一种活性发酵液及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103013888 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013888 A *CN103013888A* (21)申请号 201210580253.1 (22)申请日 2012.12.28 CGMCC No. 6358 2012.07.12 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/025(2006.01) (71)申请人云南大学地址 650091 云南省昆明市翠湖北路 2 号 (72)发明人李国红卢皓张克勤王芯 (74)专利代理机构昆明今威专利商。

2、标代理有限公司 53115 代理人杨宏珍 (54) 发明名称一种活性发酵液及其应用 (57) 摘要一种发酵液及其应用，属生物农药技术领域。该活性发酵液经如下步骤得到： a. 将保藏号： CGMCC No. 6358 的无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物： 5.0g，胰蛋白胨： 10.0g，氯化钠： 10.0g，水 1000ml， pH ： 7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化 24 小时； b. 将活化后菌种 100l 接种于装有 50ml-250ml 液体 L。

3、B 培养基三角瓶中，在温度为28-37，转速为120-180rpm 的条件下培养 96 小时，得培养液。将培养液 8000rpm离心10分钟后，取上清放入4的冰箱中备用，得到活性发酵液。该活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。本发明的活性物，具有成本低，制备方法简便，高效低毒的优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要。

4、求书 1 页说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种活性发酵液，其特征在于该活性发酵液经如下步骤得到： a. 将保藏号为 CGMCC No. 6358 的无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物： 5.0 g, 胰蛋白胨： 10.0 g, 氯化钠： 10.0 g, 水 1000 ml, pH ： 7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化 24 小时； b. 将活化后菌种 100 l 接种于装有 50 ml-250 ml 液体 LB 培养基三角瓶中，在温度为28-37，转速为120-18。

5、0 rpm的条件下培养96小时，即可得到培养液。将培养液8000 rpm 离心 10 分钟后，取上清放入 4的冰箱中备用，得到活性发酵液。 2. 权利书 1 所述的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。权利要求书 CN 103013888 A 2 1/3 页 3 一种活性发酵液及其应用技术领域： 0001 本发明涉及一种活性发酵液及其应用，属生物农药技术领域。背景技术 : 0002 线虫是农业生产中重要的传染性病原之一，使作物减。

6、产从而给农业生产带来重大损失。目前对线虫的防治有多种方法，但主要以化学杀线剂为主。由于化学杀线剂的高毒、高残留对人类健康及环境造成潜在威胁，因此生物杀线剂成为线虫防治的一个研究方向。微生物由于易培养，生长周期短，因此利用微生物及其代谢产物防治线虫受到人们的关注。 0003 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和全齿复合线虫（Panagrellus redivivus）易培养和观察，体形大，对环境条件敏感，在室内研究中常用其作为指示线虫。南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是危害最为严重的植物病原。

7、线虫之一，所引起的病害是一种极难防治的土传性病害。发明内容 : 0004 本发明的目的在于提供一种活性发酵液及其应用。 0005 本发明是这样实现的： 0006 1、活性发酵液的制备： 0007 本发明使用的细菌菌株为无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253，该菌株已于 2012 年 7 月 12 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所；保藏号： CGMCC No. 6358。 0008 无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 保存。

8、在酵母提取物胰蛋白胨 (LB) 培养基（酵母提取物： 5.0 g, 胰蛋白胨： 10.0 g, 氯化钠： 10.0 g, 水 1000 ml, pH ： 7.0）中，使用时在 LB 液体培养基中活化 24 小时。将活化后菌种 100 l 接种于装有 50 ml-250 ml 液体 LB 培养基三角瓶中，在温度为 28 -37，转速为 120-180 rpm 的条件下培养 96 小时，即可得到培养液。将培养液 8000 rpm 离心 10 分钟后，取上清放入 4的冰箱中备用。这样就得到本发明的活性发酵液。 0009 2、制备试验用的秀丽隐杆线虫（C. elegans。

