一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103013898 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013898 A *CN103013898A* (21)申请号 201210440849.1 (22)申请日 2012.11.07 C12N 1/21(2006.01) C12P 17/00(2006.01) C12P 7/62(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 宁波美诺华药业股份有限公司 地址 315040 浙江省宁波市高新区扬帆路 999 弄宁波研发园 B1 幢 12B 层 申请人 浙江大学宁波理工学院 (72)发明人 金志华 胡升 杨岳微 姚成志 。

2、王爱珂 金庆超 杨郁 梅乐和 高然 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种表达羰基还原酶的重组 工程菌及其应用， 该工程菌包括宿主细胞和转入 宿主细胞的重组载体， 所述重组载体由原始载体 及接入原始载体的目的基因构成， 所述宿主细胞 为大肠杆菌 (Escherichiacoli)Rosetta(DE3)， 所述的目的基因为羰基还原酶基因， 碱基序列如 SEQ ID NO.1 所示。本发明重组工程菌羰基还原 酶表达水平较高， 利用诱导培养的菌体细胞将氮， 氮 -。

3、 二甲基 -3- 氧基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸 盐转化为(S)- 氮， 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻 吩 )-l- 丙胺 ； 或将 4- 氯乙酰乙酸乙酯转化为 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯， 两种产物的光学纯 度及转化率均较高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种表达羰基还原酶的重组工程菌， 包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体， 所 述重组载体。

4、由原始载体及插入原始载体的目的基因构成， 其特征在于， 所述宿主细胞为大 肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)， 所述目的基因为羰基还原酶基因， 碱基序列如SEQ ID NO.1 所示。 2. 如权利要求 1 所述的重组工程菌， 其特征在于， 所述原始载体为 pET-28a(+)。 3. 如权利要求 1 2 任一所述重组工程菌在生产手性药物中间体中的应用， 所述手性 药物中间体为 (S)- 氮， 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺或 (S)-4- 氯 -3- 羟基 丁酸乙酯。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 将。

5、所述重组工程菌接入培养基， 诱导培养后收集菌体细胞 ； (2)将菌体细胞悬浮于pH67的缓冲液中， 加入原料和共底物， 反应完成后， 分离纯化 得到手性药物中间体 ； 所述原料为氮， 氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺或其盐酸盐、 4-氯乙酰乙酸 乙酯。 5. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述反应的温度为 30 35。 6. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述反应的时间为 24 48h。 7. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述共底物为葡萄糖。 8. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于， 所述原料的浓度为 2 5g/L， 所述共底。

6、物的 浓度为 5 12g/L， 所述菌体细胞的浓度为 2 10g/L。 权 利 要 求 书 CN 103013898 A 2 1/7 页 3 一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种重组工程菌株， 尤其涉及一种表达羰基还原酶的重组工程菌及其 应用。 背景技术 0002 度洛西汀 (duloxetine)， 化学名为 (+)-(S)-N- 甲 - 基 -(1- 萘氧基 )-2- 噻吩 基盐酸， 是欣百达 (cymbalta) 的有效成分。它是一种 5- 羟色胺 (5-HT) 和去甲肾上腺素 (NE) 再摄取的双重抑制药， 通过增加突触间隙中 5- 羟色胺和去甲肾。

7、上腺素水平来治疗抑 郁症， 并通过阻断通往脑的疼痛信号来治疗神经病理性疼痛。该药 2004 年 8 月 3 日获美国 食品药品监督管理局批准在美国上市以治疗重症抑郁， 同年 9 月 3 日又被批准用于治疗糖 尿病性周围神经疼痛(DPN)。 目前已成为3-芳氧基-3-芳基丙胺类抗抑郁药物的最优秀的 代表， 每年的销售额近达 35 亿美元。(S)- 氮， 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺 (S)-DHTP) 是合成度洛西汀重要手性中间体 ( 见图 1)， 具有重要的应用价值。 0003 4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯中含有性质活泼的氯原子， 使之在一些不对称合成中 。

