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1、(10)申请公布号 CN 103013983 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013983 A *CN103013983A* (21)申请号 201210594774.2 (22)申请日 2012.12.31 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 林浴霜 胡玮 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试 剂及应用方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于保存动物肌肉组织中。
2、 核糖核酸的试剂及应用方法， 所述试剂包括保存 液和浸润液， 利用所述有机相试剂可快速浸润和 处理肌肉组织样品， 实现高效而经济的保存其中 核糖核酸组分的目的。同时， 本发明所提供的保 存液具有配制简单， 成本较低， 使用方便的特点， 且本发明所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方 法， 不但降低了核糖核酸提取对于动物肌肉组织 的保存要求， 方便样品采集， 还可以把因为核糖核 酸降解的原因造成的实验失败率降到最低， 为实 验的准确性提供保障， 为之后获得高质量的核糖 核酸及进行相关研究奠定基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知。
3、识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液， 所述保存液由乙醇、 甲醇和三氯 乙酸配比而成， 其特征在于 ： 所述乙醇含量以体积百分比计占保存液总体积的 9599%， 所 述甲醇含量以体积百分比计占保存液总体积的 15%， 所述三氯乙酸含量以质量百分比计占 保存液总质量的 0.11%。 2. 如权利要求 1 所述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液， 其特征在于 ： 所述 保存液中乙醇含量以体积百分比计占保存液总体积的 96.598%， 所述甲醇含量以体积百 分比计占保存液总体积的 23.。
4、5%， 所述三氯乙酸含量以质量百分比计占保存液总质量的 0.20.35%。 3. 一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液， 所述浸润液由甲醇和乙醇配比而 成， 其特征在于 ： 所述甲醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的 9099%， 所述乙醇含量 以体积百分比计占浸润液总体积的 110%。 4. 如权利要求 3 所述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液， 其特征在于 ： 所述 浸润液中甲醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的 9598%， 所述乙醇含量以体积百分比 计占浸润液总体积的 25%。 5. 一种保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 步骤是 ： 将新鲜采集的动物肌肉样品切 成粒径不大。
5、于 10mm 的块状， 用其等体积量的权利要求 3 所述的浸润液冲洗 1-2 次， 然后转 到体积量为其体积 2-5 倍的浸润液中， 室温放置 0.5-2 小时 ； 之后过滤除去浸润液 ； 将除去 浸润液的样品置于含有其 3-10 倍体积量的权利要求 1 所述保存液的瓶中， 密封瓶口， 常温 下保存动物肌肉组织24-48小时 ； 或4保存动物肌肉组织1-2周 ； 或者置于液氮中保存动 物肌肉组织 1-1.5 年。 6. 如权利要求 5 所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 其特征在于 ： 所述样品切 成粒径为 4-5mm 的块状。 7. 如权利要求 5 所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，。
6、 其特征在于 ： 所述用于浸 润样品的浸润液使用体积量选择样品体积的 3-4 倍， 室温放置时间为 1-1.2 小时。 8. 如权利要求 5 所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 其特征在于 ： 所述用于保 存样品的保存液使用体积量选择样品体积的 5-8 倍。 权 利 要 求 书 CN 103013983 A 2 1/5 页 3 一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法， 属于动物 基因工程和生物化学领域。 背景技术 0002 核糖核酸 （ribonucleic acid， 简写为RNA） 是生物细胞。
