一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103013951 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013951 A *CN103013951A* (21)申请号 201210577803.4 (22)申请日 2012.12.27 C12N 9/20(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品学院 (72)发明人 夏小乐 辛瑜 陈金花 张玲 王武 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法 (57) 摘要 一种提取纯化小麦胚。

2、芽脂肪酶的方法， 属于 生物工程技术领域。本发明包括以下步骤 ：（1） 高效提取粗酶 ： 确定从麦胚中提取粗酶的最佳方 法 ；（2） 硫酸铵沉淀和浓缩 ： 将提取的粗酶液通过 硫酸胺沉淀， 并选用超滤膜对酶的盐析液进行浓 缩， 获得超滤液 ；（3） 离子交换层析 ： 采用离子交 换层析纯化超滤液中的脂肪酶， 得到较纯的小麦 胚芽脂肪酶 ；（4） 制备小麦胚芽脂肪酶的亲和介 质 ；（5） 吸附和洗脱 ： 得到纯酶， 纯度达到 95%。本 发明所提供的小麦胚芽脂肪酶高效提取方法， 回 收率高， 纯度高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权。

3、局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 高效提取粗酶 ： 将小麦胚芽机械粉碎至 100 目， 然后用含有表面活性剂、 pH=7.0 的 磷酸钠缓冲液混合， 小麦胚芽缓冲液质量比0.3-11， 混合振荡30min， 控制与混合液质 量比 1 1 加入正己烷溶解除油， 12000rpm 室温离心 10min 后取上清， 得粗酶液 ； （2） 硫酸铵沉淀和浓缩 ： 将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵， 使其中硫酸铵浓度 为 10% 15%， 摇匀后静置， 然后在转速 4000rpm 。

4、下离心 10min， 弃去上清， 将蛋白质沉淀用 蒸馏水溶解得到盐析液， 回收率大于 90% ； 选用过滤分子量为 10000 15000Da 的超滤膜对 脂肪酶盐析液进行浓缩， 获得超滤液 ； （3） 离子交换层析 ： 采用离子交换柱层析纯化步骤 （2） 所得超滤液中的脂肪酶， 装柱 后， 用 pH 8 的 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液平衡 ； 将超滤液上样， 上样量为柱体积的 2 3倍， 以含有 1mol/L 的 NaCl 的 pH 8 的 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱， 流速为 1-5 mL/min， 出现两个洗脱峰， 收集活性峰， 用透析袋浓缩 ； （4） 合。

5、成亲和介质 ： 小麦胚芽脂肪酶亲和配体为脂肪酶抑制剂嘧啶的结构类似物， 层析 介质是 Sepharose、 壳聚糖、 硅胶或陶瓷颗粒中的一种 ； 小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧 氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、 1,3- 丙二胺、 2- 羟基 -1,3 丙二胺、 1,4- 丁二胺、 1,6- 己二胺中的一种作为间隔臂进行连接， 合成亲和介质 ； （5） 吸附和洗脱 ： 将经过离子交换后步骤 （3） 收集的酶液用步骤 （4） 合成的亲和介质进 行亲和吸附， 亲和吸附的条件为 pH 6.58.0， 电导率为 5-10 ms/cm ； 然后采用清洗液冲洗 吸附脂肪酶的亲和介质， 清洗液冲洗条件为。

6、 pH 6.57.5， 电导率 510 ms/cm ； 最后用洗脱 缓冲液洗脱亲和介质上吸附的酶， 洗脱条件为 pH 3.0-4.5， 得到纯酶， 立即用0.1M Tris溶 液中和至中性。 2. 根据权利要求 1 中步骤 （1） 所述的表面活性剂为 Triton X-100， 吐温 -20， 吐温 -80 或 SDS 中的一种。 3. 根据权利要求 1 所述的提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法， 其特征在于， 在步 骤 （3）中，所 述 离 子 交 换 柱 选 用 DEAE-sepharose， DEAE- 纤 维 素， Q-sepharose 或 superQ-sepharose 中的一种。 4。

7、. 根据权利要求 1 所述提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法， 其特征在于， 步骤 （4） 所述的 亲和配体， 嘧啶的结构类似物是苯甲嘧啶、 胞嘧啶或精氨酸中的一种。 权 利 要 求 书 CN 103013951 A 2 1/4 页 3 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提取纯化植物脂肪酶的方法， 特别是指纯化小麦胚芽脂肪酶的方 法， 属生物工程技术领域。 背景技术 0002 脂肪酶 （EC 3.1.1.3） 是一种重要的水解酶类， 在食品、 药品、 化工等行业得到 广泛应用。脂肪酶种类很多， 其中绝大多数来自于微生物， 少数来自于动物， 而极少数来自 于植物。小麦。