8、得到广泛应用， 成为许多手性药物的重要手性中间体。例如， 通过不对称还原， 可以由 4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯得到 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯， 后者是合成 Slagenins B 和 C， 以及 HMG-CoA 还原酶抑制剂的关键手性中间体， 在医药工业中也具有重要的用途。 0004 制备(S)-氮， 氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-l-丙胺和(S)-4-氯-3-羟基丁 酸乙酯的方法主要包括化学合成法和生物合成法两大类。 化学合成度洛西汀中间体的方法 主要是利用化学催化剂四氢铝锂 (LiAlH4) 或硼化氢 (BH3) 催化前手性酮化合物氮， 氮 - 二 甲基-3-氧。

9、代-3-(2-噻吩)-l-丙胺盐酸盐不对称还原为氮， 氮-二甲基-3-羟基-3-(2-噻 吩 )-l- 丙胺， 再利用化学拆分剂如 (S)- 扁桃酸拆分消旋体醇。化学合成 S-4- 氯 -3- 羟基 丁酸乙酯的方法是以铑、 钌等价格昂贵的金属作为催化剂、 以氢气作为还原剂进行的。 这些 化学还原方 法不仅产率和产物光学纯度低， 而且还存在反应安全性差、 成本高、 副反应多 以及环境污染严重等缺点。 0005 生物合成法是利用生物体内的羰基还原酶(Alcohol dehydrogenase， ADH)作为催 化剂， 将潜手性酮化合物直接还原成手性醇。生物合成法包括酶催化和全细胞催化法两大 类， 。

10、由于游离酶催化的氧化还原反应需要价格昂贵的辅酶 (NADPH 或者 NADH)， 而微生物细 胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、 必需的辅酶和再生途径， 只需加入少量廉 价的共底物 ( 如蔗糖或葡萄糖 )， 因此后者更加方便实用。 0006 细胞催化法制备手性药物关键中间体的关键是要获得高活力 ( 羰基还原酶活力 ) 的微生物菌株。但目前， 利用野生菌株生物催化存在的一个问题是获得羰基还原酶活力并 不高， 而且培养周期长。此外， 由于野生菌体自身酶种类繁多， 所获的产物中常常还有菌体 中其他酶类作用所产生的副产物， 需要对产物进行复杂的分离纯化才能得到合乎质量要求 的产品， 导致生产成。

11、本增加。 说 明 书 CN 103013898 A 3 2/7 页 4 发明内容 0007 本发明提供了一种表达羰基还原酶的重组工程菌， 以解决野生菌株羰基还原酶表 达水平和表达酶活不足的问题。 0008 一种表达羰基还原酶的重组工程菌， 包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体， 所述重组载体由原始载体及插入原始载体的目的基因构成， 所述宿主细胞为大肠杆菌 (E.coli)Rosetta(DE3)， 所述目的基因为羰基还原酶基因， 碱基序列如SEQ ID NO.1所示。 0009 优选的， 所述原始载体为 pET-28a(+)。 0010 本发明还提供了所述重组工程菌在生产手性药物中间体中的应用。

12、， 所述手性药物 中间体为 (S)- 氮， 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺或 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸 乙酯。 0011 具体包括以下步骤 ： 0012 (1) 将所述重组工程菌接入培养基， 诱导培养后收集菌体细胞 ； 0013 (2)将菌体细胞悬浮于pH67的缓冲液中， 加入原料和共底物， 反应完成后， 分离 纯化得到度洛西汀中间体 ； 0014 所述培养基为 LB 培养基 ； 诱导剂选用 IPTG 或乳糖， IPTG 浓度为 0.1 1mmol/L， 更优选为 0.3mmol/L， 若诱导剂为乳糖， 所述乳糖浓度为 1.5 3.0/L， 更优选为。

13、 2.0g/L ； 诱 导培养的温度为 25 37， 优选为 32 ； 诱导培养的时间为 10 15h。 0015 所述原料为氮， 氮-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-l-丙胺或其盐酸盐、 4-氯乙酰 乙酸乙酯。 0016 所述共底物为葡萄糖或蔗糖， 葡萄糖的添加不仅有利于产物产率的提高， 还能够 影响反应的立体选择性。 0017 菌体细胞的浓度影响反应体系中的酶量， 一般的， 所述干菌体细胞的浓度为 2 10g/L， 更优选为 4g/L。 0018 另外， 原料、 共底物的浓度也影响反应速度及最终产物的产率。一般的， 所述原料 的浓度为 2 5g/L ； 所述共底物的浓度为 5 12g/。

