一种毕赤酵母菌及其在饲料发酵中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103045493 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103045493 A *CN103045493A* (21)申请号 201210594653.8 (22)申请日 2012.12.31 CGMCC No.6930 2012.12.03 C12N 1/16(2006.01) A23K 1/00(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人青岛海中大生物科技发展有限公司地址 266000 山东省青岛市平度市南村镇东北街村 (72)发明人栾锦涛陈继伟黄玲玲张盼盼 (74)专利代理机构北京众合诚成知识产权代理。

2、有限公司 11246 代理人龚燮英 (54) 发明名称一种毕赤酵母菌及其在饲料发酵中的应用 (57) 摘要本发明涉及一种毕赤酵母菌（Pichia jadinii） Hzd-pj-003，已于 2012 年 12 月 3 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.6930，它可以用在发酵饲料以及微生态制剂，是一种极具应用价值的益生菌。本发明的优势是：毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 有很强的耐酸性，可以在 pH 值为 2 的条件下缓慢生长；可以产生高含量的乙酸乙酯，。

3、具有独特的苹果香气，用在发酵饲料中可以增加适口性，提高采食量；用于发酵饲料中使发酵饲料的蛋白含量及水解酶类大大增加，促进动物消化吸收，提高饲料利用率，促进动物生长。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 1 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 1 页附图 3 页 1/1 页 2 1.一种毕赤酵母（Pichia jadinii），其特征在于所述毕赤酵母（Pichia jadinii）为毕赤酵母（Pichia jadinii。

4、） Hzd-pj-003，保藏号为： CGMCC No.6930。 2. 根据权利要求 1 所述的毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 在发酵饲料中的应用。权利要求书 CN 103045493 A 2 1/7 页 3 一种毕赤酵母菌及其在饲料发酵中的应用技术领域 0001 本发明涉及一种菌株，特别涉及一种用于发酵饲料的毕赤酵母菌。背景技术 0002 酵母菌是人类利用最早、利用数量最大的一种单细胞微生物，是理想的营养源和食品原料，也是优质蛋白饲料源。酵母菌属于真核微生物，不是人和动物肠道的固有菌，但可以产生多种消化酶类，可以在消化。

5、道内代谢。作为益生菌使用的酵母则是以活细胞的形式，通常为酵母培养物。在饲料工业应用中，目前使用的菌种主要是芽孢杆菌和乳酸菌及其混合物。但存在抗生素的使用受到限制的问题，酵母菌既不会干扰抗生素的作用，又可以增加饲料的稳定性，作为消化剂还有助于提高营养物质的利用，因此酵母菌在饲料工业中有很高的应用价值。发明内容 0003 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一株用于发酵饲料的毕赤酵母菌。该毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003，已于 2012 年 12 月 3 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京。

6、市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为： CGMCC No.6930，它可以用在发酵饲料以及微生态制剂，是一种极具应用价值的益生菌。本发明通过试验表明：毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003可产生多种代谢产物，发酵液具有浓郁的苹果香气，从而增加发酵饲料的适口性，提高采食量，其中含多种代谢产物可以促进猪的消化，提高饲料利用率，促进猪的快速生长。 0004 本发明的优势是：毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 有很强的耐酸性，可以在pH值为2的条件下缓慢生长；可以产生高含量的乙酸乙酯，。

7、具有独特的苹果香气，用在发酵饲料中可以增加适口性，提高采食量；用于发酵饲料中使发酵饲料的蛋白含量及水解酶类大大增加，促进动物消化吸收，提高饲料利用率，促进动物生长。附图说明 0005 本发明有如下附图： 0006 图 1 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 菌落形态照片； 0007 图 2 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 显微镜下形态图； 0008 图 3 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 生长曲线图； 0009 图 4 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd。

8、-pj-003 26SrDNA D1/D2 区域序列通过 BLAST 对比构建的系统进化树； 0010 图 5 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 26SrDNA D1/D2 区域电泳图。具体实施方式 0011 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。说明书 CN 103045493 A 3 2/7 页 4 0012 实施例 1 0013 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 的获得及其培养条件检测 0014 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 的筛选与鉴定 0015 1）毕赤酵母。