8、胚芽脂肪酶是一种存在于小麦中的脂肪酶， 由于其热稳定性以及在小麦发芽 中的重要性， 为大家所关注。一般认为小麦胚芽当中富含多种酶类， 有 - 淀粉酶、 脂肪酶、 酯酶、 脂肪氧化酶和蛋白酶等， 其中主要是脂肪酶以及酯酶 ； 尤其是在发芽后所显示的酶活 主要是脂肪酶酶活。 0003 小麦胚芽脂肪酶的存在对小麦胚芽的保藏是十分不利的， 它能短时间内水解油 脂， 使其脂肪酸值大幅度升高 , 引起麦胚酸败变质 ； 同时， 微生物生长繁殖快， 也会导致麦 胚出现结块、 霉变和发酵等变质现象。 所以， 目前对小麦胚芽脂肪酶的研究大多集中在该酶 在小麦胚芽中稳定性以及如何快速降低其水解活性， 防止麦胚酸化变。

9、质。对小麦胚芽脂肪 酶用于催化生物反应过程研究相对较少， 主要集中在手性拆分和油脂工业方面。 据报道， 小 麦胚芽脂肪酶在立体选择性方面并不符合 Kazlauskas 规则， 呈现为反 K 氏规则， 是现有唯 一天然来源的反 K 氏规则的脂肪酶， 这在手性拆分和脂肪酶催化分子机理解析方面具有重 要的意义。 在油脂催化方面， 目前认为， 小麦胚芽脂肪酶对短链的甘油三酯具有较好的催化 作用。总体而言， 相对于其它脂肪酶， 小麦胚芽脂肪酶具有来源广泛， 可以从小麦加工废弃 物麦胚中提取获得， 如能利用， 将能获得一种质优价廉适合大宗油脂产品加工的脂肪酶。 0004 相较微生物来源脂肪酶， 小麦胚芽脂。

10、肪酶是植物脂肪酶， 植物中含有多种色素、 杂 蛋白和糖类物质等， 因此分离纯化特别困难 ； 而小麦胚芽脂肪酶粗酶具有稳定性差和专一 性差等缺点， 因此如不分离纯化将会限制了小麦胚芽脂肪酶的进一步应用。 0005 长期以来， 硫酸铵沉淀、 透析、 离子交换和凝胶层析等传统方法被用于小麦胚芽脂 肪酶的提取与制备。总体而言， 由于粗酶中杂质较多， 各自的结构和功能性质各不相同， 目 前尚无成熟的分离纯化小麦胚芽脂肪酶的报道。 因此需要提供一种快速分离纯化小麦胚芽 脂肪酶的方法， 以达到高回收率， 收获高纯度的小麦胚芽脂肪酶。 发明内容 0006 本发明的目的是为了克服小麦胚芽脂肪酶粗酶稳定性差和专一。

11、性差的缺点， 提出 一种高效提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法。该方法通过设计合成一种亲和配体， 辅以常见 的分离手段， 经过简单的几步反应就达到了分离纯化的目的。 在分离纯化过程中， 反应条件 温和， 所用试剂毒性均较低， 对人体和环境危害小， 易于放大。 0007 本发明的技术方案 ： 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法， 具体包括如下几个步 骤 ： 说 明 书 CN 103013951 A 3 2/4 页 4 （1）高效提取粗酶 ： 将小麦胚芽机械粉碎至 100 目， 然后用含有 Triton X-100， 吐 温 -20， 吐温 -80 或 SDS 中的一种表面活性剂的磷酸钠缓冲液 ； 以小麦。

12、胚芽缓冲液质量比 0.3-11混合， 其中磷酸钠缓冲液pH=7.0， 混合振荡30min， 控制与混合液质量比11加 入正己烷溶解除油， 12000rpm 室温离心 10min 后取上清， 得粗酶液。 0008 （2） 硫酸铵沉淀和浓缩 ： 将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵， 使其中硫酸 铵浓度为 10%-15%， 摇匀后静置， 然后在转速 4000rpm 下离心 10min， 弃去上清， 将蛋白质沉 淀用蒸馏水溶解得到盐析液， 回收率大于 90%， 纯化倍数 1.40 ； 选用过滤分子量为 10000 15000Da 的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩， 获得超滤液。 0009 （3）离 子。

13、 交 换 层 析 ： 采 用 DEAE-sepharose， DEAE- 纤 维 素， Q-sepharose 或 superQ-sepharose 中的一种离子交换柱层析纯化步骤 （2） 所得超滤液中的脂肪酶， 较佳的 采用 DEAE-sepharose 或 Q-sepharose ； 装柱后并用缓冲液平衡 ； 将超滤液上样， 上样量为柱体积的23倍， 以含有1mol/L的 NaCl 的 pH 8 的 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱， 流速为 1-5 mL/min， 出现两个 洗脱峰 ； 收集活性峰， 用透析袋浓缩。 0010 （4） 合成亲和介质 ： 小麦胚芽脂肪酶亲和配。