14、L， 更优选为 10g/L。 0019 适宜的温度有利于反应的进行， 所述反应的温度为 30 35， 若温度过高， 则容 易导致反应过程中羰基还原酶的失活。 0020 所述反应的时间为 24 48h。时间过短， 反应未进行完全， 产物的产率低， 而时间 过长， 此时反应体系内的原料、 共底物等已消耗完全， 已经没有继续反应的必要。 0021 反应结束后， 要对反应液进行分离纯化， 以得到手性药物中间体， 所述分离纯化方 法为 ： 先用萃取剂对反应液进行萃取， 然后对萃取液进行旋蒸处理。 0022 本发明重组工程菌羰基还原酶表达水平较高， 利用诱导培养的菌体细胞将氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧。

15、代 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐或 4- 氯乙酰乙酸乙酯转化为 (S)- 氮， 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺或 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯， 产物光学纯度 及转化率均较高。 0023 本发明工程菌表达的羰基还原酶可以以 NADPH 或者 NADH 作为辅酶， 但依赖 NADPH 作辅酶时活性更高。羰基还原酶最适反应温度是 40， 反应最适 pH 为 8， 金属离子 Ca2+对 酶反应具有促进作用， 且 Ca2+浓度为 0.5mmol/L 时作用效果最好。 说 明 书 CN 103013898 A 4 3/7 页 5 附图说明 0024。

16、 图 1 为度洛西汀关键中间体的结构式通式 ； 0025 其中， 常见的 R 基可以有以下几种， 括号里面是根据 R 基不同， 度洛西汀关键中间 体的命名也不相同， 0026 R1 -CH2N(CH3)2(DHTP)， R2 -COOCH2CH3(HEES)， 0027 R3 -CH2Cl(CTPO)， R4 -CONHCH3(MHTPA)， R5 -CN(HTPN) ； 0028 图 2 为重组工程菌生物合成 (S)-DHTP 的反相 HPLC 图 ； 0029 图 3 为重组工程菌生物合成 (S)-DHTP 的正相 HPLC 图 ； 0030 图 4 为重组工程菌生物合成 (S)-CHBE。

17、 的 GC 图 ； 0031 图 5 为重组工程菌生物合成 (S)-CHBE 的正相 HPLC 图。 具体实施方式 0032 一、 菌株及培养基 0033 (1) 菌株 0034 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC2.1977可以购自中国普通微 生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。 0035 大肠杆菌DH5为商业化产品， 大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞购自 百泰克生物公司。 0036 (2) 培养基 0037 PYD固体培养基 ： 葡萄糖10g， 酵母膏10g， 蛋白胨20g， 琼脂15g， 加水至1000mL， pH 自然。

18、。 0038 PYD 液体培养基 ： 葡萄糖 10g， 酵母膏 10g， 蛋白胨 20g， 加水至 1000mL， pH 自然。 0039 LB 固体培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl10g， 琼脂 15g， 加水至 1000mL， pH7.0。 0040 LB 液体培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl10g， 加水至 1000mL， pH7.0。 0041 二、 目的基因的克隆 0042 挑取马克斯克鲁维酵母 (K.marxianus)CGMCC2.1977 保藏菌株在琼脂斜面培养 基 28活化 48h， 然后接种于 30mLPYD 液体培养。

19、基， 在容积为 250mL 的锥形瓶中于 28下 200r/min 振荡培养 48h， 取 5mL 菌液于 10000r/min 离心一分钟后弃去上清液， 采用上海生 工所产酵母基因组提取试 剂盒， 按说明书提取基因组。 经电泳验证， 提取产物为单一条带， 大小与基因组大小相当， 无 RNA 污染。 0043 搜索GenBank数据库中已有的马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)羰基还原酶基因 序列进行 Blast 比对， 仅在土壤杆菌中找到一小段序列相近片段。以 genbank 马克斯克鲁 维酵母 (K.marxianus) 羰基还原酶基因序列为模板， 用引物设计软件 DNAMAN6.0。

