《一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体PMD19/HPT.pdf（13页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103045629 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103045629 A *CN103045629A* (21)申请号 201210538198.X (22)申请日 2012.12.13 C12N 15/63(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 吉林巨润生物技术有限公司 地址 136001 吉林省四平市铁东区沥山路 1978 号 (72)发明人 池振明 池哲 周海翔 徐金利 李慧娟 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限。
2、责任公司 22100 代理人 陈宏伟 (54) 发明名称 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT (57) 摘要 本发明的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖 解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 可以用于敲除马克 斯克鲁氏酵母MIG1基因， 用于敲除该酵母MIG1基 因， 获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株。 可以 用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因， 用于敲除 该酵母MIG1基因， 获得乳糖酶基因表达葡萄糖解 阻遏菌株， 能够使许多蛋白基因的表达都会受到 葡萄糖解阻遏作用， 在有葡萄糖存在情况下有关 蛋白质或酶产量会大幅度提高， 特别是乳糖酶， 可 以利用高产乳糖酶酵母菌通过发。
3、酵生产乳糖酶， 降低乳糖酶生产成本和应用乳糖酶的费用， 提高 含乳糖牛奶和奶制品处理效果， 对增加人类食用 牛奶和奶制品的营养， 增强身体健康具有重要的 实际意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 碱基序列见如 SEQ No.1 所示。 2. 权利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT制备方法， 包括以 下步骤 。
4、： 将 扩 增 的 PCR 产 物 与 载 体 pMD19-T Simple 的 连 接 ； 连 接 产 物 pMD19/HPT 转 化 E.coliDH5 感受态细胞 ； 质粒的提取、 酶切及回收用于转化酵母的线性 DNA 片段 ： 利用质粒提取试剂盒提取质粒， 质粒提取过程按照试剂盒说明进行 ； 用XhoI 酶切 pMD19/HPT 质粒 ； 37酶切 4 h 后， 加入 2.0 L10loading buffer 终止反应， 并用 0.8% （w/v） 的琼脂糖凝胶电泳检测， 回收目的片段 ； 转化与筛选 （1） 取 80.0 L 的K. marxianus感受态细胞， 加入浓缩并除盐的。
5、线性 DNA 片段后混 匀， 转至 0.2 cm 冰预冷的电击杯中 ； 通过电击的方法把线性 DNA 片段转化到K. marxianus 感受态细胞 ； （2） 分别取 10、 25、 50、 100 和 200 L 混合液涂布在含有 100.0 g/mL 潮霉素和 0.1% X-gal（w/v） 的 YPD 平板上 ； （3） 经过培养挑取长出的蓝色菌落接到含有 100.0 g/mL 潮霉素、 0.1% X-gal（w/v） 的 YPD 平板上进行纯化 ； （4） 挑取纯化后的菌落接种于 100.0 mL 乳糖培养基中， 于 28 C、 180 rpm 振荡培养 48 h， 测定乳糖酶活性，。
6、 同时用没有转化的原始菌株作为对照， 筛选出乳糖酶产量明显提高的 敲除菌株。 3. 制备权利 1 所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 所涉及的引物序 列如下 ： H1 5 -CTCGAGCCATAAGCATCCGAAGAATAGAAAAGTCGA-3 H2 5 -GTGAGTTCAGGCTTTTTCATACCTATTCTATACTCGTCGTCG-3 H3 5 -GAGTATAGAATAGGTATGAAAAAGCCTGAA-3 H4 5 -GTAGCTGCAGTCAGTGCTTCAGTGTTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3 H5 5 -GCACT。