7、中的遗传信息载体， 普遍存 在于动物、 植物、 微生物及某些病毒和噬菌体内， 也是基因工程中研究基因表达以及克隆目 的基因等过程需要操作的重要生物大分子。由于 RNA 极不稳定， 容易发生特异性或非特异 性降解， 所以在实验过程中通常选用新鲜的样本并且立刻提取纯化 RNA， 这极大地增加了实 验的复杂程度并降低了样品收集和处理的效率。因此， 研究人员也开发了不同的方法直接 保存新鲜样本， 以便以后提取完整的 RNA。 0003 针对动物的肌肉组织而言， 直接保存样本以便之后提取 RNA 的方法主要有两类。 第一种方法是样品采集后直接放入液氮保存。 这种方法对于这对样本的采集时间和保存具 有很大。
8、的限制性， 尤其体现在对于特殊设备的需求上， 例如液氮罐。 如果不能将新鲜采集的 肌肉样本立刻至于液氮中， 除了RNA分子可能发生降解之外， 由于应激反应产生新的RNA都 可引起 RNA 状态的改变， 给后续的实验带来操作误差。第二类方法是将采集的组织样品置 于市售的 RNA 保存液中， 室温短期保存或者低温长期保存。但是， 商品化的组织 RNA 保存液 价格较为昂贵， 且使用量较大， 一般是样本体积的 5-10 倍， 极不经济。目前使用的可以手工 配制的组织 RNA 保存液的配方均为含有多种盐类水相体系， 例如柠檬酸钠， 硫酸铵， 异硫氰 酸胍， 乙二胺四乙酸等。其不但配制复杂， 成本较高，。
9、 而且水相体系还存在样品浸润时间较 长的问题， 一般需要在 4 摄氏度下放置 24 小时， 使用不方便。因此， 研究和开发用于保存动 物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法具有重要意义。 发明内容 0004 针对现有技术的不足， 本发明要解决的问题是提供一种用于保存动物肌肉组织中 核糖核酸的试剂及应用方法。 利用本发明所述的有机相试剂能够实现快速浸润和处理肌肉 组织样品， 达到高效而经济的保存其中 RNA 组分的目的。 0005 为实现上述目的， 本发明提供了一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存 液， 所述保存液由乙醇、 甲醇和三氯乙酸配比而成， 其特征在于 ： 所述乙醇含量以体积百分 比计。
10、占保存液总体积的 9599%， 所述甲醇含量以体积百分比计占保存液总体积的 15%， 所 述三氯乙酸含量以质量百分比计占保存液总质量的 0.11%。 0006 上述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液中 ： 所述保存液中乙醇含量以体 积百分比计优选占保存液总体积的 96.598%， 所述甲醇含量以体积百分比计优选占保存液 总体积的 23.5%， 所述三氯乙酸含量以质量百分比计优选占保存液总质量的 0.20.35%。 0007 为实现上述目的， 本发明还提供了一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润 液， 所述浸润液由甲醇和乙醇配比而成， 其特征在于 ： 所述甲醇含量以体积百分比计占浸润 说 。
11、明 书 CN 103013983 A 3 2/5 页 4 液总体积的 9099%， 所述乙醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的 110%。 0008 上述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液中 ： 所述浸润液中甲醇含量以体 积百分比计优选占浸润液总体积的 9598%， 所述乙醇含量以体积百分比计优选占浸润液总 体积的 25%。 0009 为实现上述目的， 本发明提供了一种保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 步骤 是 ： 将新鲜采集的动物肌肉样品切成粒径不大于 10mm 的块状， 用其等体积量的上述的浸润 液冲洗 1-2 次， 然后转到体积量为其体积 2-5 倍的浸润液中， 室温放置 0.5-。
12、2 小时 ； 之后过 滤除去浸润液 ； 将除去浸润液的样品置于含有其 3-10 倍体积量的上述保存液的瓶中， 密封 瓶口， 常温下保存动物肌肉组织 24-48 小时 ； 或 4保存动物肌肉组织 1-2 周 ； 或者置于液 氮中保存动物肌肉组织 1-1.5 年。 0010 其中， 上述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法中 ： 所述样品优选切成粒径为 4-5mm 的块状。所述用于浸润样品的浸润液使用体积量优先选择样品体积的 3-4 倍， 室温 放置时间优选为 1-1.2 小时。所述用于保存样品的保存液使用体积量优先选择样品体积的 5-8 倍。 0011 基于上述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 在。
13、对保存的动物肌肉组织进行 RNA 提取之前， 可直接过滤除去保存液， 实施总 RNA 提取。 0012 本发明提供的动物肌肉组织有机浸润液可以在常温下快速完成肌肉组织的浸润 并用于后续的保存， 与传统的水相保存液相比， 浸润时间缩短了 10 倍以上。本发明提供的 动物肌肉组织 RNA 有机相保存液具有配制简单， 成本较低， 使用方便的特点。同时， 本发明 提供的保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法， 不但降低了 RNA 提取对于动物肌肉组织的保 存要求， 方便样品采集， 还可以把因为样品 RNA 降解的原因造成的实验失败率降到最低， 为 实验的准确性提供保障， 为获得高质量的 RNA 及相关技术的。