20、 设计了一 对简并引物 ： 0044 上游引物 1 ： 5 -cggggatccatgacatttacagtggtgac-3 0045 下游引物 2 ： 5 -cgggaattcttacccacggtacgcgcccac-3 0046 其中， 上游引物中的 “ggatcc” 为限制性核酸内切酶 BamH I 酶切位点， 下游引物中 的 “gaattc” 为限制性核酸内切酶 EcoR I 酶切位点。 0047 用上游引物 1 和与下游引物 2 配对， 选择和优化模板 /Taq 酶 / 引物比例， 退火温 说 明 书 CN 103013898 A 5 4/7 页 6 度， 循环次数， 以靶基因组马。

21、克斯克鲁维酵母 (K.marxianus)CGMCC2.1977 为模板进行 PCR， 以得到扩增片段大小合适、 丰度适度和非特异条带少的 PCR 结果。 0048 经过优选上、 下游简并引物配对和模板 /Tag/ 引物比例， 退火温度， 循环次数， 最 终得到了一个长度约为 1038bp 的 DNA 条带。 0049 所确定的PCR体系组成为(单位 ： L) ： 超纯水， 38.5 ； Taq buffer， 5 ； 上游简并引 物， 0.1 ； 下游简并引物， 0.1 ； dNTP， 4 ； 模板， 1 ； Taq 酶， 0.5 ； 反应总体积为 50。 0050 所用 PCR 条件为 ：。

22、 94变性 4min 后进入扩增循环， 即 94变性 1min， 52退火 40s， 72延伸 4min， 共循环 30 次， 最后在 72延伸 10min。所得 PCR 产物经凝胶电泳检验， 所得产物条带单一、 清晰、 明亮， 大小在 1000 1500bp 之间且接近 1000bp。 0051 克 隆 产 物 送 上 海 生 工 进 行 测 序， 发 现 其 与 genbank 马 克 斯 克 鲁 维 酵 母 (K.marxianus)羰基还原酶基因(AB183149)同源性100(SEQ ID NO.1)， 证实其为目的产 物为羰基还原酶基因。 0052 三、 目的基因原核表达载体的构建。

23、 0053 为了提高目的基因的双酶切效率， 先将目的基因与 pMD19-T Vector 按照 pMD19-T Vector 使用说明书进行连接， 连接产物转化到 (E.coli)DH5 感受态细胞中， 蓝白斑筛选 得阳性克隆， 再对阳性克隆菌株培养 12h 提取 质粒。由于在克隆目的基因时， 已经在引物 的两端分别引入了 BamH I 和 EcoR I 限制性核酸内切酶的酶切位点， 所以在构建表达载体 时， 只要选择需要的质粒， 采用 BamH I 和 EcoR I 对插有目的基因的 pMD19-T Vector 和载 体质粒分别进行双酶切， 然后按照常规的双酶切连接方法连接目的基因和载体质。

24、粒， 即可 得到可用于表达的载体。具体而言， 在本实施例， 采用了 pET-28a(+) 作为载体质粒， 按照表 1 所述双酶切条件对目的基因和 pET-28(+) 分别进行双酶切。 0054 表 1 双酶切反应条件 0055 0056 注 ： 酶切温度为 37。 0057 质粒 pET-28a(+) 和插有目的基因的 pMD19-T Vector 分别酶切 1h， 分别对酶切产 物进行电泳纯化和切胶回收， 电泳验证回收产物并估算载体和待插入片段的浓度， 然后按 表 2 所示条件进行连接反应。 0058 表 2 连接反应体系组成 0059 说 明 书 CN 103013898 A 6 5/7 。

25、页 7 0060 注 ： 连接温度为 4， 连接 16 小时。 0061 按表 1 条件分别对质粒 pET-28a(+) 和插有目的基因的 pMD19-T Vector 进行双酶 切， 所得产物进行凝胶电泳分离， 并分别切胶回收、 纯化载体和目的基因片段， 所得产物取 样进行凝胶电泳验证。 然后按照表2所列条件进行连接， 连接反应结束后80保温5min灭 活连接酶， 取 5L 连接产物转化到 50L 大肠杆菌 (E.coli)Rosetta(DE3) 感受态细胞。 0062 连接产物按热转化法转化到按照上海生工公司高效感受态制备试剂 盒的 说明书制备的大肠杆菌 （E.coli)Rosetta(。