9、（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 的筛选 0016 从山东平度南村镇农户家堆积的陈年花生壳中，选取表面有些发酵迹象的作为样本，无菌水浸泡，采用梯度稀释涂平板的分离法，将花生壳溶液梯度稀释 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5后，各吸取 0.1mL 涂于 PDA 培养基上对菌株进行分离， 28恒温培养箱中培养 2-3 d，挑取 PDA 培养基上菌落形态为乳白色、光滑、菌落直径为 3 5mm 左右的单菌落反复进行划线分离直至纯化，如图 1 所示。 0017 所述的 PDA 培养基配方如下：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂。

10、 15 20g，水 1000mL。将 200g 马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入 20g 葡萄糖，加入琼脂 15 20g，加水至 1000mL， 121灭菌 20min。 0018 2）菌种的鉴定 0019 菌株纯化后 PDA 培养基平板上菌落形态为乳白色、光滑、单菌落直径为 3 5mm 左右的初筛菌株进行鉴定。 0020 菌株细胞为真核细胞，单个菌体呈椭球状，从显微镜下清晰可见细胞核和液泡，有的处于分裂期细胞有两个细胞核，有的能看到出芽生殖，如图 2 所示。 0021 培养特征 0022 固体培养特征：菌株在28培养条件下连续培养2 d，在P。

11、DA固体培养基表面形成直径 3-5mm 左右的光滑乳白色菌落。 0023 所述的 PDA 固体培养基配方如下：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 15 20g，水 1000mL。 0024 将 200g 马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入 20g 葡萄糖，加入琼脂 15-20g，加水至 1000mL， 121灭菌 20min。 0025 液体培养特征：从 PDA 培养基上挑取单菌落于澄清的 YPD 液体培养基中， 30、 220r/min 振荡培养。菌株在液体培养基中生长后期出现培养基浑浊现象。 0026 所述的 YPD 培养基配方如下 : 酵母膏 5g/。

12、L，蛋白胨 10.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，丙酸钠 2.5g/L， pH 6.8。115灭菌 30min。 0027 毕赤酵母菌Hzd-pj-003的26SrDNA D1/D2区域序列如SEQ ID No.1所示。将所测 26SrDNA D1/D2 区域序列通过 BLAST 对比，通过 Mega 软件构建系统进化树如图 4 所示，鉴定其与毕赤酵母菌同源性最接近，因此认定此酵母菌为毕赤酵母菌。 0028 根据图 3 可看出，毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 在 6h 后开始进入对数生长期， 6-24h 为对数生长期， 24-48h 为稳定期。48h 后为衰败期。24。

13、h 时活菌数为 4.6109个 /ml。 0029 代谢产物分析 0030 酵母菌 Hzd-pj-003 在发酵培养基中培养 24h 后，测定各种风味物质含量，结果如表1。试验结果表明风味物质中乙酸乙酯、异戊醇的含量较高，毕赤酵母菌Hzd-pj-003在发酵后能产生独特的苹果香气，有利于提高畜禽的采食量。 0031 表 1 毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵风味物质含量分析说明书 CN 103045493 A 4 3/7 页 5 0032 0033 实施例 2 0034 酵母菌 Hzd-pj-003 的耐酸试验 0035 毕赤酵母菌菌液的制备：将保藏菌种接种于装有。

14、 70 80mL 固体斜面 PDA 培养基的 250mL 茄子瓶中， 30恒温培养箱中培养 3d ；将茄子瓶中的长好的菌用无菌水冲下，并反复吹吸使菌和无菌水混合均匀制得菌悬液，按 3% 的接种量接入装有 300mL YPD 培养基的 500mL 三角瓶种， 30恒温摇床培养 24h，转速 220rpm ；按 3% 接种量接入装有 300mL 发酵培养基的 500mL 三角瓶中， 30恒温摇床培养 24h，转速 220rpm ；每隔 4h 测定发酵培养基的 OD660值，结果如表 2 所示。试验结果表明酵母菌 Hzd-pj-003 在 pH 值为 2 的时候仍能缓慢生长，。

15、具有很强的耐酸性，因此能较好的适应发酵产酸后的环境。 0036 所述的PDA培养基配方如下:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂1520g，水1000mL。 0037 将 200g 马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入 20g 葡萄糖，加入琼脂 15 20g，加水至 1000mL， 121灭菌 20min。 0038 所述的 YPD 培养基配方如下 : 酵母膏 5g/L，蛋白胨 10.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，丙酸钠 2.5g/L， pH 6.8。115灭菌 30min。 0039 所述的发酵培养基：葡萄糖6，玉米浆1%，酵母粉0.25%，大豆。