7、C GTCCGAGGGCAAAGAAATAGAACACTGAAGCACTGACTGCAGCTAC-3 H6 5-CTCGAGACTAGTAATTATGTCCAGTAAGTAGGTTGTG-3 YH1 5-AACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGC-3 YH2 5-ACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTC-3 MS 5-ATGTCATCAGAGGTAGTGCCTTTG-3 MX 5-TCAATGCTGCTCCCGGGGTAAGAT-3 。 权 利 要 求 书 CN 103045629 A 2 1/7 页 3 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT 技术领域 。
8、0001 本发明公开一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 属于生物技术领 域。 背景技术 0002 - 半乳糖苷酶 （EC 3.2.1.23） ， 通常称为乳糖酶， 可催化牛奶和奶制品中乳糖水 解产生葡萄糖及半乳糖， 并且具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶在食品、 医药、 能源工业和畜 牧业等领域的广泛应用， 因而受到越来越多的关注。通过牛奶和奶制品中乳糖的水解增加 这些食品的营养价值， 解决乳糖不耐症食用牛奶和奶制品出现的问题， 同时产乳糖酶的微 生物可以用于处理乳清废水， 减少环境污染。许多细菌、 丝状真菌和酵母菌可以产生乳糖 酶， 其中克鲁氏酵母菌如马克斯克鲁氏酵母 （Kl。
9、uyveromyces marxianus） ， 乳酸克鲁氏酵母 （Kluyveromyces lactis） 和极地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17-1菌株产生的乳糖 酶受到广泛重视。尤其马克斯克鲁氏酵母具有很强的同化乳糖和菊粉的能力、 生长速率极 快、 代时短、 生长时耐高温、 具有很强的分泌胞外产物的能力和是被美国食品药物局确认为 最安全的微生物， 而在许多方面得到了广泛应用。但是所有产乳糖酶的微生物乳糖酶基因 表达和合成乳糖酶时会受到培养基中的葡萄糖严重阻遏， 由于工业用培养基和含乳糖培养 基中存在有葡萄糖， 所以葡萄糖阻遏会严重影响有关微生物的乳糖酶产量。 0。
10、003 在葡萄糖阻遏过程中一种叫做 Mig1 蛋白起非常重要的作用， 这种蛋白是一种带 有 C2H2 的锌指蛋白， 能结合在受葡萄糖阻遏的各种基因启动子上， 被结合的基因启动子必 须含有(G/C)(C/T)GGGG序列， 在该序列的5 -端还得有富含 AT的区域 （AT-rich region） 。 现在发现 Mig1 蛋白是细胞中具有广泛调控作用的一种蛋白质， 只要这些蛋白基因启动子 含有 (G/C)(C/T)GGGG 序列， 这些蛋白基因的表达都会受到 Mig1 蛋白的调控作用。所以该 细胞中MIG1基因被敲除后， 许多蛋白基因的表达都会受到葡萄糖解阻遏作用， 在有葡萄糖 存在情况下有关蛋。
11、白质或酶产量会大幅度提高。这样构建合适的敲除载体， 敲除马克斯克 鲁氏酵母MIG1基因， 对于提高该酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生产实际意义。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 可以用 于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因， 用于敲除该酵母MIG1基因， 获得乳糖酶基因表达葡萄 糖解阻遏菌株。 0005 本发明的技术解决方案如下 ： 构建了可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因 的敲除载体 pMD19-HPT, 携带有潮霉素磷酸转移酶基因 （HPT） 、 用于同源重组的马克斯克鲁 氏酵母MIG1基因启动子序列和终止子序列和用于删除H。
12、PT基因的Loxp片段 （5-ATAACTTC GTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3） ， 在HPT基因表达框上下游各加入一个LoxP位点， 并使 二者同向， 可以利用 Cre 重组酶将HPT基因表达框删除。在转化敲除载体进入产乳糖酶的 马克斯克鲁氏酵母细胞之前， 用 DNA 限制性内切酶XhoI 酶切质粒 pMD19-HPT， 获得MIG1基 说 明 书 CN 103045629 A 3 2/7 页 4 因启动子片段-HPT基因-MIG1基因终止子片段 ； 转化该片段到产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵 母细胞后， 通过同源重组插入到正常的MIG1基因中， 利用HPT基因取代MI。
