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1、10申请公布号CN102327615A43申请公布日20120125CN102327615ACN102327615A21申请号201110229725422申请日20110811A61K47/36200601A61K47/48200601A61K31/5383200601A61K31/704200601A61P19/08200601A61P31/04200601A61P35/0020060171申请人蔡林地址430071湖北省武汉市武昌水果湖169号武汉大学中南医院骨科申请人余黎72发明人蔡林余黎74专利代理机构武汉凌达知识产权事务所特殊普通合伙42221代理人宋国荣54发明名称一种骨靶向载体。
2、和药物57摘要本发明公开了一种骨靶向药物载体和药物，由下法制得先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，由所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到骨靶向药物。以含多醛基的氧化葡聚糖为中间体，连接具有骨导向作用的双膦酸和含氨基的其他类药物（双膦酸除外），得到具有骨靶向性的药物。双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0406）1时所制备的骨靶向药物既具备良好的亲骨性，又有较高的载药量。本发明的骨靶向药物通过双膦酸的导向作用定向作用于骨组织，搭载的药物不同，发挥不同的治疗作用。本发明载药量大，亲骨性佳，合成步骤简单，条件易于控。
3、制。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图6页CN102327620A1/1页21一种骨靶向药物载体，由下法制得先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0406）1。2根据权利要求1所述的骨靶向药物载体，其特征在于，含多醛基的氧化葡聚糖由下法制得称取葡聚糖100G，高碘酸钠135G，分别溶于200ML和150MLPH44磷酸盐缓冲液中得到葡聚糖溶液和高碘酸钠溶液，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液，室温下1500R/MIN避光搅拌45H，。
4、加入丙三醇45ML，室温1500R/MIN继续搅拌15MIN，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4透析48H，透析液冷冻干燥，得醛基含量为102402MMOLG的氧化葡聚糖；骨靶向药物载体的制备将0406MMOL含氨基的双膦酸溶于10ML蒸馏水中与5ML浓度为20MG/ML的氧化葡聚糖水溶液4反应24H得反应混合液，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4避光透析48H，除去未结合的含氨基的双膦酸，透析液冷冻干燥，得到骨靶向药物载体。3根据权利要求1或2所述的骨靶向药物载体，其特征在于含氨基的双膦酸的结构式如下R为CH3或OH；R为氢、一价金属盐。
5、或含有14个碳的烷基；N为010的整数。4根据权利要求3所述的骨靶向药物载体，其特征在于含氨基的双膦酸为1氨基1甲基1,1二膦酸。5一种骨靶向药物，由权利要求1或2或3所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到。6根据权利要求5所述的骨靶向药物，其特征在于所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应步骤如下称取葡聚糖100G，高碘酸钠135G，分别溶于200ML和150MLPH44磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液，室温下1500R/MIN避光搅拌45H，加入丙三醇45ML，室温1500R/MIN继续搅拌15MIN，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4透析48H，。
6、透析液冷冻干燥，得醛基含量为102402MMOLG的氧化葡聚糖；再将0406MMOL含氨基的双膦酸溶于10ML蒸馏水中与5ML浓度为20MG/ML的氧化葡聚糖水溶液4反应24H得反应混合液，在反应混合液中加入含氨基的药物，4孵育24H，将反应液过SEPHADEXG50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到骨靶向性药物。7据权利要求6所述的骨靶向药物，其特征在于含氨基的药物的加入量不低于氧化葡聚糖醛基摩尔量的1。8根据权利要求5或6或7所述的骨靶向药物，其特征在于含氨基的药物为帕珠沙星或表阿霉素。权利要求书CN102327615ACN102327620A1/6页3一种骨靶向载体和药物技术领域000。