16、蛋白胨0.5%， KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.1%， pH 6.0 6.2， 121灭菌 20min 0040 表 2 毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 耐酸性实验 0041 说明书 CN 103045493 A 5 4/7 页 6 0042 实施例 3 0043 毕赤酵母（Pichia jadinii） Hzd-pj-003 应用于发酵饲料 0044 从斜面培养基上挑取单菌落于装有 300ml 种子培养基的 500ml 三角瓶中， 30、 220r/min 振荡培养，当液体种子培养基中的 OD660值达到 1.4 时，无菌条件下按 3% 5% 的接种量接入装有 30。

17、0ml 发酵培养基的 500ml 三角瓶中， 30、 220r/min 振荡培养 24h，即制备完成枯草芽孢杆菌 Hzd-bs-001 发酵液。 0045 所述的种子培养基（YPD 培养基）配方如下 : 酵母膏 5g/L，蛋白胨 10.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，丙酸钠 2.5g/L， pH 6.8。115灭菌 30min。 0046 所述的发酵培养基配方如下：葡萄糖 6，玉米浆 1%，酵母粉 0.25%，大豆蛋白胨 0.5%， KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.1%， pH 6.0-6.2， 121 灭菌 20min。 0047 发酵饲料原料配比（1。

18、kg）：花生壳粉 0.351 份，次粉 0.032 份，麸皮 0.02 份，虫沙 0.054 份，啤酒糟 0.5 份，预混料 0.02 份，菌液 0.023 份。 0048 所述预混料的组成和配比如下：石粉 452 份；沸石粉 330 份；复合多维 24 份；磷酸氢钙 50 份；喷浆玉米皮 50 份；食盐 90 份；香味剂 2 份；甜味剂 2 份。 0049 所述的所述的复合多维的配比如下： 0050 维生素 A 20000IU/kg 维生素 D3 10000IU/kg 0051 维生素 E 110mg/kg 维生素 K3 10mg/kg 0。

19、052 维生素 B1 8mg/kg 维生素 B2 12mg/kg 0053 维生素 B6 7mg/kg 维生素 B12 0.2mg/kg 说明书 CN 103045493 A 6 5/7 页 7 0054 生物素 25mg/kg 烟酸 120mg/kg 0055 泛酸钙 60mg/kg 叶酸 6mg/kg 0056 铜 3g/kg 铁 3.5g/kg 锰 2g/kg 0057 锌 3g/kg 碘 9mg/kg 余量为啤酒酵母粉； 0058 对照组（CK）加入 50ml 无菌水，试验组加入 50ml 酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液，混合均匀后放入自封袋中，扎紧，放入 3。

20、0 摄氏度保温箱， 5d 后检测蛋白含量和水解酶类的含量变化。 0059 测定结果： 0060 表 3 蛋白含量变化 0061 0062 表 4 水解酶类变化 0063 0064 试验表明，发酵饲料中加入酵母菌 Hzd-pj-003，使发酵饲料中的水解蛋白酶和淀粉酶的活性大大提高，水溶性蛋白含量显著提高。 0065 测定方法 0066 蛋白质含量测定 0067 将烘干样品粉碎过筛，称取 0.5000g 于小三角瓶中，加蒸馏水 10mL，在水浴锅中加热至微沸，维持15min，加饱和CaCl2 1mL， 100 g/L KH2PO4 2 mL，待出现白色絮凝物后，充分。

21、摇匀过滤，再用10mL蒸馏水洗涤滤纸上的样品，直至洗出液无NH4+(用钠氏试剂检验)，将滤纸连同滤物放入消煮管中， 100烘干后各加入 8mL 浓硫酸，以小漏斗盖住消煮管口， 120 碳化12h后，用浓硫酸-过氧化氢法消煮后，定容至100mL，选择适宜的稀释倍数采用靛酚蓝比色法测定样品中 NH4-N 含量，再乘以系数 6.25 换算为纯蛋白质含量。 0068 活性肽含量测定 0069 采用考马斯亮蓝比色法测定样品中活性肽含量。 0070 水溶性蛋白质含量测定 0071 称样品 0.500g 于小三角瓶中，加蒸馏水 10mL，加盖小漏斗后在水浴锅上沸浴，维持 15 m。