26、DE3) 感受态细胞中， 将转化好的 （E.coli) Rosetta(DE3) 细胞涂布于含有终浓度为 30g/mL 卡那霉素和 28g/mL 的氯霉素的 LB 固 体培养基， 37培养16小时后分别挑出阳性克隆， 在含有与LB固体培养基相同浓度抗生素 的 LB 液体培养基中培养过夜， 提取质粒后进行 BamH I 和 EcoR I 双酶切、 PCR 验证。 0063 结果发现， 从表 2 连接条件对应的连接产物转化子中得到了含有目的条带的质 粒， 说明成功地实现了目的片段与载体质粒的连接， 构建了表达羰基还原酶基因的质粒 pET-28a(+)-adh。取重组菌的质粒送上海生工采用 T7 通。

27、用引物测序， 测序结果与马克斯克 鲁维酵母的羰基还原酶基因的序列一致性为 100， 说明目的基因插入载体方向正确， 没有 碱基缺失等问题， 成功构建了重组表达载体。 0064 四、 羰基还原酶在大肠杆菌工程菌中的表达 0065 挑取含重组表达载体的重组工程菌在含有终浓度为 30g/mL 卡那霉素和 28g/ mL 的氯霉素的 LB 固体培养基平板上于 37活化 10 小时， 然后挑取单菌落接种 15mL 含有 30g/mL 卡那霉素和 28g/mL 的 LB 液体培养基， 在 37、 200r/min 摇床培养过夜后按 1的接种量接种于 50mL 含有 30g/mL 卡那霉素和 28g/mL 。

28、氯霉素的 LB 液体培养基， 在 37、 转速为 200r/min 的恒温振荡器进行培养 3 小时， 然后加入诱导剂异丙基 -D- 硫 代半乳糖苷 (IPTG)， 诱导剂终浓度为 0.3mmol/L， 然后改变培养温度到 32， 继续培养 9 小 时。 0066 培养结束后， 在4、 4000r/min离心15min收集菌体， 收集的菌体用生理盐水淋洗 两次， 加入原体积1/10的破胞液(50mmol/L PBS、 1mmol/LPMSF、 300mmol/L NaCl和10mmol/ L 咪唑， pH8.0)， 重悬菌体在 -70和 4冰箱里反复冻融 4 次以上， 4000r/min 离心 。

29、15min 后收集上清液及菌体用于 SDS-PAGE 电泳检测。 0067 五、 羰基还原酶的性质鉴定 0068 羰基还原酶酶活的测定是按照反应液在反应过程中 NADPH 在 340nm 处吸光度的 变化来计算氧化还原酶的活力。测定羰基还原酶的标准条件为 ： 总反应体积为 1mL， 其中含 2mol的NADPH， 3mol的底物(4-氯乙 酰乙酸乙酯(COBE)， 50mol pH8.0的Tris-HCl 缓冲液， 于 40水浴恒温 2min 后加入 50L 酶液开始检测 340nm 处吸光度的变化。每单位 说 明 书 CN 103013898 A 7 6/7 页 8 酶活定义为在上述条件下，。

30、 每分钟催化氧化 1mol NADPH 的酶活力。 0069 将在大肠杆菌表达的羰基还原酶酶液在标准条件下测酶活， 将反应液放在 20 60条件下水浴恒温 2min 后测酶活， 最优为 40。酶液最适 pH 的测定是改变反应体系的 pH 为 3 9， 按照标准酶活测定方法测得酶还原反应最适反应 pH 为 8。另外还考察了不同 的金属离子对酶活的影响， 其中 Fe2+、 Na+、 Zn2+、 Cu2+对酶活产生抑制作用， Mn2+、 Mg2+、 Ca2+对 酶有一定的激活作用， 最优选择是 Ca2+， 且浓度为 0.5mmol/L 效果最好。 0070 考察羰基还原酶对底物的特异性， 选用的底物。

31、有氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻 吩)-l-丙胺盐酸盐， 4-氯乙酰乙酸乙酯和苯乙酮。 结果发现， 以4-氯乙酰乙酸乙酯效果最 好， 氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐次之， 效果最差的是苯乙酮， 后两者 作为底物测酶活的活力大小相差不是很大 ； 以氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺 盐酸做底物时， 酶的催化活力是以 4- 氯乙酰乙酸乙酯为底物所测得酶活值的 60。 0071 六、 重组菌株转化氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧代 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐 (DKTP) 制备 (S)- 氮， 。

