和大孔 树脂， 无外源性杂质引入， 所得熊果酸晶型稳定， 杂质少， 纯度在98%以上，。

3、 最高可达99.5%以上， 符 合新药申报要求， 可用做注射制剂的原料药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的方法， 其特征是包括以下步骤 ： （1） 将泡桐叶粉碎， 用乙醇回流提取两次， 合并提取液回收至无醇味， 得提取物 ； （2） 向提取物中加入水， 加热至沸腾， 使提取物形成混悬液， 然后在室温下静置， 倒出上 清液， 留下层水沉物待用 ； （3） 向水沉物中加入乙醇， 加热至溶， 保持溶液温度为 40-70，。

4、 用氢氧化钠水溶液调节 pH 至 9.0-11.0， 过滤除去沉淀， 然后用盐酸调节 pH 至 1.0-3.0， 过滤取沉淀物 ； 将沉淀物再 按照上述乙醇溶解、 氢氧化钠调 pH、 盐酸调 pH 步骤处理一遍， 得沉淀物质 ； （4） 将沉淀物质用乙醇溶解， 加入活性炭脱色， 脱色后将溶液在 15-30下析晶， 过滤， 收集晶体， 即为熊果酸。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 所述泡桐叶为兰考泡桐、 毛泡桐、 白花泡桐 或川泡桐的叶。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 粉碎的泡桐叶中， 大于 10mm10mm 的碎片 含量低于 5%。 4. 根据权利要求。

5、 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （1） 中， 乙醇体积浓度为 8595%， 乙醇 与泡桐叶的重量比为 6:112:1 ； 每次提取 2h。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （2） 中， 水的加入量为提取物质量的 20-25 倍。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （3）中， 氢氧化钠水溶液浓度为 0.12mol/L， 盐酸浓度为 0.12mol/L， 乙醇体积浓度为 80-85%， 乙醇的用量为水沉物质量 的 20-25 倍。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （4） 中， 沉淀物质用体积浓度 90% 以上 的乙。

6、醇溶解， 乙醇的温度为 50-80。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （4） 中， 活性炭用量为沉淀物质质量的 1%-5%， 活性炭脱色次数为 2-5 次。 9. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 步骤 （4） 中， 结晶时间为 48-240h。 10. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是 ： 所用乙醇、 盐酸、 氢氧化钠、 活性炭均为药 用级别， 所用水为蒸馏水。 权 利 要 求 书 CN 103012542 A 2 1/4 页 3 一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从植物中提取药用活性单一化合物的方法， 具体。

7、涉及一种从泡桐 叶中提取高纯度的可供注射用的熊果酸晶体的方法。 背景技术 0002 熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物， 具有镇静、 抗炎、 抗菌、 抗糖尿 病、 抗溃疡、 降低血糖等多种生物学效应， 熊果酸还具有明显的抗氧化功能， 因而被广泛地 用作医药和化妆品原料。 熊果酸在自然界中分布广泛， 存在多种植物中， 例如女贞、 枇杷、 山 楂、 泡桐等。与其他植物 （如女贞， 枇杷等） 相比， 熊果酸在泡桐叶中含量虽然适中， 但泡桐分 布广泛， 且泡桐主要作为木材用树， 其叶成本低廉、 收集方便， 适于大规模生产， 所以在成本 上比其他植物要低一些。从植物中提取熊果酸的方法较多， 有回。

8、流提取法、 酶解法、 超声提 取法、 常温超高压提取法、 湿法超微粉碎法， 渗漉法等， 在诸多方法中， 采用溶剂回流提取方 法简便， 且工艺稳定， 适于连续生产， 但在使用有机溶剂回流提取时， 常引入石油醚、 乙酸乙 酯、 氯仿、 甲醇等成分， 这些物质有一定的毒性， 熊果酸中一旦有这些有机溶剂的残留， 在作 为药物尤其是注射用药物应用于人体及动物体内时， 则将引起不可预测的生理反应， 另外， 有报道使用大孔树脂分离提纯熊果酸， 因大孔树脂作为高分子材料， 其中引入的不可知杂 质更多， 所生产得到的熊果酸也不适用于医药产品。 0003 对于熊果酸的提取， 有相关专利报道， 例如， 专利 CN1。