22、in，充分摇匀后过滤，将滤液稀释适宜倍数后，采用考马斯亮蓝比色法测定其水溶性蛋白的含量。 0072 蛋白酶活力测定 0073 称烘干样品 1.000g 于三角瓶中，加 pH 7.2 磷酸缓冲液 20mL， 40水浴保温 60 说明书 CN 103045493 A 7 6/7 页 8 min，过滤后选择适宜的稀释倍数采用福林法测定蛋白酶的活性。将 1g 酶粉在 40下每 1 min 水解干酪素产生 1 g 酪氨酸的酶活定义为 1U。 0074 纤维素酶活力测定 0075 称烘干样品0.500g于三角瓶中，加蒸馏水20 mL， 40水浴保温45 min，过滤后选择合适的稀释倍。

23、数用羧甲基纤维素纳（CMC）做底物，用 DNS（3,5- 二硝基水杨酸）法测定还原糖含量，计算纤维素酶活力。将在pH 5.0， 40下，每1g纤维素酶曲在1 min内水解CMC，生成 1 g 葡萄糖的酶活性定义为 1U。 0076 淀粉酶活力测定 0077 用 0.1M 醋酸缓冲溶液（pH 5.0）配制 1.0%（w/v）可溶性淀粉溶液作为淀粉酶活力测定的反应底物。 0.5ml粗酶液与4.5ml底物混合均匀， 50水浴保温30min后放入沸水浴中终止反应，反应时间 5min。将粗酶液置于沸水浴中灭活 5min 作为对照组。释放出的还原糖用 Nelson-Somo。

24、gyi 法测定。在该测试条件下，每分钟水解可溶性淀粉释放出相当于 1.0M 葡萄糖含量时所需的酶量为 1 个酶活力单位（U/mg）。 0078 实施例 4 0079 从斜面培养基上挑取单菌落于装有 300ml 的实施例 1 中的种子培养基的三角瓶中， 30、 220r/min 振荡培养。当液体种子培养基中的 OD660值达到 1.4 时，在无菌条件下，按 3% 的量接种于实施例 1 中的液体发酵培养基中。30、 220r/min 振荡培养 24h 后进行应用试验。 0080 毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液在育肥猪中的应用试验 0081 试验时间： 2011 年 8 月。

25、 1 日至 2011 年 11 月 1 日，共计 90 天。 0082 试验猪的来源和分组：青岛双河生猪专业合作社 0083 地址：即墨市龙泉镇东河北村 0084 对照组采用市场上购买的全价饲料，试验组为相同的全价配合饲料加入一定量的毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液。 0085 试验结果： 0086 表 5 ：毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液在育肥猪中的应用试验 0087 0088 采用自动饮食机供食物。试验组共计用全价配合饲料 1540kg，料肉比为： 2.6:1，毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液共计 8100ml。对照组共计用 1500kg 。

26、全价饲料，料肉比为： 2.8:1。由此可见，通过配合毕赤酵母菌 Hzd-pj-003 发酵液的使用，刺激了猪的味蕾，增大说明书 CN 103045493 A 8 7/7 页 9 采食量，加速生长，同时降低了料肉比，减小了养殖成本。说明书 CN 103045493 A 9 1/1 页 10 序列表序列表 CN 103045493 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说明书附图 CN 103045493 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说明书附图 CN 103045493 A 12 3/3 页 13 图 5 说明书附图 CN 103045493 A 13 。

摘要
申请专利号：	CN201210594653.8	申请日：	2012.12.31
公开号：	CN103045493A	公开日：	2013.04.17
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 1/16申请公布日:20130417\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/16; A23K1/00; C12R1/84(2006.01)N	主分类号：	C12N1/16
申请人：	青岛海中大生物科技发展有限公司
发明人：	栾锦涛; 陈继伟; 黄玲玲; 张盼盼
地址：	266000 山东省青岛市平度市南村镇东北街村
优先权：
专利代理机构：	北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246	代理人：	龚燮英
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内容摘要

