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1、(10)申请公布号 CN 103013905 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013905 A *CN103013905A* (21)申请号 201310019037.4 (22)申请日 2013.01.19 C12N 5/04(2006.01) (71)申请人 安徽科技学院 地址 233100 安徽省滁州市凤阳县东华路 9 号 (72)发明人 李杰勤 王丽华 詹秋文 周青 万海波 王茂辉 (54) 发明名称 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术 (57) 摘要 本发明公开了一种真空酶解法制备苏丹草原 生质体的技术， 属于生物技术领域。 苏丹草种子出 苗后， 将苏丹。
2、草幼叶和茎切成一定大小， 利用抽真 空酶解的方法对幼叶和茎的细胞壁进行酶解， 从 而分离出大量苏丹草原生制体的方法。利用本方 法可以便捷、 快速地制备出大量细胞完好的苏丹 草原生质体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术的特征在于， 以苏丹草嫩叶和茎为对 象， 利用细胞壁消化酶在真空环境下消化细胞壁释放原生质体， 它包括苏丹草幼苗准备， 幼叶和茎的处理， 抽真空酶解， 原生质体解离， 过滤残渣和原生质体悬浮 6 个。
3、步 骤。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的苏丹草幼苗准备的做法是 ： 选取饱 满的苏丹草种子， 种入营养钵， 25培养 8 天。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的幼叶和茎的处理的做法是 ： 剪取苏 丹草的幼叶和茎 1g 左右， 将叶片切成 1mm 长。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的抽真空酶解的做法是 ： 将切好的 茎、 叶放入已加入 10mL 酶解液的三角瓶中， 置于 -0.1MPa 真空环境 1 小时， 取出后用锡箔纸 盖好三角瓶口放入 28摇床， 转速 40rpm， 酶解 3 小时。 5. 根据权利要求 1 。
4、所述的方法， 其特征在于， 所述的原生质体解离的做法是 ： 倒掉酶解 液， 加入解离液 10ml， 28摇床， 转速为 80rpm， 解离 1 小时。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的过滤残渣的做法是 ： 用 200 目尼龙 布过滤解离后的苏丹草叶片残渣， 滤液转入 50mL 离心管， 90 G 离心 3 分钟。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的原生质体悬浮的做法是 ： 倒掉上清 液， 加入 300L 悬浮液， 轻轻摇动离心管悬浮原生质体， 即可得大量的原生质体细胞。 权 利 要 求 书 CN 103013905 A 2 1/2 页 3 一种。
5、真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术 技术领域 0001 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术属于生物技术领域， 更具体的说是一 种利用细胞壁裂解酶在真空环境下裂解苏丹草幼叶和茎的细胞壁从而制备大量原生质体 的技术。 背景技术 0002 原生质体是指除去细胞壁的细胞或一个被质膜包围的裸露细胞。 大量制备原生质 体是细胞组织培养和植物基因功能研究的重要基础。 苏丹草原生质体的制备方法目前尚无 报道， 苏丹草原生质体的制备方法的建立有利于苏丹草相关研究的进一步开展。 0003 发明内容 0004 本发明的目的是采用一种真空酶解的方法大量制备苏丹草的原生质体， 制备的原 生质体可以用于苏丹草的转基因。
6、和基因功能等方面的研究。 0005 本发明是这样实现的 ： 1. 一种真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术的特征在于， 以苏丹草嫩叶和茎为对 象， 利用细胞壁消化酶在真空环境下消化细胞壁释放原生质体， 它包括苏丹草幼苗准备， 幼叶和茎的处理， 抽真空酶解， 原生质体解离， 过滤残渣和原生质体悬浮 6 个步 骤。 0006 2. 上述的 6 个步骤是这样进行的 ： 苏丹草幼苗准备 ： 选取饱满的苏丹草种子， 种入营养钵， 25培养 8 天。 0007 幼叶和茎的处理 ： 剪取苏丹草的幼叶和茎 1g 左右， 将幼叶和茎切成约 1mm 长。 0008 抽真空酶解 ： 将切好的幼叶和茎放入已加入 10m。
7、L 酶解液的三角瓶中， 真空环境 （-0.1MPa ） 1 小时， 取出后用锡箔纸盖好三角瓶口放入 28摇床， 转速 40rpm， 酶解 3 小时。 0009 原生质体解离 ： 倒掉酶解液， 加入解离液 10ml， 28摇床， 转速为 80rpm， 解离 1 小时。 0010 过滤残渣 ： 用 200 目尼龙布过滤解离后的苏丹草叶片残渣， 滤液转入 50mL 离心 管， 90 G 离心 3 分钟。 0011 原生质体悬浮 ： 倒掉上清液， 加入 300L 悬浮液， 轻轻摇动离心管悬浮原生质 体， 即可得大量的原生质体细胞。 0012 本发明的有益效果 ： 利用真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术。
8、可以快捷、 大量地制 备出苏丹草的原生质体， 而且本方法制备的原生质体细胞完整性好， 细胞死亡少， 方法简 便。 0013 具体实施方式 ： 下面结合具体实例对真空酶解法制备苏丹草原生质体的技术进行进一步的描述。 说 明 书 CN 103013905 A 3 2/2 页 4 0014 实施例 1 ： 苏丹草 S722 原生质体的制备 1. 苏丹草幼苗准备 ： 选取饱满的苏丹草 S722 的种子， 种入营养钵， 25培养 8 天。 0015 2. 幼叶和茎的处理 ： 剪取苏丹草 S722 的幼叶和茎 1g， 用刀片将叶片切成约 1mm 长。 0016 3. 抽真空酶解 ： 将切好的茎、 叶放入已。
9、加入 10mL 酶解液的三角瓶中， 真空环境 （-0.1MPa ） 1 小时， 取出后用锡箔纸盖好三角瓶口放入 28摇床， 转速 40rpm， 酶解 3 小时。 （酶解液配方 ： 0.645M 甘露醇， 10mM 氯化钾， 1mM 氯化钙， 8mM 2- 吗啉乙磺酸， PH5.5， 1.5% 纤维素酶和 0.3% 的离析酶 R-10） 。 0017 4. 原生质体解离 ： 倒掉酶解液， 加入解离液 10ml， 28摇床， 转速为 80rpm， 解离 1 小时 （解离液配方 ： 154mM 氯化钠， 125mM 氯化钙， 5mM 氯化钾， 2mM 2- 吗啉乙磺酸 ,PH 5.7 ） 。 。 0018 5. 过滤残渣 ： 用200目尼龙布过滤解离后的苏丹草叶片残渣， 滤液转入50mL离心 管， 90 G 离心 3 分钟。 0019 6. 原生质体悬浮 ： 倒掉上清液， 加入 300L 悬浮液， 轻轻摇动离心管悬浮原生质 体， 即可得大量的原生质体细胞 （悬浮液配方 ： 0.6M 甘露醇， 15mM 氯化钙， 4mM 2- 吗啉乙磺 酸， PH5.7） 。 0020 经检测， 通过以上步骤在得到的原生质体数量达到 107个以上， 且细胞完整性好， 完全满足实验需求。 说 明 书 CN 103013905 A 4 。