9、）、全齿复合线虫（P. redivivus）和南方根结线虫（M. incognita）： 0010 燕麦培养基用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）和全齿复合线虫（P. redivivus）培养；燕麦片 10 g，水 10 ml 浸润燕麦片，混匀后加入到 50 ml 三角瓶中， 120高温灭菌 20 min。在超菌工作台中按无菌操作在燕麦片培养基中接入线虫，接种后的三角瓶放置于28 的培养箱中培养 7-10 天后，置于 4冰箱中保存备用。使用时将载有线虫的培养基在无菌条件下，挑取适量已培养好的含线虫的燕麦于擦镜纸上，用简易贝曼漏斗法洗出线虫，用无。

10、菌水制成线虫悬液备用（每毫升 1000 条左右）。 0011 番茄根系用于南方根结线虫（M. incognita）的制备。取发病严重的番茄根系，洗净后统计根结数量，放入水中浸泡过夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，弃去根系。残液和泥说明书 CN 103013888 A 3 2/3 页 4 土经2000 rpm离心2 min，弃去上清液，加入494 g/L蔗糖，混匀后2000 rpm离心2 min，将上清液用 800 目的分离筛清洗，收集分离筛上的幼虫和虫卵。洗液再用 100、 200 和 500 目的分离筛反复漂洗，收集 500 目分离筛上的收集物。

11、- 大部分为虫卵； 500 目分离筛上的滤过液再经 800 目的分离筛清洗，收集分离筛上的虫体 -2 龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于 4 的冰箱中备。 0012 3 实验方法 0013 液体浸泡法：取 5 ml 测试样品溶液、 200 l 约含有 200 条线虫的悬液于直径为 6 cm 的培养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置。在解剖镜下随机选择 10 个视野定时（1 小时、 3 小时、 6 小时、 24 小时）进行观察，计数病虫数（以线虫不动作为标准）和总线虫数。每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株的培养基为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品。

12、对线虫的毒力。 0014 本发明的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。 0015 本发明具有制备方法简单，高效低毒的优点，能够作为制备生物农药杀线剂的应用。具体实施方式： 0016 下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。 0017 实施例一： 0018 将活化后的无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 100 l 接种于液体 LB 培养基中（250 ml 三角瓶装 50 ml 培养基），于。

13、 30， 180 rpm 条件下培养 96 小时。将培养液 8000 rpm 离心 10 分钟后，取上清作为测试样品，稀释十倍后用液体浸泡法测试活性。结果见表 1。 0019 表 1 无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 发酵液对南方根结线虫（M. incognita）液体浸泡法测定的活性 0020 0021 - 没有明显活性 0022 结果表明：本发明的发酵液对南方根结线虫（M. incognita）有强的毒杀作用，其稀释 10 倍后的发酵液 24 小时时对南方根结线虫（M. incognita）的致死率达到 98.。

14、42%。南方根结线虫（M. incognita） 24 小时在培养基对照中的死亡率是 3.37%。 0023 实施例二： 0024 基本同实施例一，不同之处是发酵时为 250 ml 三角瓶装 100ml 培养基， 37、 120 rpm培养96小时。测试活性时不进行稀释，使用发酵原液进行液体浸泡法测试，测试的线虫说明书 CN 103013888 A 4 3/3 页 5 为秀丽隐杆线虫（C. elegans）。活性结果见表 2。 0025 表 2 无色杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 发酵液对秀丽隐杆线虫（C. eleg。

15、ans）液体浸泡法测定的活性 0026 0027 结果表明：本发明的发酵液对秀丽隐杆线虫（C. elegans）有极强的毒杀作用，其发酵原液在 1 小时对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的致死率达到 90以上。秀丽隐杆线虫（C. elegans） 24 小时在培养基对照中的死亡率是 0.82% 0028 实施例三： 0029 基本同实施例二，不同之处是发酵时为500 ml三角瓶装250 ml培养基， 28、 120 rpm 培养 7 天的发酵上清液作为测试样品，测试线虫为全齿复合线虫（P. redivivus）。活性结果见表 3。 0030 表 3 无色。