本发明涉及一种毕赤酵母菌（Pichia jadinii）Hzd-pj-003，已于2012年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.6930，它可以用在发酵饲料以及微生态制剂，是一种极具应用价值的益生菌。本发明的优势是：毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd-pj-003有很强的耐酸性，可以在pH值为2的条件下缓慢生长；可以产生高含量的乙酸乙酯，具有独特的苹果香气，用在发酵饲料中可以增加适口性，提高采食量；用于发酵饲料中使发酵饲料的蛋白含量及水解酶类大大增加，促进动物消化吸收，提高饲料利用率，促进动物生长。

权利要求书

权利要求书一种毕赤酵母（Pichia jadinii），其特征在于所述毕赤酵母（Pichia jadinii）为毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003，保藏号为：CGMCC No.6930。
根据权利要求1所述的毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003在发酵饲料中的应用。

说明书

说明书一种毕赤酵母菌及其在饲料发酵中的应用
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别涉及一种用于发酵饲料的毕赤酵母菌。
背景技术
酵母菌是人类利用最早、利用数量最大的一种单细胞微生物，是理想的营养源和食品原料，也是优质蛋白饲料源。酵母菌属于真核微生物，不是人和动物肠道的固有菌，但可以产生多种消化酶类，可以在消化道内代谢。作为益生菌使用的酵母则是以活细胞的形式，通常为酵母培养物。在饲料工业应用中，目前使用的菌种主要是芽孢杆菌和乳酸菌及其混合物。但存在抗生素的使用受到限制的问题，酵母菌既不会干扰抗生素的作用，又可以增加饲料的稳定性，作为消化剂还有助于提高营养物质的利用，因此酵母菌在饲料工业中有很高的应用价值。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一株用于发酵饲料的毕赤酵母菌。该毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003，已于2012年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No.6930，它可以用在发酵饲料以及微生态制剂，是一种极具应用价值的益生菌。本发明通过试验表明：毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003可产生多种代谢产物，发酵液具有浓郁的苹果香气，从而增加发酵饲料的适口性，提高采食量，其中含多种代谢产物可以促进猪的消化，提高饲料利用率，促进猪的快速生长。
本发明的优势是：毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003有很强的耐酸性，可以在pH值为2的条件下缓慢生长；可以产生高含量的乙酸乙酯，具有独特的苹果香气，用在发酵饲料中可以增加适口性，提高采食量；用于发酵饲料中使发酵饲料的蛋白含量及水解酶类大大增加，促进动物消化吸收，提高饲料利用率，促进动物生长。
附图说明
本发明有如下附图：
图1　毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003菌落形态照片；
图2  毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003显微镜下形态图；
图3  毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003生长曲线图；
图4  毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003 26SrDNA D1/D2区域序列通过BLAST对比构建的系统进化树；
图5  毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003 26SrDNA D1/D2区域电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003的获得及其培养条件检测
毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003的筛选与鉴定
1）毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003的筛选
从山东平度南村镇农户家堆积的陈年花生壳中，选取表面有些发酵迹象的作为样本，无菌水浸泡，采用梯度稀释涂平板的分离法，将花生壳溶液梯度稀释10‑1、10‑2、10‑3、10‑4、10‑5后，各吸取0.1mL涂于PDA培养基上对菌株进行分离，28℃恒温培养箱中培养2‑3 d，挑取PDA培养基上菌落形态为乳白色、光滑、菌落直径为3～5mm左右的单菌落反复进行划线分离直至纯化，如图1所示。
所述的PDA培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入20g葡萄糖，加入琼脂15～20g，加水至1000mL，121℃灭菌20min。
2）菌种的鉴定
菌株纯化后PDA培养基平板上菌落形态为乳白色、光滑、单菌落直径为3～5mm左右的初筛菌株进行鉴定。
菌株细胞为真核细胞，单个菌体呈椭球状，从显微镜下清晰可见细胞核和液泡，有的处于分裂期细胞有两个细胞核，有的能看到出芽生殖，如图2所示。
培养特征
固体培养特征：菌株在28℃培养条件下连续培养2 d，在PDA固体培养基表面形成直径3‑5mm左右的光滑乳白色菌落。
所述的PDA固体培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。
将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入20g葡萄糖，加入琼脂15‑20g，加水至1000mL，121℃灭菌20min。
液体培养特征：从PDA培养基上挑取单菌落于澄清的YPD液体培养基中，30℃、220r/min振荡培养。菌株在液体培养基中生长后期出现培养基浑浊现象。
所述的YPD培养基配方如下: 酵母膏5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，丙酸钠2.5g/L，pH 6.8。115℃灭菌30min。
毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003的26SrDNA D1/D2区域序列如SEQ  ID  No.1所示。将所测26SrDNA D1/D2区域序列通过BLAST对比，通过Mega软件构建系统进化树如图4所示，鉴定其与毕赤酵母菌同源性最接近，因此认定此酵母菌为毕赤酵母菌。
根据图3可看出，毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003在6h后开始进入对数生长期，6‑24h为对数生长期，24‑48h为稳定期。48h后为衰败期。24h时活菌数为4.6×109个/ml。
代谢产物分析
酵母菌Hzd‑pj‑003在发酵培养基中培养24h后，测定各种风味物质含量，结果如表1。试验结果表明风味物质中乙酸乙酯、异戊醇的含量较高，毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003在发酵后能产生独特的苹果香气，有利于提高畜禽的采食量。
表1毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵风味物质含量分析