7、1本发明涉及药物的靶向药物技术领域，具体涉及骨组织的靶向载体和骨靶向药物。背景技术0002骨是一种特殊的结缔组织，由大量钙化的细胞间质和细胞组成，钙化的细胞间质为骨基质，其中无机盐的含量占干重的6570，其主要成分是羟基磷灰石HYDROXYAPATIVE，HA。因此骨组织硬度大，渗透性差，生理生化过程特殊，对于一般的药物治疗，药物难以有效地到达病变部位，致使局部药物浓度偏低，效果不明显。而提高给药浓度又会增加对其它组织和器官的毒副作用。骨组织相关性疾病，如骨质疏松、骨髓炎、原发性和继发性骨肿瘤等的药物治疗较为棘手。00031986年PIERCE等首先明确提出了“骨靶向”的概念，即将药物与一定的。
8、骨靶向载体偶联，使该化合物分子具有沉积于骨并掺和到羟基磷灰石晶体中的趋势，同骨钙具有结合能力，使药物选择性地导向病变部位，提高局部骨组织的药物浓度，以达到增强药效，减少对其它组织的毒副作用。近二十多年来，许多学者致力于这方面的研究，发现、合成了多种亲骨性物质，并在此基础上开发出多种骨靶向药物。作者将这些骨靶向药物的载药模式分为三类偶联载药模式，即亲骨性物质和药物通过化学结合的方法直接合成，或通过小分子中间物质桥接，合成骨靶向药物，是目前研究最多的一种合成方式，但其合成反应复杂、步骤多、产率低。纳米药物载体，即将亲骨性物质修饰于包封药物的纳米粒表面，合成骨靶向药物。该方法合成步骤较简单；产物易于。
9、分离纯化；对所载药物有广泛的适应性，可实现对多种不同药物进行载药；对所载药物无化学结构上的改变，药效不变；但合成费用十分昂贵。枝接载药模式，即亲骨性物质和药物按照一定的物质量比例通过化学结合的方法枝接于聚合物上，合成骨靶向药物，其合成方法简单、步骤少、有一定通用性。合成技术的关键点在于控制两种物质的比例，以期达到最佳的骨靶向性和最大的载药率。该设想由陈方舟等提出，其将亲骨性药物四环素（TETRACYLINE，TC）作为靶向物质，以氧化葡聚糖DEXTRAN作为中间体，连接四环素与阿霉素ADR1AMYCIN，ADM枝接于聚合物上，制备复合物ADMDEXTC，但其未对合成的复合物进行表征，且载药量低。
10、，对肿瘤的杀伤作用弱于原料药ADM。发明内容0004本发明的目的是提供一种双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体及其骨靶向药物，该药物载药量高，骨靶向性好。0005本发明采用枝接载药模式，同样以氧化葡聚糖作为中间体，连接含氨基的双膦酸骨靶向物质，合成一种双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体。最佳骨靶向药物载体的合成条件为氧化葡聚糖的醛基与双膦酸物质量之比为10406。然后将帕珠沙星和表阿霉说明书CN102327615ACN102327620A2/6页4素分别连接于该药物载体，得到一种骨靶向抗生素和一种骨靶向抗肿瘤药物。0006本发明以含有氨基的双膦酸作为导向物质，氧化葡聚糖为中间体连接双膦酸和含氨基的药物，。
11、其结构可用以下简式表示BDMB为含有氨基的双膦酸类化合物。0007D为由葡聚糖氧化而来的含多个醛基的氧化葡聚糖。0008M为含氨基的任何药物。0009实现上述发明的技术方案为一种骨靶向药物载体，由下法制得先用高碘酸钠将葡聚糖氧化为含多醛基的氧化葡聚糖；再将含氨基的双膦酸与含多醛基的氧化葡聚糖反应得到骨靶向药物载体，双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0406）1。0010含多醛基的氧化葡聚糖可由下法制得称取葡聚糖优选T40100G，高碘酸钠135G，分别溶于200ML和150MLPH44磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500R/MIN避光搅拌45H，立即加入丙三醇4。
12、5ML，室温1500R/MIN继续搅拌15MIN，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4透析48H，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖。盐酸羟胺法测定5批100MG样品，醛基含量为102402MMOLGN5；骨靶向药物载体的制备将含氨基的双膦酸0406MMOL溶于10ML蒸馏水中与5ML（醛基含量约为1MMOL）氧化葡聚糖水溶液（20MG/ML）反应，4孵育24H，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4避光透析48H，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得到骨靶向药物载体。双膦酸与氧化葡聚糖醛基反应的物质量比为（0406）1。0011含氨基的双膦酸的。