16、杆菌（Achromobacter sp.） CD-253 发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）液体浸泡法测定的活性（%） 0031 0032 结果表明：本发明的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）有很好的毒杀作用 , 其发酵原液 1 小时对全齿复合线虫（P. redivivus）的致死率达 90% 以上。全齿复合线虫（P. redivivus） 24 小时时在培养基对照中的死亡率是 1.78%。 0033 本例试验与前例采用的菌株和培养基完全相同，仅仅是培养体积、温度和时间以及测试线虫不同。前例是 250 ml 三角瓶装 100 ml 培养基 37培养 96 小时，本例则是 500 ml 三角瓶装 250 ml 培养基 28培养 7 天。本例试验获得的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）活性基本与前例对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的活性一致。说明书 CN 103013888 A 5 。

摘要
申请专利号：	CN201210580253.1	申请日：	2012.12.28
公开号：	CN103013888A	公开日：	2013.04.03
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 1/20申请公布日:20130403\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20121228\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; A01N63/02; A01P5/00; C12R1/025(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	云南大学
发明人：	李国红; 卢皓; 张克勤; 王芯
地址：	650091 云南省昆明市翠湖北路2号
优先权：
专利代理机构：	昆明今威专利商标代理有限公司 53115	代理人：	杨宏珍
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内容摘要

一种发酵液及其应用，属生物农药技术领域。该活性发酵液经如下步骤得到：a. 将保藏号：CGMCC No. 6358的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物：5.0g，胰蛋白胨：10.0g，氯化钠：10.0g，水1000ml，pH：7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化24小时；b.将活化后菌种100μl接种于装有50ml-250ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃-37℃，转速为120-180rpm的条件下培养96小时，得培养液。将培养液8000rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用，得到活性发酵液。该活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。本发明的活性物，具有成本低，制备方法简便，高效低毒的优点。

权利要求书

权利要求书一种活性发酵液，其特征在于该活性发酵液经如下步骤得到：
a. 将保藏号为CGMCC No. 6358的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物：5.0 g, 胰蛋白胨：10.0 g, 氯化钠：10.0 g, 水1000 ml, pH：7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化24小时；
b.将活化后菌种100 μl接种于装有50 ml‑250 ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃‑37℃，转速为120‑180 rpm的条件下培养96小时，即可得到培养液。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用，得到活性发酵液。
权利书1所述的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。