14、研究奠定基础。 附图说明 0013 图 1 从本发明所述方法保存不同时间的鸡肌肉组织中提取总 RNA 的 1% 琼脂糖凝 胶电泳检测结果。 0014 其中， 泳道 1 为从未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总 RNA ； 泳道 2 为从常温下保 存 48 小时鸡肌肉组织提取的总 RNA ； 泳道 3 为从 4 摄氏度保存 1 周鸡肌肉组织提取的总 RNA ； 泳道 4 为从液氮中保存 1 年鸡肌肉组织提取的总 RNA。 0015 图 2 以从本发明所述方法保存不同时间的鸡肌肉组织中提取总 RNA 为模板， 利用 反转录 - 聚合酶链式反应 （RT-PCR） 扩增鸡 - 肌动蛋白基因并进行 1% 琼。
15、脂糖凝胶电泳检 测的结果。 0016 其中， 泳道1为以从未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果 ； 泳道 2 为以从常温下保存 48 小时鸡肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果 ； 泳道 3 为以 从 4 摄氏度保存 1 周鸡肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果 ； 泳道 4 为以从液氮中保 存 1 年鸡肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果， 泳道 5 为 D2000 分子量标记。 0017 图 3 从本发明所述方法保存不同时间的牛肌肉组织中提取总 RNA 的 1% 琼脂糖凝 胶电泳检测结果。 0018 其中， 泳道 1 为从未经保存的新鲜牛肌肉组织提取的总。
16、 RNA ； 泳道 2 为从常温下保 说 明 书 CN 103013983 A 4 3/5 页 5 存 48 小时牛肌肉组织提取的总 RNA ； 泳道 3 为从 4 摄氏度保存 1 周牛肌肉组织提取的总 RNA ； 泳道 4 为从液氮中保存 1 年牛肌肉组织提取的总 RNA。 0019 图 4 以从本发明所述方法保存不同时间的牛肌肉组织中提取总 RNA 为模板， 利用 反转录 - 聚合酶链式反应 （RT-PCR） 扩增牛 - 肌动蛋白基因并进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检 测的结果。 0020 其中， 泳道1为以从未经保存的新鲜牛肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果 ； 泳道 2 为以从常温下保。
17、存 48 小时牛肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果 ； 泳道 3 为以 从 4 摄氏度保存 1 周牛肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果 ； 泳道 4 为以从液氮中保 存 1 年牛肌肉组织提取的总 RNA 为模板的扩增结果， 泳道 5 为 D2000 分子量标记。 具体实施方式 0021 下面通过式实例来进一步阐明本发明， 这些实施例仅在于说明本发明而绝不限制 本发明。 0022 实施例 1 鸡的肌肉组织中 RNA 的保存 ： 以取自刚孵化出的汶上芦花鸡腿部的肌肉 组织为例。 0023 浸润液的配置 ： 将 9.5ml 甲醇与 0.5ml 乙醇充分混匀， 置于室温待用。 0024。
18、 保存液的配置 ： 将0.2mg三氯乙酸溶于10ml乙醇中， 振荡至固体完全溶解， 配制成 三氯乙酸母液 ； 将 9.79ml 乙醇， 0.2ml 甲醇和 0.01ml 三氯乙酸母液充分混匀， 置于室温待 用。 0025 将新鲜采集的鸡的肌肉组织样品切成边长为 5mm 小块， 使用 0.125ml 浸润液冲 洗一次， 将样品置于 0.375ml 的浸润液中室温放置 1 小时 ； 过滤除去浸润液 ； 将样品置于 0.8ml 的保存液中， 密封于样品瓶中。 0026 分别在常温下保存24小时， 4摄氏度保存1周和置于液氮中保存1年后取出样品， 过滤除去保存液。 0027 利用常规的 Trizol 。
19、法提取保存的鸡肌肉组织总 RNA ： 取 75mg 肌肉组织， 加入 1ml Trizol（Invitrogen Life Technologies 公司） 快速充分匀浆组织 ； 电动匀浆器采用 DEPC 水配制的 75% 乙醇处理除去 RNase， 室温静置 5min， 使其充分裂解 ； 加入氯仿 0.2ml， 用力振 摇， 室温放置3min ； 412,000g离心15min， 吸取上层水相， 移置另一离心管 ； 加入0.5ml冷 异丙醇， 将管中液体混匀， 室温静置 20min ； 4 12,000g 离心 10min， 弃上清 ； 加入 75% 乙醇 （DEPC 水配制） 1ml， 充。
20、分洗涤沉淀， 4 10,000g 离心 5min， 弃上清， 室温干燥 ； 加入适量的 DEPC 水溶解 RNA。 0028 提取的总 RNA 均利用紫外分管光度计分别检测 260nm 和 280nm 的吸光度 A260 和 A280， 计算二者的比值。 0029 结果为 ： 未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.88 ； 常温 下保存 24 小时的鸡肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.85 ； 4 摄氏度保存 1 周的鸡 肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.93 ； 置于液氮中保存 1 年鸡肌肉组织提取的总。