14、体是苯甲嘧啶、 胞嘧啶或精氨酸中的一 种 ； 层析介质是 Sepharose、 壳聚糖、 硅胶或陶瓷颗粒中的一种， 较佳的采用 Sepharose 或硅 胶 ； 小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、 1,3- 丙二 胺、 2-羟基-1,3丙二胺、 1,4-丁二胺、 1,6-己二胺中的一种作为间隔臂进行连接， 合成亲和 介质 ； （5） 吸附和洗脱 ： 将经过离子交换后步骤 （3） 收集的酶液用步骤 （4） 合成的亲和介质进 行亲和吸附， 亲和吸附的条件为pH值6.58.0， 电导率为5-10 ms/cm ； 然后采用清洗液冲洗 所述脂肪酶亲和介质， 清洗液冲洗条件。

15、为 pH 6.57.5， 电导率 510 ms/cm ； 最后用洗脱缓 冲液洗脱亲和介质上吸附的酶， 洗脱条件为pH 3.0-4.5， 较佳的在pH 为3.5时收集得到纯 酶。所得纯酶， 立即用 0.1M Tris 溶液中和至中性。 0011 本发明的有益效果 ： 1. 本发明通过采用小麦胚芽脂肪酶抑制剂核心构件嘧啶的结构类似物作为层析用亲 和配体， 与层析介质连接合成亲和介质， 可快速高效纯化， 适于大规模推广应用 ； 2. 本发明通过辅以常规层析手段使得小麦胚芽脂肪酶的纯化效率显著增加， 具有较 大工业应用潜力， 体现出较大的经济效益。 具体实施方式 0012 为了能够更清楚地理解本发明的。

16、技术内容， 特举以下实施例详细说明。 0013 实施例 1 ： 小麦胚芽脂肪酶粗酶的提取 将新鲜小麦胚芽 50g 通过机械粉碎至 100 目， 然后用含有 5%（v/v）吐温 -20 的 pH 7.0 的磷酸钠缓冲液 50mL 混合振荡 30min， 加入 100mL 正己烷溶解， 振荡 10min， 重复一次， 12000rpm 室温离心 10min 后取上清， 得粗酶液。 0014 实施例 2 ： 硫酸铵沉淀和浓缩 将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵， 使其中硫酸铵饱和浓度为 10%-15%， 摇匀后 说 明 书 CN 103013951 A 4 3/4 页 5 静置 5min， 然后在。

17、转速 4000rpm 下离心 10min， 弃去上清， 将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到 盐析液， 回收率大于 90%， 纯化倍数 1.40 ； 选用过滤分子量为 10000 15000Da 的超滤膜对 脂肪酶盐析液进行浓缩脱盐。获得超滤液。 0015 实施例 3 ： 离子交换层析 采用 DEAE-sepharose 离子交换柱层析纯化超滤液中的脂肪酶， 装柱后并用 pH 8 的 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液平衡 ； 将超滤液上样， 上样量为柱体积的 2 倍， 以含有 1mol/L 的 NaCl 的 pH 8 的 0.05 mol/L 磷酸钠缓冲液线性洗脱， 流速为 2mL/min， 出现两。

18、个洗脱峰 ； 根 据洗脱峰的电泳实验， 确定并收集活性峰， 用透析袋浓缩。 0016 实施例 4 ： 层析介质 Sepharose- 精氨酸的合成及应用 Sepharose CL 4 B（50 g） 用 500mL 体积的去离子水洗涤， 抽干成湿饼状 ； 悬浮于 50 mL 活化缓冲液 （0.8 M NaOH， 20% 二甲亚砜， 10% 环氧氯丙烷， 0.5mg/mL 硼氢化钠） 40摇 床震荡 2.5 h， 然后倒入玻璃磨砂漏斗中， 在抽滤下经过每次 500mL 体积的蒸馏水洗涤， 直 到洗涤液pH至中性， 在抽干成湿饼状。 活化的Sepharose CL 4 B介质悬浮于500 mL、 。

19、0.1M NaOH 溶液中， 加入 20 mL 己二胺， 凝胶在搅拌 （200 rpm） 下 30 恒温 12 h， 用去离子水清 洗。 0017 将所得之己二胺 -Sepharose CL 4 B （50 g） 用 500mL 体积的去离子水洗涤， 抽干 成湿饼状 ； 悬浮于 50 mL 活化缓冲液 （0.8 M NaOH， 20% 二甲亚砜， 10% 环氧氯丙烷， 0.5mg/ mL 硼氢化钠） 40摇床震荡 2.5 h， 然后倒入玻璃磨砂漏斗中， 在抽滤下经过每次 500mL 体 积的蒸馏水洗涤， 直到洗涤液 pH 至中性， 在抽干成湿饼状。 0018 10g精氨酸溶于0.1M NaOH。