说明书

说明书一种活性发酵液及其应用
技术领域：
本发明涉及一种活性发酵液及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术:
线虫是农业生产中重要的传染性病原之一，使作物减产从而给农业生产带来重大损失。目前对线虫的防治有多种方法，但主要以化学杀线剂为主。由于化学杀线剂的高毒、高残留对人类健康及环境造成潜在威胁，因此生物杀线剂成为线虫防治的一个研究方向。微生物由于易培养，生长周期短，因此利用微生物及其代谢产物防治线虫受到人们的关注。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和全齿复合线虫（Panagrellus redivivus）易培养和观察，体形大，对环境条件敏感，在室内研究中常用其作为指示线虫。南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是危害最为严重的植物病原线虫之一，所引起的病害是一种极难防治的土传性病害。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种活性发酵液及其应用。
本发明是这样实现的：
1、活性发酵液的制备：
本发明使用的细菌菌株为无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253，该菌株已于2012年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No. 6358。
无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培养基（酵母提取物：5.0 g, 胰蛋白胨：10.0 g, 氯化钠：10.0 g, 水1000 ml, pH：7.0）中，使用时在LB液体培养基中活化24小时。将活化后菌种100 μl接种于装有50 ml‑250 ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃‑37℃，转速为120‑180 rpm的条件下培养96小时，即可得到培养液。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用。这样就得到本发明的活性发酵液。
2、制备试验用的秀丽隐杆线虫（C. elegans）、全齿复合线虫（P. redivivus）和南方根结线虫（M. incognita）：
燕麦培养基用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）和全齿复合线虫（P. redivivus）培养；燕麦片10 g，水10 ml 浸润燕麦片，混匀后加入到50 ml 三角瓶中，120℃高温灭菌20 min。在超菌工作台中按无菌操作在燕麦片培养基中接入线虫，接种后的三角瓶放置于28℃的培养箱中培养7‑10天后，置于4℃冰箱中保存备用。使用时将载有线虫的培养基在无菌条件下，挑取适量已培养好的含线虫的燕麦于擦镜纸上，用简易贝曼漏斗法洗出线虫，用无菌水制成线虫悬液备用（每毫升1000条左右）。
番茄根系用于南方根结线虫（M. incognita）的制备。取发病严重的番茄根系，洗净后统计根结数量，放入水中浸泡过夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，弃去根系。残液和泥土经2000 rpm离心2 min，弃去上清液，加入494 g/L蔗糖，混匀后2000 rpm离心2 min，将上清液用800目的分离筛清洗，收集分离筛上的幼虫和虫卵。洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗，收集500目分离筛上的收集物‑大部分为虫卵；500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗，收集分离筛上的虫体‑2龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备。
3 实验方法
液体浸泡法：取5 ml测试样品溶液、200 µl约含有200条线虫的悬液于直径为6 cm的培养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置。在解剖镜下随机选择10个视野定时（1小时、3小时、6小时、24小时）进行观察，计数病虫数（以线虫不动作为标准）和总线虫数。每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株的培养基为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
本发明的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。
本发明具有制备方法简单，高效低毒的优点，能够作为制备生物农药杀线剂的应用。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
将活化后的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253 100 μl接种于液体LB培养基中（250 ml三角瓶装50 ml培养基），于30℃，180 rpm条件下培养96小时。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清作为测试样品，稀释十倍后用液体浸泡法测试活性。结果见表1。
表 1无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253发酵液对南方根结线虫（M. incognita）液体浸泡法测定的活性

‑没有明显活性
结果表明：本发明的发酵液对南方根结线虫（M. incognita）有强的毒杀作用，其稀释10倍后的发酵液24小时时对南方根结线虫（M. incognita）的致死率达到98.42%。南方根结线虫（M. incognita）24小时在培养基对照中的死亡率是3.37%。
实施例二：
基本同实施例一，不同之处是发酵时为250 ml三角瓶装100ml培养基，37℃、120 rpm培养96小时。测试活性时不进行稀释，使用发酵原液进行液体浸泡法测试，测试的线虫为秀丽隐杆线虫（C. elegans）。活性结果见表2。
表 2无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253发酵液对秀丽隐杆线虫（C. elegans）液体浸泡法测定的活性

结果表明：本发明的发酵液对秀丽隐杆线虫（C. elegans）有极强的毒杀作用，其发酵原液在1小时对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的致死率达到90％以上。秀丽隐杆线虫（C. elegans）24小时在培养基对照中的死亡率是0.82%
实施例三：
基本同实施例二，不同之处是发酵时为500 ml三角瓶装250 ml培养基，28℃、120 rpm培养7天的发酵上清液作为测试样品，测试线虫为全齿复合线虫（P. redivivus）。活性结果见表3。
表 3无色杆菌（Achromobacter sp.）CD‑253发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）液体浸泡法测定的活性（%）

结果表明：本发明的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）有很好的毒杀作用, 其发酵原液1小时对全齿复合线虫（P. redivivus）的致死率达90%以上。全齿复合线虫（P. redivivus）24小时时在培养基对照中的死亡率是1.78%。
本例试验与前例采用的菌株和培养基完全相同，仅仅是培养体积、温度和时间以及测试线虫不同。前例是250 ml三角瓶装100 ml培养基37℃培养96小时，本例则是500 ml三角瓶装250 ml培养基28℃培养7天。本例试验获得的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）活性基本与前例对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的活性一致。