13、G1基因 ORF 框， 并可以稳定遗传 ； 获得转化子之后， 把质粒 pKlNatCre（携带有酶切 Loxp 片段的酶基因） 转 化到转化子中， 表达后删除HPT基因， 获得无HPT基因和MIG1基因的敲除菌株。 0006 本发明公开的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT， 其碱基序列见 如 SEQ No.1 所示。该载体大小为 4137 bp。 0007 本发明提供的一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT 制备方法如下 ： （1） PCR 产物的扩增 MIG1基因的启动子用 5端带有XhoI 酶切位点的引物 H1 和与克隆HPT基因的特殊引 物H3有共同序。
14、列的引物H2以K. marxianus 的基因组DNA为模板进行PCR扩增， 引物H1和 H2 是根据K. marxianus MIG1基因序列设计的。引物 H3 和 H4 是根据质粒 pCAMBIA 1381 上HPT基因序列设计的， 利用这对引物通过 PCR 技术扩增HPT基因 （1026 bp） 部分。MIG1 基因的终止子由引物 H5 和 H6 以K. marxianus的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增得到， 引 物 H6 的 5端带有XhoI 酶切位点， 引物 H5 和克隆HPT基因的特殊引物 H4 有共同序列， 引 物 H5 和 H6 也是根据K. marxianus M。
15、IG1基因设计的。 0008 PCR 扩增体系 ： LA Taq 酶 0.5 L 10LA Taq buffer 5.0 L dNTPs 8.0 L 基因组 DNA（25.0 ng/L） 2.0 L 上游引物 （10.0 M） 2.0 L 下游引物 （10.0 M） 2.0 L 无菌双蒸水 30.5 L 总体积 50.0 L PCR 扩增条件 ： 94 预变性 10.0 min ； 94 变性 1.0 min ； 54 退火 1.0 min ； 72 延伸 30 sec，（扩增HPT基因片段延伸时间为 1.2 min, 扩增全长延伸 2.0 min） ， 30 个循 环 ； 72 延伸 10.。
16、0 min。 0009 将启动子、HPT基因和终止子 3 个 PCR 产物按一定比例 （1:4:1） 混合， 由于启动子 和HPT基因之间含有共同序列，HPT基因和终止子之间含有共同序列， 因此变性退火之后， 它们能彼此融合， 以 H1（5） 和 H6（3） 为两侧引物， 以混合的 PCR 产物为模板进行 PCR 扩增， 可以扩增得到3个片段首尾相接的DNA目的片断 （MIG1基因的启动子:HPT:MIG1基 因的终止子， 见图 1 所示） ， 取 10 L PCR 反应产物利用琼脂糖凝胶电泳 （0.8%， w/v） 进行 分析， DNA 目的片段采用胶回收试剂盒进行回收纯化。 0010 （2。
17、） PCR 产物与载体 pMD19-T Simple 的连接 按照 TaKaRa 公司的 T-A 克隆载体连接试剂盒的说明书将 PCR 产物与载体 pMD19-T Simple 连接。 0011 连 接 体 系 为 10.0 L ： 胶 回 收 PCR 产 物 4.0 L、连 接 buffer Solution 5.0 L， pMD19-T Simple 0.5 L， 混匀后置于 16 C 下连接过夜。 0012 （3） 连接产物 pMD19/HPT 转化E.coliDH5 感受态细胞 说 明 书 CN 103045629 A 4 3/7 页 5 取E.coliDH5感受态细胞各100.0 L。
18、， 分别加入10.0 L连接产物及阴性、 阳性对 照样品， 轻轻混匀， 冰水浴 30 min ； 42 C 热休克 90 s， 此时不要摇动管， 迅速转移至冰水浴 中， 继续冰浴 2-3 min ； 加入 800.0 L LB 液体培养基， 37 C 下， 120 rpm 孵育 50 min ； 将 孵育后菌悬液离心， 去除培养液600.0 L， 将细胞重新悬浮， 取100.0 L该培养物涂布到 含有 10.0 L 20.0% IPTG（w/v） 、 40.0 L X-gal（20.0 mg/mL， w/v） 、 100.0 mg/mL Amp （氨苄青霉素） 的 LB 平板上， 置于 37 。
19、C 培养箱正放培养 30 min 后， 再倒置培养 12-16 h 后 观察。 0013 （4） 阳性克隆的筛选、 鉴定与测序 挑取白色阳性单克隆接种至含有100.0 g/mL Amp的5.0 mL LB液体培养基中， 37 C 下， 180 rpm 振荡培养至 OD600nm约 0.6。无菌取出 1mL 培养液， 在 4 C 下， 12000 g离心 1 min， 菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤两次后离心、 弃上清， 加适量无菌水煮沸 10 min， 12000 g离心 2 min 后取上清作为 PCR 模板， 用 H1 和 H6 引物进行 PCR 扩增， 体系及条件参照上 述， 阳性克隆委托上。