13、结构式如下R为CH3或OH；R为氢、一价金属盐或含有14个碳的烷基；N为010的整数。0012本发明含氨基的双膦酸可以为1氨基1甲基1,1二膦酸。0013一种骨靶向药物，由上述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应得到。0014所述的骨靶向药物载体与含氨基的药物反应步骤如下称取葡聚糖100G，高碘酸钠135G，分别溶于200ML和150MLPH44磷酸盐缓冲液中，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500R/MIN避光搅拌45H，加入丙三醇45ML，室温1500R/MIN继续搅拌15MIN，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4透析48H，透析液冷冻干燥，得醛基含量为1。
14、02402MMOLG的氧化葡聚糖；再将0406MMOL含氨基的双膦酸溶于10ML蒸馏水中与5ML浓度为20MG/ML的氧化葡聚糖水溶液4反应24H得反应混合液，在反应混合液中加入含氨基的药物，4孵育24H，将反应液过SEPHADEXG50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到骨靶向性药物。0015含氨基的药物的加入量不低于氧化葡聚糖醛基摩尔量的1。说明书CN102327615ACN102327620A3/6页50016含氨基的药物为帕珠沙星或表阿霉素。0017本发明以1氨基1甲基1,1二膦酸1AMINOETHYLENE1,1DEPHOSPHATEACID,AEDP作为含氨基的双膦酸代表，将41M。
15、G、82MG、123MG、164MG、205MG的AEDP（分别相当于02MMOL、04MMOL、06MMOL、08MMOL、10MMOL）溶于10ML蒸馏水中分别与100MG的氧化葡聚糖（20MG/ML）反应，4孵育24H，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4避光透析48H，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得到不同AEDP底物含量的骨靶向药物载体，以AEDP0210DEX表示。取浓度为1MG/ML的OXDEX，AEDP0210DEX溶液各1ML，加入装有15MG羟基磷灰石的EP管中，每种合成产物做3个平行管，对双膦酸骨靶向药物载体的体外亲骨性作了探讨，其结果见。
16、表1。本发明以帕珠沙星（PAZUFLOXACIN，PFX）作为含氨基的药物代表，探讨了AEDP0210DEX对药物的结合能力，即载药量，合成的化合物以AEDP0210DEXPFX表示，其结果见表1。0018表1AEDP0210DEX的体外亲骨性及载药量合成物质吸附百分率合成物质载药量OXDEX381207AEDP02DEX5118579AEDP02DEXPFX513AEDP04DEX6987336AEDP04DEXPFX465AEDP06DEX7718321AEDP06DEXPFX338AEDP08DEX8323176AEDP08DEXPFX197AEDP10DEX8542344AEDP10D。
17、EXPFX145从表1的结果中可以看出，当AEDP的底物浓度大于04MMOL时，AEDPDEX骨靶向药物载体的体外亲骨性可达70以上；而当AEDP的底物浓度大于08MMOL时，其载药量不足2，因此AEDP与氧化葡聚糖上醛基反应的最佳物质量比为（0406）1。0019本发明具有下列优点1）本发明以氧化葡聚糖作为中间体连接含氨基的双膦酸和含氨基的药物，合成步骤简单，反应速度快，条件易于控制；且较多药物均含有氨基基团，因此该方法具有一定的通用性。00202）本发明以氧化葡聚糖作为中间体，其基本单位为葡萄糖，安全无毒，生物相容性好，葡聚糖药物结合物在体内释放出药物后，非药物部分逐渐分解为无毒副作用的小。
18、分子物质。00213）本发明以含氨基的双膦酸作物骨导向物质，除利用双膦酸的亲骨性能外，其自身也有一定的药理作用，如抗骨质疏松和抑制肿瘤和肿瘤骨转移等，因此将双膦酸用于作为骨靶向药物的导向物质，可谓一举数得。附图说明0022图1为本发明氧化葡聚糖OXDEX的1HNMR波谱图。0023图2为本发明AEDP氧化葡聚糖骨靶向药物载体AEDPDEX的1HNMR波谱图。0024图3为本发明骨靶向帕珠沙星AEDPDEXPFX的1HNMR波谱图。0025图4为本发明骨靶向表阿霉素AEDPDEXEPI的1HNMR波谱图。0026图5为本发明以表阿霉素（EPIRUBICIN，EPI）作为模型药物合成的化合物AED。
