检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103031383 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103031383 A *CN103031383A* (21)申请号 201210583426.5 (22)申请日 2012.12.28 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国湖北出入境检验检 疫局 地址 430000 湖北省武汉市汉阳区琴台大道 588 号 (72)发明人 王振华 张建坤 徐家文 冯汉利 (74)专利代理机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人 周宗贵 刘荣 (54。

2、) 发明名称 检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病 原菌的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种基于二重 PCR 扩增检测 柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的 方法， 包括以下步骤 ： 首先取一只无菌离心管， 在 离心管中依次加入灭菌去离子水、 PCR 缓冲液、 dNTPs 混合物、 正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1、 反义引物 SPT2、 目标物 DNA 以 及 TaqDNA 聚合酶， 然后将其混合均匀后离心， 将 反应液离心至管底 ； 将离心管置于 PCR 仪上进行 扩增， 扩增后得到 PCR 反应产物 ； 将 PCR 产物用 2%-3% 琼脂糖凝。

3、胶电泳分离， 经溴化乙锭溶液染 色 12-20min 后， 在紫外透射仪上观察 PCR 反应结 果。 本发明提供的方法步骤简单、 能够有效果的对 两种病菌进行检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种基于二重 PCR 扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法， 其 特征在于包括以下步骤 ：（1） 、 取一只无菌离心管， 在离心管中依次加入灭菌去离子水、 PCR 缓冲液、 dNT。

4、Ps 混合物、 正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1、 反义引物 SPT2、 目 标物 DNA 以及 TaqDNA 聚合酶， 然后将其混合均匀后离心， 将反应液离心至管底 ； （2） 、 将离心管置于 PCR 仪上进行扩增， 扩增后得到 PCR 反应产物 ； （3） 、 PCR 产物用 2%-3% 琼脂糖凝胶电泳分离， 经溴化乙锭溶液染色 12-20min 后， 在紫 外透射仪上观察 PCR 反应结果。 2.根据权利要求1所述的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤 病原菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的 PCR 缓冲液为 10PC。

5、R 缓冲液， 所加入的去 离子水、 PCR 缓冲液、 dNTPs 混合物、 正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1、 反义 引物SPT2、 目标物DNA以及TaqDNA聚合酶之间的体积比为16 ： 2.5 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 0.5， 其 中正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1 以及反义引物 SPT2 的浓度均为 10M， dNTPs 混合物的浓度为 2.5 mM each， TaqDNA 聚合酶的浓度为 5U/l， 目标物 DNA 的浓度 为 100-200 ng/l。 3. 根据权利要求 1 所述的基。

6、于二重 PCR 扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝 瘤病原菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中扩增的程序为 ： 94 3min， 94 30S， 62 30S， 72 30S， 循环 32-36 次， 最后 72补时 5min。 权 利 要 求 书 CN 103031383 A 2 1/4 页 3 检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法， 尤其涉 及一种高灵敏性的应用二重 PCR 扩增技术检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原 菌的方法。 背景技术 0002 柑橘冬生疫霉褐腐病原菌 Ph。

7、ytophthora hibernalis Carne 具有寄主范围广， 为 害柑橘生产严重， 分布地域广的特点， 且都可以带病果实、 组织或无性繁殖材料进行远距离 传播。我国柑橘种植区域分布广泛， 近年来这些病原菌随着引进优质的种子苗木传人我国 的几率越来越大。一旦该病传入， 将对我国柑橘产业造成极大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病 原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的， 随后在其 他国家和地区也陆续发现。 该疫病是侵染柑橘引起的是一种毁灭性病害， 侵染初期， 果实表 皮出现浅褐色变色， 感染部位皮质坚硬， 湿度适合时长出白色菌丝体。受害果实味苦、 具腐 臭味。 中国。

8、的柑橘种植区域广泛， 地理气候多样， 有适合病害发生的地区， 故定殖可能性大。 近距离传播方式有风雨、 工具等传播途径， 远距离传播主要以土壤、 果实、 繁殖材料进行传 播。该病害一直持续困扰着意大利、 葡萄牙等地的柑橘生产。 0003 柑橘枝瘤病原菌 Sphaeropsis tumefaciens Hedges， 主要危害墨西哥酸橙、 来檬 和大多数的橘科植物。表现枝瘤和丛枝两类症状， 但以枝瘤及枝瘤溃疡为主。带病的植物 组织可传病原菌。病原菌可借风、 雨等近距离传播， 带病的植物组织如树枝、 病叶以及繁殖 材料是远距离传播病原菌的途径。许多柑橘栽培种都对此病敏感， 影响极大。2008 年 。