32、氮 - 二甲基 -3- 羟基 -3-(2- 噻吩 )-l- 丙胺 (S)-DHTP) 0072 用无菌生理盐水重悬步骤四中经诱导培养获得的菌体， 然后再次 4000rpm 离心 15min 收集菌体。将菌体悬浮于 30mL 的 0.1mol/L pH 为 6.8 磷酸缓冲液体系中， 干菌体的 密度值为 4g/L， 氮， 氮 - 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐的浓度为 3.3g/L， 10g/ L 葡萄糖， 控制反应体系温度在 30 35， 体系 pH 值在 6 7 之间。200r/min 振荡反应 48 小时， 调节 pH 至 12 左右， 用等体积的乙酸乙酯萃取反。

33、应物， 旋蒸两次后用适量的异丙醇 溶解， 用于液相检测。 0073 DKTP 转化率的液相检测条件 ： 采用 SinoChrom ODS-BP(200mm4.6mm， 5m， 大连依利特 ) 色谱柱 ； 检测波长 254nm ； 流动相为乙腈 pH2.5KH2PO4三乙胺 40 60 0.1(v/v) ； 流速 ： 1.0mL/min ； 柱温 ： 25； 进样 20L。由图 2 可知， DKTP 的保留 时间为 5.554min， DHTP 的保留时间为 4.773min。 0074 DHTP 光学纯度检测条件 ： 采用 Sino-Chiral OD0B03013-C(200 mm4.6mm。

34、， 5m， 大连依利特 ) 色谱柱， 流速 ： 1.0mL/min， 柱温 ： 40， 进样 5L。检测波长 203nm， 流动相为 正己烷乙醇三氟乙酸 95 5 0.1(v/v)， S 型保留时间为 30.353min， R 型保留时间 为 24.987min。 0075 由图 3 可知， 产物为 S 型， 光学纯度为 97.5 e.e(e.e 为对映体过量值 )， 转化率 为 41.7。 0076 七、 重组菌株转化 4- 氯乙酰乙酸乙酯 (COBE) 制备 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯 (S)-CHBE) 0077 转化步骤与制备 (S)-DHTP 相同， 重组工程菌对 4.0。

35、g/L COBE 进行生物催化， 干菌 体密度值为 4g/L， 共底物葡萄糖浓度是 10g/L， 30条件下 200r/min 振荡反应 24h， 用乙酸 乙酯萃取反应物， 取适量的体积加入5L二甲基亚砜(DMSO)作为内标物， 气相检测得到产 率。再将萃取液中的乙酸乙酯旋干加入无水乙醇用于正相检测， 得出光学纯度 e.e 值。 0078 CHBE 气相检测条件 ： 采用 1970F 气相色谱仪， 毛细管柱 SE-30 ； 载气为氮气 ； 1L 进样量 ； 氢离子检测器。由图 4 可知， 内标物出峰时间为 3.219min， 产物出峰时间为 3.946min。 0079 标准曲线制作 ： 配置。

36、不同浓度的 CHBE， 加 5L 二甲基亚砜内标物， 根据两物质峰 说 明 书 CN 103013898 A 8 7/7 页 9 面积和含量比值做标准曲线， 曲线函数为y2.2133x-0.2014， R20.9968。 其中y代表产 物与内标物含量比值， x 代表产物与内标物峰面积比值。CHBE 光学纯度检测所用的柱子与 检测 DHTP 光学纯度的柱子相同， CHBE 检测条件 ： 检测波长 217nm ； 流动相为正己烷异丙 醇三氟乙酸90100.1(v/v)， S型保留时间为5.196min， R型保留时间为6.369min。 0080 由图5可知， 在S型产物出峰时间(5.196min。

37、)有出峰， 在R型出峰时间(6.369min) 未出现峰形， 因此产物光学异构体为 S 型， 光学纯度为 100 e.e， 转化率为 81.0。 说 明 书 CN 103013898 A 9 1/4 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103013898 A 10 2/4 页 11 0003 序 列 表 CN 103013898 A 11 3/4 页 12 0004 序 列 表 CN 103013898 A 12 4/4 页 13 序 列 表 CN 103013898 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103013898 A 14 2/2 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103013898 A 15 。