19、PDEXEPI的体内亲骨性的骨组织荧光切片（其中图5A、图5B为空白对照组和AEDPDEX组；图5C、图5D为EPI组和AEDPDEXEPI组）。说明书CN102327615ACN102327620A4/6页6具体实施方式0027实施例1氧化葡聚糖的合成称取葡聚糖T40100G，高碘酸钠135G，分别溶于200ML和150MLPH44磷酸盐缓冲液中分别得到葡聚糖溶液和高碘酸钠溶液，将高碘酸钠溶液加入葡聚糖溶液中，室温下1500R/MIN避光搅拌45H，立即加入丙三醇45ML，室温1500R/MIN继续搅拌15MIN，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4透析48H，透析。
20、液冷冻干燥，得氧化葡聚糖51G。氧化葡聚糖的1HNMR波谱图见图1，1HNMR（600MHZ，DMSO）H961PPM为醛基质子产生的峰。0028实施例2双膦酸氧化葡聚糖骨靶向药物载体的合成取06MMOLAEDP，溶于10ML蒸馏水中。称取100MG氧化葡聚糖（醛基含量约10MMOL），溶于5ML蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4孵育24H后，将反应混合液置于截流分子量3500的透析袋中，以蒸馏水为介质4避光透析48H，除去未结合的AEDP，透析液冷冻干燥，得白色粉末状骨靶向药物载体。00291HNMR（600MHZ，DMSO）H147PPM出现多重峰，应为AEDP上的CH3引入。H772P。
21、PM处的一峰为希弗碱结构HCN质子产生的峰。（见附图2）实施例3骨靶向帕珠沙星AEDPDEXPFX的合成步骤1同实施例1。0030步骤2取06MMOLAEDP，溶于10ML蒸馏水中。称取100MG氧化葡聚糖（醛基含量约10MMOL），溶于5ML蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4孵育24H。0031步骤3称取PFX20MG用等摩尔盐酸助溶于10ML蒸馏水中，将其加入上述反应液中，并用磁力搅拌，4避光孵育24H。最后将反应液过SEPHADEXG50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到淡黄色粉末状产物骨靶向帕珠沙星，其载药量为338，体外HA吸附率为8912。00321HNMR（600MHZ，DM。
22、SO）H130为PFX上环丙烷的亚甲基质子峰；H153、156、159、166PPM处的多重峰则为AEDP和PFX的甲基质子峰；H786PPM为PFX上苯环氢的双重峰；H8954、8962PPM为PFX吡啶环上的质子峰；H767PPM为醛基与氨基结合成HCN希弗碱结构产生的质子峰；H962PPM处的小峰则为氧化葡聚糖上尚未完全反应的醛基的质子峰。（见附图3）实施例4骨靶向表阿霉素AEDPDEXEPI的合成步骤1同实施例1。0033步骤2取04MMOLAEDP，溶于10ML蒸馏水中。称取100MG氧化葡聚糖（醛基含量约10MMOL），溶于5ML蒸馏水中，将AEDP溶液加入其中，4孵育24H。00。
23、34步骤3称取表阿霉素20MG溶于10ML蒸馏水中，将其加入上述反应液中，并用磁力搅拌，4避光孵育24H。最后将反应液过SEPHADEXG50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到红色粉末状产物，骨靶向表阿霉素。载药量为（531020），HA吸附率分别为8547。00351HNMR（600MHZ，DMSO）H123、152、155、157PPM处的多重峰则为EPI和AEDP的甲基质子峰；H210、212、217为EPI上CH2、CH的质子峰；H780、795PPM为说明书CN102327615ACN102327620A5/6页7EPI上苯环氢的双重峰；H769PPM为醛基与氨基结合成HCN希弗碱。
24、结构产生的质子峰；962处的小峰则为氧化葡聚糖上尚未完全反应的醛基的质子峰。（见附图4）实施例5骨靶向表阿霉素SDAEDPDEXEPI的合成（合成最终加入硼氢化钠还原剂）步骤1为实施例1。0036步骤2同实施例4的步骤2。0037步骤3称取表阿霉素20MG溶于10ML蒸馏水中，将其加于上述反应液中，并用磁力搅拌，4避光孵育24H后，加入50MG硼氢化钠水溶液（10MG/ML），反应3H后，最后将反应液过SEPHADEXG50凝胶柱，收集先段流份，冷冻干燥，得到红色粉末状产物，骨靶向表阿霉素，以SDAEDPDEXEPI表示。0038实施例6AEDPDEXEPI和SDAEDPDEXEPI体外对骨肉。