9、5 月 22 日， 欧盟食品安全局发布由法国当局完成的关于柑橘有害生物的风险评估报告就包括了 该病原菌的评估。 0004 目前针对疫霉属真菌的系统发育已有部分研究， 针对柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的 分子检测技术也有 PCR 检测的报道。2008 年， 张海峰等比较分析了冬生疫霉和其它疫霉 的 ITS 序列， 在此基础上设计了 1 对检测冬生疫霉的特异引物 751F/752R， 该对引物可从 冬生疫霉菌中扩增到一条长616 bp 的DNA条带， 而其它19 种疫霉和其它真菌均无扩增条 带。其检测限度可达到每 25 L 反应体系只需 10 fg 基因组 DNA 的水平， 但带菌柑橘样 品的扩增条带不。

10、特别明显。 0005 针对柑橘枝瘤病原菌， 目前， 柑橘枝瘤病原菌的检测仅见到有使用通用引物 ITS4 和 ITS5 进行 PCR 检测的报道。从 NCBI 的数据库中搜索， 也只有区区 2 条核糖体序列。因 此， PCR 引物设计成了难题。 0006 由上可见， 柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌是国外的柑橘中常见的两 种对柑橘的危害很大的两种病菌， 因此提供一种更高灵敏性的同时检测上述两种病菌的检 测方法， 成了本领域内的研究热点。 发明内容 说 明 书 CN 103031383 A 3 2/4 页 4 0007 本发明解决了上述背景技术中的难题， 提供了一种基于二重 PCR 扩增检测。

11、柑橘枝 瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法， 该方法步骤简单、 能够有效果的对两种病菌 进行检测。 0008 实现本发明上述目的所采用的技术方案为 ： 0009 一种基于二重 PCR 扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方 法， 其特征在于包括以下步骤 ：（1） 、 取一只无菌离心管， 在离心管中依次加入灭菌去离子 水、 PCR 缓冲液、 dNTPs 混合物、 正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1、 反义引物 SPT2、 目标物 DNA 以及 TaqDNA 聚合酶， 然后将其混合均匀后离心， 将反应液离心至管底 ； 0010 （2） 、 将离心管置。

12、于 PCR 仪上进行扩增， 扩增后得到 PCR 反应产物 ； 0011 （3） 、 PCR 产物用 2%-3% 琼脂糖凝胶电泳分离， 经溴化乙锭溶液染色 12-20min 后， 在紫外透射仪上观察 PCR 反应结果。 0012 步骤 （1） 中所述的 PCR 缓冲液为 10PCR 缓冲液， 所加入的去离子水、 PCR 缓冲液、 dNTPs 混合物、 正义引物 PHIB1、 反义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1、 反义引物 SPT2、 目标物 DNA 以及 TaqDNA 聚合酶之间的体积比为 16 ： 2.5 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 1 ： 0.5， 其中正义引物 PH。

13、IB1、 反 义引物 PHIB2、 正义引物 SPT1 以及反义引物 SPT2 的浓度均为 10M， dNTPs 混合物的浓度 为 2.5 mM each， TaqDNA 聚合酶的浓度为 5U/l， 目标物 DNA 的浓度为 100-200 ng/l。 0013 步骤 （2） 中扩增的程序为 ： 94 3min， 94 30S， 62 30S， 72 30S， 循环 32-36 次， 最后 72补时 5min。 0014 本发明提供的基于二重 PCR 扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原 菌的方法有以下优点 ：（1） 、 该方法能准确诊断出柑橘是否携带有这两种检疫性的病原真 菌 ；（2。

14、） 该方法采用二重 PCR 的方法， 只需要半天就可以鉴定出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和 柑橘枝瘤病原菌的种类， 可以快速通关 ；（3） 该方法重复性好， 灵敏度高， 目标物 DNA 只需要 100ng/L 就可以鉴定出柑橘携带病原真菌的种类。 附图说明 0015 图 1 为实施例 1 中的凝胶电泳检测结果图。 具体实施方式 0016 下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。 0017 本实施例中菌种柑橘冬生疫霉褐腐病原菌 （Phytophthora hibernalis Carne） 购 自美国 ATCC 菌种保藏中心， 编号为 32995TM， 并严格按照检疫危险性菌种进行操作与使用。 使。

15、用前经过 DNA 的 PCR 扩增、 克隆和测序的验证。 0018 本实施例所用菌种柑橘枝瘤病原菌 （Sphaeropsis tumefaciens Hedges） 购自美 国 ATCC 菌种保藏中心， 编号为 20908TM， 并严格按照检疫危险性菌种进行操作与使用。使用 前经过 DNA 的 PCR 扩增、 克隆和测序的验证。 0019 本实施例中目标物 DNA 的提取方法如下 ： 将 100l 浓度为 107孢子悬液涂布于 铺有灭菌玻璃纸的 PDA 和 V8 平板上， 18下培养 7-10 天， 刮取菌丝冷冻备用。取 0.5g 菌 丝， 置于离心管中， 加 2ml 己预热 (65 ) 的 。