21、 RNA 的 OD260/280 值为 1.82。纯化的总 RNA 吸光度 A260/A280 比值均为 1.8-1.95， 并且不 同样本之间无明显差别。 0030 提取的总 RNA 均利用常规的 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果如附图 1 所示 ： 在 说 明 书 CN 103013983 A 5 4/5 页 6 所有样品中， 28S 和 18S RNA 条带均清晰可见， 5S RNA 条带也可检测到， 并且不同样本之间 无明显差别。 0031 提取的总 RNA 均进行针对管家基因 - 肌动蛋白基因的反转录 - 聚合酶链式 反应扩增， 所使用的引物序列为 ： 上游引物 5-CTGACT。
22、GACCGCGTTACTCC-3 和下游引物 5-GGGGTACTTCAGGGTCAGGA-3。然后利用常规的 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果如附图 2 所示 ： 在所有样品中， 长度为 241bp 的目的产物条带均清晰可见， 并且不同样本之间无明 显差别。 0032 以上结果表明利用本发明所述的保存动物肌肉组织的方法， 可以高效而经济的保 存鸡的肌肉组织中的 RNA。 0033 实施例 2 牛的肌肉组织中 RNA 的保存 ： 以取自鲁西黄牛的腿部肌肉组织为例。 0034 浸润液的配置 ： 将 9.7ml 甲醇与 0.3ml 乙醇充分混匀， 置于室温待用。 0035 保存液的配置 ： 将。
23、 0.35mg 三氯乙酸溶于 10ml 乙醇中， 振荡至固体完全溶解， 配制 成三氯乙酸母液 ； 将 9.69ml 乙醇， 0.3ml 甲醇和 0.01ml 三氯乙酸母液充分混匀， 置于室温 待用。 0036 将新鲜采集的鸡的肌肉组织样品切成边长为 5mm 小块， 使用 0.125ml 浸润液冲 洗一次， 将样品置于 0.4ml 的浸润液中室温放置 1.2 小时 ； 过滤除去浸润液 ； 将样品置于 0.9ml 的保存液中， 密封于样品瓶中。 0037 分别在常温下保存48小时， 4摄氏度保存1周和置于液氮中保存1年后取出样品， 过滤除去保存液。 0038 利用常规的 Trizol 法提取保存的。
24、牛肌肉组织总 RNA ： 取 75mg 肌肉组织， 加入 1ml Trizol（Invitrogen Life Technologies 公司） 快速充分匀浆组织 ； 电动匀浆器采用 DEPC 水配制的 75% 乙醇处理除去 RNase， 室温静置 5min， 使其充分裂解 ； 加入氯仿 0.2ml， 用力振 摇， 室温放置3min ； 412,000g离心15min， 吸取上层水相， 移置另一离心管 ； 加入0.5ml冷 异丙醇， 将管中液体混匀， 室温静置 20min ； 4 12,000g 离心 10min， 弃上清 ； 加入 75% 乙醇 （DEPC 水配制） 1ml， 充分洗涤沉淀，。
25、 4 10,000g 离心 5min， 弃上清， 室温干燥 ； 加入适量的 DEPC 水溶解 RNA。 。 0039 提取的总 RNA 均利用紫外分管光度计分别检测 260nm 和 280nm 的吸光度 A260 和 A280， 计算二者的比值。结果为 ： 未经保存的新鲜牛肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.7 ； 常温下保存 48 小时的牛肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.86 ； 4 摄氏 度保存 1 周的牛肌肉组织提取的总 RNA 的 OD260/280 值为 1.78 ； 置于液氮中保存 1 年牛肌 肉组织提取的总 RNA 的 OD26。
26、0/280 值为 1.79。纯化的总 RNA 吸光度 A260/A280 比值均为 1.7-1.9， 并且不同样本之间无明显差别。 0040 纯化的总 RNA 均利用常规的 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果如附图 3 所示 ： 在 所有样品中， 28S 和 18S RNA 条带均清晰可见， 并且不同样本之间无明显差别。 0041 纯化的总 RNA 均进行针对管家基因 - 肌动蛋白基因的反转录 - 聚合酶链式 反应扩增， 所使用的引物序列为 ： 上游引物 5-CACCCCGCTTCTCTCTAAGGA-3 和下游引物 5-CTCAACCCGCTCCCAAGG-3。然后利用常规的 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果如附图 4 所示 ： 在所有样品中， 长度为 233bp 的目的产物条带均清晰可见， 并且不同样本之间无明显 差别。 说 明 书 CN 103013983 A 6 5/5 页 7 0042 以上结果表明利用本发明所述的保存动物肌肉组织的方法， 可以高效而经济的保 存牛的肌肉组织中的 RNA。 说 明 书 CN 103013983 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103013983 A 8 。