25、瘤细胞MG63凋亡的影响取生长旺盛的MG63成骨肉瘤细胞，025的胰蛋白酶消化，含10胎牛血清的DMED液漂洗2遍，然后配成5105M11的细胞悬液，将细胞悬液加入6孔板内，每孔3ML，放入37培养箱中培养24H后细胞贴壁，细胞长满后加入药液，分别加入1GML1的EPI，相当1GML1EPI浓度的AEDPDEXEPI，相当1GML1EPI浓度的SDAEDPDEXEPI，100GML1氧化DEX和40GML1AEDP，同时设不加药物的阴性对照，培养24H后取出。用025的胰蛋白酶消化，含10胎牛血清的DMED中止消化，反复吹打后取1ML细胞悬液移入离心管，1000RPM，4离心10分钟，弃上清；。
26、加入1ML冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；1000RPM，4离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次；将细胞重悬于200ULBINDINGBUFFER；加入10LANNEXINVFITC和5LPI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4反应30分钟。加入300ULBINDINGBUFFER，在1小时内上机检测。重复3次。0039表2细胞凋亡测定结果（N3）ANNEXIN/PI双染法测定的凋亡结果表明（表2），AEDPDEXEPI、EPI、SDAEDPDEXEPI在EPI的终浓度为1GML1时，AEDPDEXEPI组的MG63的坏死和凋亡细胞明显高于EPI和SDAEDPDEXEPI（P005）。且AEDP。
27、（40GML1）对骨肉瘤细胞也有一定作用，而氧化葡聚糖的凋亡作用不明显。0040以上结果说明AEDPDEXEPI由于希弗碱结构的不稳定性，可分解为游离的AEDP和EPI，故AEDPDEXEPI在AEDP的自身抗肿瘤和协同抗肿瘤的作用下，对肿瘤的杀伤作用强于EPI。SDAEDPDEXEPI由于加入了还原剂CN双键结构被还原为稳定的CN结构，无法水解得到游离的AEDP和EPI，自身结构的改变可能导致AEDP和EPI药效的降低。因此不加入还原剂，保留希弗碱结构，在AEDPDEXEPI复合物通过双膦酸的导向作用到达骨组织后（实施例7将证明该点），能够水解为AEDP和EPI，充分发挥各自的作用。0041。
28、实施例7骨靶向表阿霉素的体内亲骨性昆明小鼠12只，（18721）G，雌雄不限，分为4组，每组3只。EPI单独用药时，成人剂量为按体表面积一次6090MG/M2，20G小鼠的体表面积为000436M2，故EPI的说明书CN102327615ACN102327620A6/6页8小鼠剂量为026039MG/次，为方便计算取03MG/次，则AEDPDEXEPI的剂量为58MG/次（载药量531）。A组AEDPDEXEPI组，通过鼠尾静脉注射浓度为288MG/ML的AEDPDEXEPI02ML；B组EPI组，注射浓度为15MG/ML的EPI02ML；C组AEDPDEX组，注射浓度为273MG/ML的AE。
29、DPDEX02ML；D组空白对照组，注射09生理盐水02ML。004224H后取小鼠股骨干骺端，丙酮固定24H，制作硬组织切片。在LEICADM4000B荧光显微镜下观察切片中EPI自体荧光，激发光源为波长488NM氩离子激光，拍摄照片（拍摄条件曝光时间1/3秒，感光度400），并用IMAGEPROPLUS60软件分析得到A组和B组的荧光强度的IOD值分别为3795397和1526252，A组荧光强度约为B组25倍（P005）（见附图5）。图5A、图5B为空白对照组和AEDPDEX组，只有极微弱的骨组织自发荧光；图5C、图5D为EPI组和AEDPDEXEPI组中EPI在骨组织中有强烈的激发荧光。
30、，图5D可看出股骨干骺端的皮质骨、松质骨均有EPI的存在，而骨骺因其自身的屏障作用，未结合EPI，无红色激发荧光。说明AEDPDEXEPI复合物通过双膦酸的导向作用再体内能够顺利到达骨组织。说明书CN102327615ACN102327620A1/6页9图1说明书附图CN102327615ACN102327620A2/6页10图2说明书附图CN102327615ACN102327620A3/6页11图3说明书附图CN102327615ACN102327620A4/6页12图4图5A说明书附图CN102327615ACN102327620A5/6页13图5B图5C说明书附图CN102327615ACN102327620A6/6页14图5D说明书附图CN102327615A。