9、453289 公开了一种从植物 中提取分离熊果酸的方法， 该方法以泡桐叶为原料。所用的提取溶剂为甲醇， 提取物用丙 酮洗涤， 所得熊果酸中有甲醇、 丙酮残余， 对熊果酸造成污染， 不适合用于医药产品。专利 CN101205248 公开了以泡桐叶为原料制备熊果酸的方法， 该方法用大孔树脂提取熊果酸， 引 入未知杂质， 也不适合用于医药产品。专利 CN1629180A 公开了一种酸碱法制备熊果酸的方 法， 该方法的原料没有涉及分布广泛、 价廉易得的泡桐叶， 且所得的熊果酸的纯度不能满足 药用的要求。 发明内容 0004 本发明针对现有技术中存在的不足， 提供了一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的 方法。

10、， 该方法所得熊果酸纯度高、 晶型稳定， 不引入外源性杂质， 安全性高， 可以直接用于医 药产品。 0005 本发明技术方案如下 ： 一种从泡桐叶中提取高纯度熊果酸的方法， 其特征是包括以下步骤 ： （1） 将泡桐叶粉碎， 用乙醇回流提取两次， 合并提取液回收至无醇味， 得提取物 ； （2） 向提取物中加入水， 加热至沸腾， 使提取物形成混悬液， 然后在室温下静置， 倒 出上清液， 留下层水沉物待用 ； （3） 向水沉物中加入乙醇， 加热至溶， 保持溶液温度为 40-70， 用氢氧化钠水溶液 调节pH至9.0-11.0， 过滤除去沉淀， 然后用盐酸调节pH至1.0-3.0， 过滤取沉淀物 ； 。

11、将沉淀 说 明 书 CN 103012542 A 3 2/4 页 4 物再按照上述乙醇溶解、 氢氧化钠调 pH、 盐酸调 pH 步骤处理一遍， 得沉淀物质 ； （4） 将沉淀物质用乙醇溶解， 加入活性炭脱色， 脱色后将溶液在 15-30下析晶， 过 滤， 收集晶体， 即为熊果酸。 0006 本 发 明 方 法 所 用 的 泡 桐 叶 可 以 是 兰 考 泡 桐 (P. elongata)、毛 泡 桐 (P.tomentosa)、 白花泡桐 (P.fortunei) 或川泡桐 (P.fargesii) 的叶。 0007 本发明泡桐叶在提取时要进行粉碎， 粉碎的泡桐叶中， 大于 10mm10mm 。

12、的碎片含 量应低于 5%。 0008 上述步骤 （1） 中， 乙醇体积浓度为 8595%， 乙醇与泡桐叶的重量比为 6:112:1， 优 选的， 乙醇体积浓度为 95%， 乙醇与泡桐叶的重量比为 10:1。 0009 上述步骤 （1） 中， 每次提取 2h。 0010 上述步骤 （2） 中， 加入水将提取物中的可溶性杂质除去， 水的加入量为提取物质量 的 20-25 倍， 优选为 20 倍。 0011 上述步骤 （3） 中， 氢氧化钠水溶液浓度为 0.12mol/L， 盐酸浓度为 0.12mol/L， 在 调节溶液碱性时， 应该保持温度在 40-70之间， 从而提高熊果酸得率， 优选的， 保持。

13、溶液温 度为 60。 0012 上述步骤 （3） 中， 水沉物用体积浓度 80-85% 的乙醇溶解， 乙醇的用量为水沉物质 量的 20-25 倍， 优选 20 倍。 0013 上述步骤 （3） 中， 优选用氢氧化钠调节溶液 pH 为 11.0， 用盐酸调节 pH 为 2.0。 0014 上述步骤 （4）中， 沉淀物质用体积浓度 90% 以上的乙醇溶解， 乙醇的温度为 50-80。 0015 上述步骤 （4） 中， 活性炭用量为沉淀物质质量的 1%-5%， 活性炭脱色次数为 2-5 次。 活性炭脱色可以提高熊果酸的质量， 使熊果酸更易于析晶， 提高熊果酸的得率， 如果不进行 脱色产品很难析晶， 。