实施例2
酵母菌Hzd‑pj‑003的耐酸试验
毕赤酵母菌菌液的制备：将保藏菌种接种于装有70～80mL固体斜面PDA培养基的250mL茄子瓶中，30℃恒温培养箱中培养3d；将茄子瓶中的长好的菌用无菌水冲下，并反复吹吸使菌和无菌水混合均匀制得菌悬液，按3%的接种量接入装有300mL YPD培养基的500mL三角瓶种，30℃恒温摇床培养24h，转速220rpm；按3%接种量接入装有300mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃恒温摇床培养24h，转速220rpm；每隔4h测定发酵培养基的OD660值，结果如表2所示。试验结果表明酵母菌Hzd‑pj‑003在pH值为2的时候仍能缓慢生长，具有很强的耐酸性，因此能较好的适应发酵产酸后的环境。
所述的PDA培养基配方如下:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。
将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤得到马铃薯汁，加入20g葡萄糖，加入琼脂15～20g，加水至1000mL，121℃灭菌20min。
所述的YPD培养基配方如下: 酵母膏5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，丙酸钠2.5g/L，pH 6.8。115℃灭菌30min。
所述的发酵培养基：葡萄糖6％，玉米浆1%，酵母粉0.25%，大豆蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，pH 6.0～6.2，121℃灭菌20min
表2毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003耐酸性实验

实施例3
毕赤酵母（Pichia jadinii）Hzd‑pj‑003应用于发酵饲料
从斜面培养基上挑取单菌落于装有300ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养，当液体种子培养基中的OD660值达到1.4时，无菌条件下按3%～5%的接种量接入装有300ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养24h，即制备完成枯草芽孢杆菌Hzd‑bs‑001发酵液。
所述的种子培养基（YPD培养基）配方如下: 酵母膏5g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，丙酸钠2.5g/L，pH 6.8。115℃灭菌30min。
所述的发酵培养基配方如下：葡萄糖6％，玉米浆1%，酵母粉0.25%，大豆蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，pH 6.0‑6.2，121 ℃灭菌20min。
发酵饲料原料配比（1kg）：花生壳粉0.351份，次粉0.032份，麸皮0.02份，虫沙0.054份，啤酒糟0.5份，预混料0.02份，菌液0.023份。
所述预混料的组成和配比如下：石粉452份；沸石粉330份；复合多维24份；磷酸氢钙50份；喷浆玉米皮50份；食盐90份；香味剂2份；甜味剂2份。
所述的所述的复合多维的配比如下：
维生素A  20000IU/kg  维生素D3  10000IU/kg
维生素E  110mg/kg    维生素K3  10mg/kg
维生素B1  8mg/kg     维生素B2   12mg/kg
维生素B6  7mg/kg     维生素B12   0.2mg/kg
生物素    25mg/kg    烟酸        120mg/kg
泛酸钙    60mg/kg    叶酸        6mg/kg
铜  3g/kg    铁   3.5g/kg   锰   2g/kg
锌  3g/kg 碘  9mg/kg   余量为啤酒酵母粉；
对照组（CK）加入50ml无菌水，试验组加入50ml酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液，混合均匀后放入自封袋中，扎紧，放入30摄氏度保温箱，5d后检测蛋白含量和水解酶类的含量变化。
测定结果：
表3 蛋白含量变化