20、溶液中与上述己二胺-Sepharose CL 4 B介质在60 恒温振荡12 h。 反应完毕， 用500 mL去离子水充分洗涤， 抽干， 得到亲和介质精氨酸-己二 胺 -Sepharose CL 4 B。 0019 （1） 介质最大吸附量的确定 确定介质的最大吸附量。取小麦胚芽脂肪酶标准品 （sigma） ， 用去离子水稀释至浓度 为 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700, 800, 900 g/mL， 调节 pH 值为 7.0， 分别加入 0.01 g 湿亲和介质， 4 充分振荡 2 h 后， 测定上清中的酶浓度， 计算介质的最大吸附量 ； 达到 80.51.9。

21、 mg/g 介质。 0020 （2） 特异性吸附的验证 考察该介质对小麦胚芽脂肪酶的特异性识别， 分别取 1mg 小麦胚芽脂肪酶标品 （sigma） 与 20mg 麦胚蛋白 （提取液采用 20mM PBS， pH 7.0） 混合， 与该组介质进行吸附， 使 用 pH 7.0 的20mM PBS 清洗， 最后用 0.1 M HAc 洗脱， 测定酶活、 含量并进行电泳分析， 特异 性吸附含量达到 3.4g/mL。 0021 蛋白含量测定使用 Bradford 法。 0022 小麦胚芽脂肪酶水解酶活性采用橄榄油乳化法。 0023 实施例 5 ： 亲和介质硅胶 - 苯甲嘧啶的合成及应用 硅胶 （50 。

22、g） 用 500mL 体积的去离子水洗涤， 抽干成湿饼状 ； 悬浮于 50 mL 活化缓冲液 （0.8 M NaOH， 20% 二甲亚砜， 10% 环氧氯丙烷， 0.5mg/mL 硼氢化钠） 40摇床震荡 2.5 h， 然 后倒入玻璃磨砂漏斗中， 在抽滤下经过每次 500mL 体积的蒸馏水洗涤， 直到洗涤液 pH 至中 性， 在抽干成湿饼状。 活化的硅胶介质悬浮于500 mL 0.1M NaOH溶液中， 加入20 mL 1， 6 说 明 书 CN 103013951 A 5 4/4 页 6 己二胺， 凝胶在搅拌 （200 rpm） 下 30 恒温 12 h， 用去离子水清洗。 0024 己二胺。

23、-硅胶 （50 g） 用500mL体积的去离子水洗涤， 抽干成湿饼状 ； 悬浮于50 mL 活化缓冲液 （0.8 M NaOH， 20% 二甲亚砜， 10% 环氧氯丙烷， 0.5mg/ml 硼氢化钠） 40 摇床 震荡 2.5 h， 然后倒入玻璃磨砂漏斗中， 在抽滤下经过每次 500mL 体积的蒸馏水洗涤， 直到 洗涤液 pH 至中性， 在抽干成湿饼状。 0025 10g 苯甲嘧啶与己二胺 - 硅胶介质在 0.1M NaOH 溶液中 60恒温 12 h。反应完 毕， 用 500 mL 去离子水充分洗涤， 抽干， 得亲和介质苯甲嘧啶 - 己二胺 - 硅胶。 0026 （1） 介质最大吸附量的确定。

24、 同实施例 4。吸附量达到 1032.8 mg/g 介质。 0027 （2） 特异性吸附的验证 同实施例 4， 特异性吸附为 2.9g/mL。 0028 实施例 6 吸附和洗脱 ： 将小麦胚芽脂肪酶经过实施例 1,2,3 制备得到粗酶液， 再用实施例 5 制得的硅胶 苯甲嘧啶进行亲和吸附， 亲和吸附的条件为 pH 值 6.5， 电导率为 5-10 ms/cm ； 然后采用 0.1mol/L NaCl 清洗液冲洗所述脂肪酶亲和介质， 清洗液冲洗所述酶亲和介质的清洗条件 为 pH 值 7.0， 电导率 510 ms/cm ； 最后用 0.1mol/L NaOH 洗脱缓冲液洗脱所述亲和介质上 吸附的酶， 洗脱条件为 pH 值 3.5， 得到纯酶。详细结果见表 1 表 1 在此说明书中， 本发明已参照其特定的实施例作了描述。 但是， 很显然仍可以作出各种 修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此， 说明书应被认为是说明性的而非限制性 的。 说 明 书 CN 103013951 A 6 。