20、海生工公司测序。 0014 表 1 本发明所使用的引物 质粒的提取、 酶切及回收用于转化酵母的线性 DNA 片段 利用质粒提取试剂盒提取质粒， 质粒提取过程按照试剂盒说明进行。用XhoI 酶切 pMD19/HPT 质粒， 其酶切反应体系如下 ： 酶切体系 （20.0 L） ： 说 明 书 CN 103045629 A 5 4/7 页 6 XhoI 1.0 L 10H buffer 2.0 L 质粒 pMD19/HPT 5.0 L 灭菌水 12.0 L 37 C 酶切 4 h 后， 加入 2.0 L10loading buffer 终止反应， 并用琼脂糖凝胶电泳 （0.8%， w/v） 检测， 。
21、回收目的片段， 用胶回收试剂盒 （TaKaRa 生物工程有限公司， 大连） 回收 目的片段。 0015 转化与筛选 （1） 取 80.0 L 的K. marxianus感受态细胞， 加入浓缩并除盐的线性 DNA 片段 （10 L 影响转化效率） 后混匀， 转至 0.2 cm 冰预冷的电击杯中。通过电击的方法把 线性 DNA 片段转化到K. marxianus感受态细胞。 0016 （2） 分别取 10、 25、 50、 100 和 200 L 混合液涂布在含有 100.0 g/mL 潮霉素和 0.1% X-gal（w/v） 的 YPD 平板上。 0017 （3） 经过培养挑取长出的蓝色菌落接到。
22、新的 YPD （含有 100.0 g/mL 潮霉素、 0.1% X-gal， w/v） 平板上进行纯化。如图 2、 图 3 所示。 0018 （4） 挑取纯化后的菌落接种于 100.0 mL 乳糖培养基中， 于 28 C、 180 rpm 振荡培 养 48 h， 测定乳糖酶活性， 同时用没有转化的原始菌株作为对照， 筛选出乳糖酶产量明显提 高的敲除菌株。 0019 本发明的积极效果在于 ： 可以用于敲除马克斯克鲁氏酵母MIG1基因， 用于敲除该 酵母MIG1基因， 获得乳糖酶基因表达葡萄糖解阻遏菌株， 能够使许多蛋白基因的表达都会 受到葡萄糖解阻遏作用， 在有葡萄糖存在情况下有关蛋白质或酶产量。
23、会大幅度提高， 特别 是乳糖酶， 可以利用高产乳糖酶酵母菌通过发酵生产乳糖酶， 降低乳糖酶生产成本和应用 乳糖酶的费用， 提高含乳糖牛奶和奶制品处理效果， 对增加人类食用牛奶和奶制品的营养， 增强身体健康具有重要的实际意义。 附图说明 0020 图 1 为本发明K. marxianus 的MIG1基因敲除质粒构建图 ； 图 2、 图 3 为在潮霉素平板上筛选阳性转化子 （A） ， B 的对照图 ； 图4为K. marxianus (A)和MIG1基因敲除菌株(B)在2-脱氧-D-葡萄糖培养基(加 X-gal) 中生长情况对照图。 具体实施方式 0021 实施例 1 1菌株和培养基 用于质粒回收。
24、和克隆的细菌是大肠埃希氏菌 DH5a， 生长该细菌的培养基是 LB 培养 基。 转化后的大肠埃希氏菌DH5a是培养在添加有30 g/ml氨卞青霉素的LB培养基中。 转 化所用的酵母菌株是产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母。 酵母菌生长在YPD培养基上 1.0%(w/ v) 酵母菌提取物 ,2.0%(w/v) 蛋白胨 ,2.0%(w/v) 葡萄糖 。酵母菌转化子生长在 YPD 培养 基加潮霉素。利用质粒 pMD19-HPT 和MIG1基因启动子片段 -HPT基因 -MIG1基因终止子片 说 明 书 CN 103045629 A 6 5/7 页 7 段分别转化大肠埃希氏菌和产乳糖酶的马克斯克鲁氏酵母菌。 。
25、0022 MIG1基因敲除载体的构建 敲除载体构建的流程如图 1 所示， 所使用的引物见表 1。 0023 （1） PCR 产物的扩增 MIG1基因的启动子用 5端带有XhoI 酶切位点的引物 H1 和与克隆HPT基因的特殊引 物H3有共同序列的引物H2以K. marxianus 的基因组DNA为模板进行PCR扩增， 引物H1和 H2 是根据K. marxianus MIG1基因序列设计的。引物 H3 和 H4 是根据质粒 pCAMBIA 1381 上HPT基因序列设计的， 利用这对引物通过 PCR 技术扩增HPT基因 （1026 bp） 部分。MIG1 基因的终止子由引物 H5 和 H6 以。
26、K. marxianus的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增得到， 引 物 H6 的 5端带有XhoI 酶切位点， 引物 H5 和克隆HPT基因的特殊引物 H4 有共同序列， 引 物 H5 和 H6 也是根据K. marxianus MIG1基因设计的。 0024 PCR 扩增体系 ： LA Taq 酶 0.5 L 10LA Taq buffer 5.0 L dNTPs 8.0 L 基因组 DNA（25.0 ng/L） 2.0 L 上游引物 （10.0 M） 2.0 L 下游引物 （10.0 M） 2.0 L 无菌双蒸水 30.5 L 总体积 50.0 L PCR 扩增条件 ： 94 预。