14、其中活性炭用量 2%， 脱色 3 次的效果最好， 产品得率高。 0016 上述步骤 （4） 中， 结晶时间为 48-240h。 0017 本发明方法中， 所用乙醇、 盐酸、 氢氧化钠、 活性炭均为药用级别， 所用水均为蒸馏 水。 0018 本发明提取方法简便快捷， 所使用的试剂仅限于乙醇、 氢氧化钠、 盐酸、 活性炭等 药典收载批准使用的辅料， 不使用有机溶剂和大孔树脂， 无外源性杂质引入， 所得熊果酸晶 型稳定， 杂质少， 纯度在 98% 以上， 最高可达 99.5% 以上， 符合新药申报要求， 可用做注射制 剂的原料药物。 将采用本发明提取所得的熊果酸配制的乳剂注射液在动物体内注射后安全 。

15、性良好， 不会引起毒性反应。 具体实施方式 0019 下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述， 应该明白的是， 下述说明仅是 为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。如无特殊说明， 下述所用乙醇均为体积浓度。 0020 下述实施例中用到的盐酸、 氢氧化钠及活性炭、 乙醇均应符合药典规定， 可在市场 上买到。 0021 本发明方法所用泡桐叶可以是兰考泡桐、 毛泡桐、 白花泡桐或川泡桐中的任意一 种， 下述实施例中所用的泡桐叶为白花泡桐。 说 明 书 CN 103012542 A 4 3/4 页 5 0022 实施例 1 1. 取晾干的泡桐叶， 粉碎， 所得碎片大于 10mm10mm 的碎片含。

16、量低于 5%， 取粉碎的泡 桐叶， 加入 10 倍量的 95% 乙醇回流提取， 提取两次， 每次两小时， 将提取液合并， 回收乙醇 至溶液无醇味， 称量所得提取物重量， 加入 20 倍量蒸馏水， 加热至沸腾， 使提取物形成混悬 液， 室温下静置 12 个小时。 0023 2. 取已分层的熊果酸水沉液， 慢慢倾出上层水液弃去， 将下层沉淀以 15 倍量乙醇 加热溶解， 保持溶液温度为60， 用1mol/L氢氧化钠调至PH11.0， 离心或过滤除去沉淀， 将 上清液用 1mol/L 盐酸调至 PH2.0， 离心或过滤， 弃去上清液， 将下层沉淀按照乙醇溶解、 氢 氧化钠调 pH、 盐酸调 pH 步。

17、骤再处理一遍， 收集沉淀物 ； 3. 将沉淀物用 50-80的 95% 乙醇溶解， 加入相当于沉淀物重量 2% 的活性炭脱色， 反 复脱色 3 次， 此时溶液为淡黄色。 0024 4. 将溶液置室温下析晶， 约 4 天后， 将溶液过滤， 收集结晶， 即为熊果酸， 所得熊果 酸晶体为白色针状结晶， 晶型稳定， 按照上述方法进行三批实验， 所得结果如下表所示 ： 其中， 纯度测量方法采用药典常用的 HPLC 检测方法 ： 固定相为 kromasil C18 色谱柱 （4.6*250mm,5m） ,流动相为乙腈-水 （90:10） ， 流速1mL/min， 柱温25， 检测波长210nm。 分别检测。

18、对照品与本发明产品， 通过本发明产品与对照品的比较得纯度值。 0025 熊果酸得率计算方法为 ： 熊果酸结晶重量 / 泡桐叶重量 1000。 0026 从上表数据可以看出， 处理泡桐越多熊果酸得率越多， 这可能是泡桐叶多时在提 取过程中的损失相对较小的原因， 总之大批量生产时熊果酸得率比实验室小试时得率大。 0027 溶液析晶后所得的母液中仍含有一定的熊果酸， 进一步浓缩母液还可以析晶得到 熊果酸， 但是经检测所得熊果酸纯度低于 98%， 不能直接作为药用， 但可以用于其他纯度要 求低的领域。 实施例 2 1. 取晾干后简单粉碎的泡桐叶 10kg， 加入 12 倍量的 85% 乙醇回流提取， 。