16、CTAB 提取缓冲液中， 将离心管颠倒混匀， 65 水浴 5min， 轻轻混匀 ; 加入等体积的苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:l)， 混匀， 12000r/min 离 说 明 书 CN 103031383 A 4 3/4 页 5 心 15min， 取上清液于离心管中， 再加入等体积氯仿 : 异戊醇 (24:l) 混匀， 12000r/min 离心 15min， 取上清液于离心管中， 加入 2 倍体积的 100% 乙醇颠倒混匀， 12000r/min 离心 10min， 倾去上清液， 用 70% 乙醇将沉淀洗涤两次。洗涤结束后将含有 DNA 的离心管置于 37温箱 中干燥。干燥后加 。

17、30l TE 溶解沉淀， 于 -20保存备用。 0020 以 下 实 施 例 中 正 义 引 物 PHIB1 的 核 苷 酸 序 列 如 SEQ ID NO ： 1 所 示 ： 5 -TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3 ； 反义引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ： 5 -CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3。正义引物 SPT1 的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ： 5 -GAACGCAGCGAAATGCGATAAG- 3 ； 反义引物 SPT2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ： 5 -ATGCT。

18、NAAGTTCAGCGGGTAT- 3 。 0021 实施例 1 0022 本实施例中二重 PCR 反应体系的总体积为 25l， 具体的检测方法如下 ：（1） 取 一只无菌离心管， 在离心管中依次加入灭菌去离子水、 PCR 缓冲液、 浓度为 2.5mM each 的 dNTPs 混合物、 浓度为 10M 的正义引物 PHIB1、 浓度为 10M 的反义引物 PHIB2、 浓度为 10M的正义引物SPT1、 浓度为10M的反义引物SPT2、 浓度为100ng/l的目标物DNA以 及浓度为5U/l的TaqDNA聚合酶， 各物质的体积分别为 ： 16l、 2.5l、 1l、 1l、 1l、 1l、 。

19、1l、 1l 、 0.5l。然后将其混合均匀后离心， 将反应液离心至管底。 0023 （2） 、 将离心管置于 PCR 仪上进行扩增， 扩增程序为 94 下 3min， 94 下 30S， 62下 30S， 72下 30S， 循环 36 次， 最后 72下补时 5min， 扩增后得到 PCR 反应产物。 0024 （3） 、 PCR 产物用 3% 琼脂糖凝胶电泳分离， 经溴化乙锭溶液染色 20min 后， 在紫外 透射仪上观察 PCR 反应结果。 0025 结果显示应用引物对 PHIB1/PHIB2 与 SPT1/SPT2 进行二重 PCR 扩增， 同时检测柑 橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病。

20、原菌， 在琼脂糖凝胶上可以观察到仅有泳道 5 上有 2 条清晰的特异性的 DNA 片段 （307bp 和 407 bp） ， 如图 1 所示， 图 1 中泳道 M， DL2000; 泳道 1， 冬生疫霉菌 + 水 ； 泳道 2， 枝瘤病原菌 + 水 ； 泳道 3， 冬生疫霉菌 +PHIB， 泳道 4， 枝瘤病原 菌 +SPT ； 泳道 5， 冬生疫霉菌 + 枝瘤病原菌 +PHIB +SPT ； 泳道 6， 冬生疫霉菌 +SPT ； 泳道 7， 枝瘤病原菌 + PHIB。 0026 实施例 2 0027 本实施例中二重 PCR 反应体系的总体积为 25l， 具体的检测方法如下 ：（1） 取 一只。

21、无菌离心管， 在离心管中依次加入灭菌去离子水、 PCR 缓冲液、 浓度为 2.5mM each 的 dNTPs 混合物、 浓度为 10M 的正义引物 PHIB1、 浓度为 10M 的反义引物 PHIB2、 浓度为 10M的正义引物SPT1、 浓度为10M的反义引物SPT2、 浓度为200ng/l的目标物DNA以 及浓度为5U/l的TaqDNA聚合酶， 各物质的体积分别为 ： 14l、 2.5l、 1l、 1l、 1l、 1l、 1l、 1l 、 0.5l。然后将其混合均匀后离心， 将反应液离心至管底。 0028 （2） 、 将离心管置于 PCR 仪上进行扩增， 扩增程序为 94 下 3min，。

22、 94 下 30S， 62下 30S， 72下 30S， 循环 33 次， 最后 72下补时 5min， 扩增后得到 PCR 反应产物。 0029 （3） 、 PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳分离， 经溴化乙锭溶液染色 13min 后， 在紫外 透射仪上观察 PCR 反应结果。 0030 结果显示应用引物对 PHIB1/PHIB2 与 SPT1/SPT2 进行二重 PCR 扩增， 同时检测柑 橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌， 在琼脂糖凝胶上可以观察到有 2 条清晰的特异 说 明 书 CN 103031383 A 5 4/4 页 6 性的 DNA 片段 （307bp 和 407 bp） 。 说 明 书 CN 103031383 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103031383 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 103031383 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103031383 A 9 。