27、变性 10.0 min ； 94 变性 1.0 min ； 54 退火 1.0 min ； 72 延伸 30 sec，（扩增HPT基因片段延伸时间为 1.2 min, 扩增全长延伸 2.0 min） ， 30 个循 环 ； 72 延伸 10.0 min。 0025 将启动子、HPT基因和终止子 3 个 PCR 产物按一定比例 （1:4:1） 混合， 由于启动子 和HPT基因之间含有共同序列，HPT基因和终止子之间含有共同序列， 因此变性退火之后， 它们能彼此融合， 以 H1（5） 和 H6（3） 为两侧引物， 以混合的 PCR 产物为模板进行 PCR 扩增， 可以扩增得到3个片段首尾相接的DN。
28、A目的片断 （MIG1基因的启动子:HPT:MIG1基 因的终止子， 见图 1 所示） ， 取 10 L PCR 反应产物利用琼脂糖凝胶电泳 （0.8%， w/v） 进行 分析， DNA 目的片段采用胶回收试剂盒进行回收纯化。 0026 （2） PCR 产物与载体 pMD19-T Simple 的连接 按照 TaKaRa 公司的 T-A 克隆载体连接试剂盒的说明书将 PCR 产物与载体 pMD19-T Simple 连接。 0027 连接体系为 10.0 L ： 胶回收 PCR 产物 4.0 L、 连接 buffer Solution 5.0 L， pMD19-T Simple 0.5 L， 。
29、混匀后置于 16 C 下连接过夜。 0028 （3） 连接产物 pMD19/HPT 转化E.coliDH5 感受态细胞 取E.coliDH5感受态细胞各100.0 L， 分别加入10.0 L连接产物及阴性、 阳性对 照样品， 轻轻混匀， 冰水浴 30 min ； 42 C 热休克 90 s， 此时不要摇动管， 迅速转移至冰水浴 中， 继续冰浴 2-3 min ； 加入 800.0 L LB 液体培养基， 37 C 下， 120 rpm 孵育 50 min ； 将 孵育后菌悬液离心， 去除培养液600.0 L， 将细胞重新悬浮， 取100.0 L该培养物涂布到 说 明 书 CN 10304562。
30、9 A 7 6/7 页 8 含有 10.0 L 20.0% IPTG（w/v） 、 40.0 L X-gal（20.0 mg/mL， w/v） 、 100.0 mg/mL Amp （氨苄青霉素） 的 LB 平板上， 置于 37 C 培养箱正放培养 30 min 后， 再倒置培养 12-16 h 后 观察。 0029 （4） 阳性克隆的筛选、 鉴定与测序 挑取白色阳性单克隆接种至含有100.0 g/mL Amp的5.0 mL LB液体培养基中， 37 C 下， 180 rpm 振荡培养至 OD600nm约 0.6。无菌取出 1mL 培养液， 在 4 C 下， 12000 g离心 1 min， 菌。
31、体沉淀用无菌生理盐水洗涤两次后离心、 弃上清， 加适量无菌水煮沸 10 min， 12000 g离心 2 min 后取上清作为 PCR 模板， 用 H1 和 H6 引物进行 PCR 扩增， 体系及条件参照上 述， 阳性克隆委托上海生工公司测序。 0030 表 1 本发明所使用的引物 质粒的提取、 酶切及回收用于转化酵母的线性 DNA 片段 利用质粒提取试剂盒提取质粒， 质粒提取过程按照试剂盒说明进行。用XhoI 酶切 pMD19/HPT 质粒， 其酶切反应体系如下 ： 酶切体系 （20.0 L） ： XhoI 1.0 L 10H buffer 2.0 L 质粒 pMD19/HPT 5.0 L 。
32、灭菌水 12.0 L 说 明 书 CN 103045629 A 8 7/7 页 9 37 C 酶切 4 h 后， 加入 2.0 L10loading buffer 终止反应， 并用琼脂糖凝胶电泳 （0.8%， w/v） 检测， 回收目的片段， 用胶回收试剂盒 （TaKaRa 生物工程有限公司， 大连） 回收 目的片段。 0031 转化与筛选 （1） 取 80.0 L 的K. marxianus感受态细胞， 加入浓缩并除盐的线性 DNA 片段 （10 L 影响转化效率） 后混匀， 转至 0.2 cm 冰预冷的电击杯中。通过电击的方法把 线性 DNA 片段转化到K. marxianus感受态细胞。。
33、 0032 （1） 分别取 10、 25、 50、 100 和 200 L 混合液涂布在含有 100.0 g/mL 潮霉素和 0.1% X-gal（w/v） 的 YPD 平板上。 0033 （3） 经过培养挑取长出的蓝色菌落接到新的 YPD （含有 100.0 g/mL 潮霉素、 0.1% X-gal， w/v） 平板上进行纯化。如图 2、 图 3 所示。 0034 （4） 挑取纯化后的菌落接种于 100.0 mL 乳糖培养基中， 于 28 C、 180 rpm 振荡培 养 48 h， 测定乳糖酶活性， 同时用没有转化的原始菌株作为对照， 筛选出乳糖酶产量明显提 高的敲除菌株。 0035 试验。