表4 水解酶类变化

试验表明，发酵饲料中加入酵母菌Hzd‑pj‑003，使发酵饲料中的水解蛋白酶和淀粉酶的活性大大提高，水溶性蛋白含量显著提高。
测定方法
蛋白质含量测定
将烘干样品粉碎过筛，称取0.5000g于小三角瓶中，加蒸馏水10mL，在水浴锅中加热至微沸，维持15min，加饱和CaCl2 1mL，100 g/L  KH2PO4 2 mL，待出现白色絮凝物后，充分摇匀过滤，再用10mL蒸馏水洗涤滤纸上的样品，直至洗出液无NH4+(用钠氏试剂检验)，将滤纸连同滤物放入消煮管中，100℃烘干后各加入8mL浓硫酸，以小漏斗盖住消煮管口，120℃碳化12h后，用浓硫酸‑过氧化氢法消煮后，定容至100mL，选择适宜的稀释倍数采用靛酚蓝比色法测定样品中NH4‑N含量，再乘以系数6.25换算为纯蛋白质含量。
活性肽含量测定
采用考马斯亮蓝比色法测定样品中活性肽含量。
水溶性蛋白质含量测定
称样品0.500g于小三角瓶中，加蒸馏水10mL，加盖小漏斗后在水浴锅上沸浴，维持15 min，充分摇匀后过滤，将滤液稀释适宜倍数后，采用考马斯亮蓝比色法测定其水溶性蛋白的含量。
蛋白酶活力测定
称烘干样品1.000g于三角瓶中，加pH 7.2磷酸缓冲液20mL，40℃水浴保温60 min，过滤后选择适宜的稀释倍数采用福林法测定蛋白酶的活性。将1g酶粉在40℃下每1 min水解干酪素产生1 µg酪氨酸的酶活定义为1U。
纤维素酶活力测定
称烘干样品0.500g于三角瓶中，加蒸馏水20 mL，40℃水浴保温45 min，过滤后选择合适的稀释倍数用羧甲基纤维素纳（CMC）做底物，用DNS（3,5‑二硝基水杨酸）法测定还原糖含量，计算纤维素酶活力。将在pH 5.0，40℃下，每1g纤维素酶曲在1 min内水解CMC，生成1 µg葡萄糖的酶活性定义为1U。
淀粉酶活力测定
用0.1M醋酸缓冲溶液（pH 5.0）配制1.0%（w/v）可溶性淀粉溶液作为淀粉酶活力测定的反应底物。0.5ml粗酶液与4.5ml底物混合均匀，50℃水浴保温30min后放入沸水浴中终止反应，反应时间5min。将粗酶液置于沸水浴中灭活5min作为对照组。释放出的还原糖用Nelson‑Somogyi法测定。在该测试条件下，每分钟水解可溶性淀粉释放出相当于1.0M葡萄糖含量时所需的酶量为1个酶活力单位（U/mg）。
实施例4
从斜面培养基上挑取单菌落于装有300ml的实施例1中的种子培养基的三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养。当液体种子培养基中的OD660值达到1.4时，在无菌条件下，按3%的量接种于实施例1中的液体发酵培养基中。30℃、220r/min振荡培养24h后进行应用试验。
毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液在育肥猪中的应用试验
试验时间：2011年8月1日至2011年11月1日，共计90天。
试验猪的来源和分组：青岛双河生猪专业合作社
地址：即墨市龙泉镇东河北村
对照组采用市场上购买的全价饲料，试验组为相同的全价配合饲料加入一定量的毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液。
试验结果：
表5：毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液在育肥猪中的应用试验

采用自动饮食机供食物。试验组共计用全价配合饲料1540kg，料肉比为：2.6:1，毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液共计8100ml。对照组共计用1500kg全价饲料，料肉比为：2.8:1。由此可见，通过配合毕赤酵母菌Hzd‑pj‑003发酵液的使用，刺激了猪的味蕾，增大采食量，加速生长，同时降低了料肉比，减小了养殖成本。