19、提取两次， 每 次两小时， 将提取液合并， 回收乙醇至溶液无醇味， 称量所得提取物重量， 加入 25 倍量蒸馏 水， 加热至沸腾， 使提取物形成混悬液， 室温下静置 12 个小时。 0028 2. 取已分层的熊果酸水沉液， 慢慢倾出上层水液弃去， 将下层沉淀以 12 倍量乙醇 加热溶解， 保持溶液温度为 40， 用 0.1mol/L 氢氧化钠调至 pH9.0， 离心或过滤除去沉淀， 将上清液用 0.1mol/L 盐酸调至 pH3.0， 离心或过滤， 弃去上清液， 将下层沉淀按照乙醇溶 解、 氢氧化钠调 pH、 盐酸调 pH 步骤再处理一遍， 收集沉淀物。 说 明 书 CN 103012542 。

20、A 5 4/4 页 6 0029 3. 将沉淀物用 50-80的 90% 乙醇溶解， 加入相当于沉淀物重量 1% 的活性炭脱 色， 反复脱色 5 次， 此时溶液为淡黄色。 0030 4.将溶液置15-20下析晶， 约180h后， 将溶液过滤， 收集结晶， 得白色针状结晶， 所得到的熊果酸晶体纯度高， 经 HPLC 检测纯度为 99.04%， 得率为 4.87。 0031 对比例 1 采用专利 CN1629180A 的方法提取熊果酸， 方法为 ： 取市售泡桐叶 10kg ， 粉碎后， 加水 100kg ， 浸润 30 分钟后煮沸 1 小时， 过滤， 弃 煮水液， 滤渣再加 60kg 水， 煮沸 。

21、1 小时， 取滤渣、 烘干、 粉碎 ； 取水煮后泡桐叶渣 （干） 1 份， 加 85- 95乙醇 10 份 （g/v) ， 于中药提取器中回流浸取 2 小时， 过滤后收集醇提液 （1） ， 残渣再用 90-95% 乙醇 （1:8， g/v） 回流提取 2 小时， 得醇提液 （2) ； 合并 （1)、 (2) 醇 提液 ； 在醇提液中加入 0.3活性炭 （g/v） ， 搅拌吸附 60 分钟， 过滤、 除残渣， 得泡桐叶脱色 醇提液 ； 将上述脱色醇提液用 lmol/LNaOH 调 pH 至 11 ， 静置过夜， 离心或抽滤， 除沉淀杂质， 得碱性醇提物 ； 将碱性醇提物用 6mol/LHCl 调。

22、 pH 至 3 ， 经减压浓缩， 抽滤得泡桐叶酸醇析出物。 0032 在泡桐叶酸醇析出物中， 加 100 倍 （v/v) pH3酸性蒸馏水， 搅拌溶洗 15 分钟， 倾 去水层后继用 100 倍 （v/v) pH12 碱性水溶洗 15 分钟， 再用中性蒸馏水洗涤 2 次， 得水不 溶物 ； 测定水不溶物中的熊果酸含量， 按熊果酸含量计， 以 6-8mg/ml 浓度溶于 95 -100 乙醇中， 加热溶解后， 置 10-20 下自然析晶， 此时无晶体析出。由此可以看出， 专利 CN1629180A 的方法不适合从泡桐叶中提取熊果酸。 0033 熊果酸安全性实验 使用本专利方法提取的熊果酸， 加以注射用卵磷脂， 大豆油， 油酸等制成注射乳剂， 按 50mg/kg 体重给予 SD 大鼠尾静脉注射， 一天一次， 连续注射十五天， 大鼠行为正常， 经解剖 检查各组织器官与对照大鼠无明显变化， 证明使用本方法提取的熊果酸及其制剂安全性良 好， 可以直接作为原料药物。 说 明 书 CN 103012542 A 6 。