34、例 1 MIG1基因敲除的验证 （1） PCR 验证 挑取K. marxianus菌株和MIG1基因敲除菌株的单菌落分别接种到含 50.0 mL 的液 体 YPD 培养基中， 于 28 C、 180 rpm 振荡培养 10-12 h。在 2500g和 4 C 下离心 10 min 收集并用无菌水洗涤细胞， 提取基因组DNA。 以它们的基因组DNA为模板， 分别用引物H1和 YH1、 H6 和 YH2、 MS 和 MX （见表 1 和图 1） 进行 PCR 扩增， 得到相应得 DNA 片段。K. marxianus 菌株不含有HPT基因， 而MIG1基因敲除菌株含有HPT基因。 0036 （2）。
35、 在 2- 脱氧 -D- 葡萄糖培养基中培养 将在 YPD 平板上活化后的K. marxianus和MIG1基因敲除菌株的单菌落分别接种到 含 1.2 mg/mL 2- 脱氧 -D- 葡萄糖培养基平板上， 于 28 C 培养箱中培养 2-3 d， 观察K. marxianus和MIG1基因敲除菌株的生长情况， 如图 4 所示。 0037 潮霉素抗性基因的删除 1） 用电转法将质粒pKlNatCre导入纯合体酵母细胞中， 涂布于含有100g/mL Zeocin YPD 平板上， 30 C 培养 2-3d。 0038 2） 挑取克隆于含有含有半乳糖的 1mL YPG 液体培养基的 EP 管中， 3。
36、0 C 振荡培养 2-4h。 0039 3） 涂布于 5 个 YPD 平板上， 30 C 培养 2-3d。 0040 4） 挑取单菌落于 5mL 液体 YPD 中， 30 C 振荡培养过夜。 0041 5） 提取基因组， 分别用引物 MS 和 MX（见表 1 和图 1） 进行 PCR 扩增， 得到相应得 DNA 片段。MIG1基因敲除菌株含有HPT基因， 而潮霉素抗性基因删除菌株不含有 HPT 基因。 0042 0042 6） 在含有潮霉素和不含有潮霉素平板上复筛， 重新得到对潮霉素敏感的 菌株。 0043 0043 7）在非选择性 YPD 中连续传代培养， 使 pKlNatCre 质粒自然丢。
37、失。 说 明 书 CN 103045629 A 9 1/2 页 10 SEQ No.1 吉林巨润生物技术有限公司 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体 pMD19/HPT 1 1 4137 DNA TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGT AAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTAT GCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATA。
38、CCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATA CCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC GCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGT AAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATT CTCGAGCCATAAGCATCCGAAGAATAGAAAAGTCGAAAAGAGAGCAGACGAGATATAAAATAGA。
39、GGATATTG TCAGAAGCGAGGAATAGTGACAGTAGTAGTGTATTTATTTGGACGAGAAAAAGGTTGTAAGCAAAAAGAGGTCCAAG TTCAAGGCATTTTAATATAGCTCGGAGCACTTACTTACGACGACGAGTATAGAATAGGTATAACTTCGTATAATGTA TGCTATACGAAGTTATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACA GCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCG。
40、ATGTAGGAGGGCGTGGATAT GTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCT CCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTTCACAGGGTG TCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTACAACCGGTCGCGGAGGCTATGGATGCGATCGCT GCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCG。
41、CAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGA TTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCG CGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGC TCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCA ATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCC。
42、GTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGA GGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCACGACTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGC TTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGAC TGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTG GAAACCGACGCCCCAGCACTC。
43、GTCCGAGGGCAAAGAAATAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAA CACTGAAGCACTGACTGCAGCTACTTACACAATTAAAAACACACACTCACACACATACAAGATACGTAATTCAACCT CTATAGACTATAAAATTGCGAAAGCAACACACAACCTACTTACTGGACATAATTACTAGTCTCGAGATCGTCGACCT GCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACAC AACATACGA。
44、GCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCG CTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTA 序 列 表 CN 103045629 A 10 2/2 页 11 TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA。
45、GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGG CCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC TCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGC GCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCT。
46、CAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAAC CCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCG CCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTG GCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCG。
47、GCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGC AGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTA AGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAA TCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGT CTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCC CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGG CCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGT AGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGT。