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1、(10)申请公布号 CN 103044503 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103044503 A *CN103044503A* (21)申请号 201210569941.8 (22)申请日 2012.12.24 C07H 17/04(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人 颜继忠 楚楚 李行诺 童胜强 陈岑 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红梅 (54) 发明名称 一种快速高效提取芍药苷和芍药内酯苷的方 。
2、法 (57) 摘要 本发明提供了一种芍药苷和芍药内酯苷的高 效同时制备方法， 其特征在于该方法为 ： 以含有 芍药苷和芍药内酯苷的药材为原料， 采用醇水混 合溶剂进行提取， 提取液浓缩 ； 所得提取液用大 孔树脂柱富集， 以乙醇水混合溶剂进行洗脱， 收 集乙醇水洗脱液， 浓缩 ； 大孔树脂富集液采用高 速逆流色谱进行分离纯化， 分别收集含有芍药苷 或芍药内酯苷的流分， 浓缩， 干燥， 即可获得纯度 89%-98% 的芍药苷和芍药内酯苷。本发明工艺简 单、 纯化效率高、 制备周期短， 可在同一工艺流程 中低成本、 低能耗得到高纯度的芍药苷和芍药内 酯苷， 所用溶剂毒性低、 环保， 制备效率高。 。
3、(51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种快速高效提取芍药苷和芍药内酯苷的方法， 所述方法如下 ： （1） 选取含芍药苷和芍药内酯苷的植物原料， 以2070%乙醇溶液提取13次， 提取液合 并， 浓缩， 干燥， 得粗提物 ； （2） 步骤 （1） 粗提物上大孔吸附树脂， 上样结束后先以清水清洗除杂， 再以 10%40% 乙 醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩， 干燥， 得大孔树脂富集物 ； 所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性 大孔吸附树脂 。
4、； （3） 步骤 （2） 大孔树脂富集物采用高速逆流色谱， 以正丁醇 - 乙酸乙酯 - 水为溶剂体系 进行分离， 分别收集含有芍药苷或芍药内酯苷的流份， 浓缩， 干燥， 即得芍药苷和芍药内酯 苷成品 ； 所述溶剂体系中正丁醇 ： 乙酸乙酯 ： 水的体积比为 14 ： 14 ： 5。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述植物原料为白芍、 赤芍或牡丹的根。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （1） 所述提取为回流提取、 超声提取、 索 氏提取或微波辅助提取。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述大孔吸附树脂为下列之一 ： D101、 AB-8、 DM1。
5、30、 HPD-450、 HPD-620、 HPD-750、 HPD-826、 ADS-17、 ADS-7-2。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述大孔吸附树脂为 D101 或 AB-8。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于步骤 （3） 所述溶剂体系中正丁醇 ： 乙酸乙酯 ： 水的体积比为 4 ： 1 ： 5 或 2 ： 3 ： 5。 权 利 要 求 书 CN 103044503 A 2 1/6 页 3 一种快速高效提取芍药苷和芍药内酯苷的方法 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一种快速高效提取芍药苷和芍药内酯苷的方法。 （二） 背景技术 0002 芍药的有效成。
6、分为芍药总苷， 包括芍药苷、 芍药内酯苷、 苯甲酰芍药苷、 氧化芍药 苷的三十多种单萜苷类。 随着对中药的研究深入， 也越来越注重中药中有效成分、 有效部位 的提取分离纯化。其中， 芍药苷作为芍药中的主要成分之一， 其在药材中含量高， 纯品较易 获得， 一直以来作为芍药及相关制品的质量控制指标， 其研究报道相对较多。 0003 近年来， 研究表明， 芍药内酯苷作为芍药中的另一种有效成分， 具有镇痛、 镇静、 抗 惊厥、 抗炎、 抗病原微生物等多种药理作用， 在临床上被用于抗癫痫、 镇痛、 治疗类风湿性关 节炎等， 因而， 对芍药内酯苷的研究日益增多， 其高纯度单体的制备需求日益增大。 0004。
7、 目 前， 对 芍 药 内 酯 苷 和 芍 药 苷 的 制 备 已 有 很 多 报 道， 例 如 ： 申 请 号 为 201110410067.9 的发明申请专利公开了 “一种芍药苷和白芍苷的制备方法” ： 以牡丹科植 物为原料提取后， 以大孔树脂对粗提液进行吸附， 以 3075% 乙醇水洗脱液浓缩干燥后得精 制提取物， 再以加压色谱柱对其进行分离纯化， 可获得纯度大于 90% 的芍药苷和白芍苷成 品。 申请号为201010249421.X的发明专利公开了 “一种同时制备芍药内酯苷和芍药苷的方 法” ， 即以芍药药材或提取物为原料， 采用柱层析方法进行芍药苷和芍药内酯苷的纯化， 优 选后的方法。
8、制备芍药苷和芍药内酯苷的纯度可达 91%97%。申请号为 200910100680.3 的 发明专利申请公开了 “一种模拟移动床色谱法分离制备芍药内酯苷的方法” ， 即采用白芍 总苷提取物为原料， 应用模拟移动床色谱法分离制备芍药内酯苷， 模拟移动床的固定相采 用 C18 硅胶， 流动相采用甲醇或乙腈与水、 甲酸、 异丙醇的混合溶液， 最终可制备纯度达 90% 以上的芍药内酯苷， 再如申请号为 02133298.3 的发明专利公开了一种 “芍药苷和芍药内 酯苷的组合物及其制备方法” ： 以芍药为原料， 通过吸附树脂精制、 氧化铝柱层析和硅胶柱 层析值得芍药苷和芍药内酯苷的组合物， 其中芍药苷和。
9、芍药内酯苷在该组合物中的比例为 7:39:1。 0005 通过长期研究， 对白芍总苷的提取纯化工艺已较为成熟， 但对芍药苷和芍药内酯 苷单体的制备报道较少。文献中有以反相硅胶模拟移动床色谱、 硅胶柱层析及加压柱层析 对二者进行分离制备， 但均存在制备工艺流程复杂， 柱效低、 制备周期长、 检测操作复杂等 各种弊端， 均难以实现工业化生产。 0006 迄今为止， 尚未有一种适合工业化大生产同时快速高效制备高纯度芍药苷和芍药 内酯苷的工艺路线报道。 （三） 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种纯度大于 89%、 易于实现产业化的芍药苷和芍药内酯苷 的提取工艺。 0008 本发明采用的技术方案。
10、是 ： 说 明 书 CN 103044503 A 3 2/6 页 4 0009 一种快速高效提取芍药苷和芍药内酯苷的方法， 所述方法如下 ： 0010 （1） 选取含芍药苷和芍药内酯苷的植物原料， 以 2070%（v/v） 乙醇溶液提取 13 次， 提取液合并， 浓缩， 干燥， 得粗提物 ； 0011 （2）步骤 （1）粗提物上大孔吸附树脂， 上样结束后先以清水清洗除杂， 再以 10%40%（v/v） 乙醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩， 干燥， 得大孔树脂富集物 ； 所述大孔吸附树脂为 常规非极性或弱极性大孔吸附树脂 ； 0012 （3） 步骤 （2） 大孔树脂富集物采用高速逆流色谱， 以正丁醇 -。
11、 乙酸乙酯 - 水为溶剂 体系进行分离， 分别收集含有芍药苷或芍药内酯苷的流份， 浓缩， 干燥， 分别得到芍药苷成 品和芍药内酯苷成品， 所得成品中芍药苷或芍药内酯苷纯度为 89%98%） ； 所述溶剂体系中 正丁醇 ： 乙酸乙酯 ： 水的体积比为 14 ： 14 ： 5。 0013 所述植物原料为白芍、 赤芍或牡丹的根， 以粉末形式进行提取为好。 0014 步骤 （1） 所述提取为回流提取、 超声提取、 索氏提取或微波辅助提取， 优选为超声 提取。 0015 所述大孔吸附树脂优选为下列之一 ： D101、 AB-8、 DM130、 HPD-450、 HPD-620、 HPD-750、 HPD。
12、-826、 ADS-17、 ADS-7-2， 更优选为 D101 或 AB-8。 0016 步骤 （3） 所述溶剂体系中正丁醇 ： 乙酸乙酯 ： 水的体积比优选为 4 ： 1 ： 5 或 2 ： 3 ： 5。 0017 本发明方法可同时制备芍药苷和芍药内酯苷， 制备工艺简单， 为工业生产放大提 供参考依据。 0018 本发明的有益效果主要体现咋 ： 0019 1. 应用本发明方法， 可以在同一工艺流程中， 制备得到芍药苷和芍药内酯苷， 充分 利用药材资源 ； 0020 2. 应用本发明方法， 可以在同一工艺流程中获得芍药苷和芍药内酯苷的富集物， 有效地简化了后续纯化工艺负担 ； 0021 3.。
13、 应用本发明方法， 创新性地以高速逆流色谱分离芍药苷和芍药内酯苷的富集 物， 实现了单体纯化工艺的自动化和可操作性， 可一次性获得纯度大于 89% 的单体成品 ； 0022 4. 本发明制备工艺方法简单， 精制效率高， 耗能低， 环保， 操作工艺条件易于控制。 （四） 附图说明 0023 图 1 为实施例 4 的高速逆流色谱图 ； 峰 1 为芍药内酯苷， 峰 2 为芍药苷 ； 0024 图 2 为实施例 4 的芍药苷纯度图 ； 0025 图 3 为实施例 4 的芍药内酯苷纯度图 ； 0026 图 4 为实施例 9 方法 1 的高速逆流色谱图 ； 峰 1 为芍药内酯苷， 峰 2 为芍药苷。 （五。
14、） 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0028 实施例 1 ： 大孔树脂静态吸附性能考察 0029 称取 200g 白芍药材 （根部） 粉末， 用 2L 50% 乙醇循环超声提取 2 次， 每次 0.5h， 所用仪器为 “弘祥隆” CTXNW-2B 超声循环提取机， 超声频率 59kHz， 横波间隙 3 秒， 搅拌速度 说 明 书 CN 103044503 A 4 3/6 页 5 950rpm。提取液滤过， 合并滤液， 减压浓缩至无醇味， 冻干， 备用。 0030 称取各型号分别精密称取已处理好 （将实验的 9 种大孔吸附。
15、树脂分别置于三角瓶 中， 以无水乙醇浸泡 3 次， 每次 24h， 除去浸液上层漂浮的杂质后， 用蒸馏水冲洗至无醇味， 湿态保存备用。 ） 的 8 种型号大孔吸附树脂各 1g， 置 100ml 锥形瓶中。精密称取粗提物粉末 各0.3g， 分别用30ml去离子水溶解， 加入锥形瓶中， 放入恒温摇床振摇24h， 温度20， 转速 200rpm。将吸附后的白芍提取液真空抽滤， 滤液适当稀释， 用 HPLC 法测定芍药苷和芍药内 酯苷的含量， 并计算各型号大孔吸附树脂的比吸附量。吸附好的树脂用水洗 3 次， 真空干燥 后， 加入 10 ml 95% 乙醇， 放入恒温摇床振摇 24h， 温度 20， 转。
16、速 200rpm， 进行解吸附。解 吸液经适当稀释后用 HPLC 法测定芍药苷和芍药内酯苷的含量， 并计算各型号大孔吸附树 脂的解吸率。公式为 0031 0032 Qe表示比吸附量， 代表1克干树脂在达到吸附平衡时吸附的被吸附物质量， C0和Ce 各自表示最初和达到吸附平衡时的芍药内酯苷或芍药苷浓度， V0是最初加到锥形瓶中的体 积 ； W 是干树脂的质量。 0033 本实验重复 3 次， 结果见表 1。 0034 表 1 ： 9 种大孔吸附树脂的静态吸附性能比较 0035 0036 结果表明 ： 九种树脂对芍药苷和芍药内酯苷均能吸附和解吸附， 但以 AB-8 和 D101 型树脂较好。 00。
17、37 实施例 2 ： 大孔树脂 AB-8 的洗脱 0038 称取 200 g 白芍根粉末， 用 30% 乙醇 2L 超声提取 2 次， 每次 30 分钟， 过滤， 合并滤 液， 旋转蒸发至无醇味， 冷冻干燥， 备用。称取 60ml AB-8 大孔树脂装入玻璃柱中， 柱体积 为 20 ml， 上样， 上样量为 12g， 吸附后， 先用水 160 ml 去除杂质， 再用 30% 乙醇 200 ml 洗脱 芍药苷和芍药内酯苷， 最后用 95% 乙醇再生树脂， 流速为 1ml/min。将 30% 乙醇部位浓缩蒸 说 明 书 CN 103044503 A 5 4/6 页 6 干， 得 2.67g 芍药苷。
18、和芍药内酯苷的富集物， 其中芍药苷纯度为 48.0%、 芍药内酯苷纯度为 11.8%。 0039 实施例 3 ： 大孔树脂 D101 的洗脱 0040 称取 200 g 白芍根粉末， 用 70% 乙醇 2L 超声提取 2 次， 每次 30 分钟， 过滤， 合并滤 液， 旋转蒸发至无醇味， 冷冻干燥， 备用。称取 60ml D101 大孔树脂装入玻璃柱中， 柱体积 为 20ml， 上样， 上样量为 12g， 吸附后， 先用水 160ml 去除杂质， 再用 30% 乙醇 200 ml 洗脱 芍药苷和芍药内酯苷， 最后用 95% 乙醇再生树脂， 流速为 1ml/min。将 30% 乙醇部位浓缩蒸 干。
19、， 得 2.51 g 芍药苷和芍药内酯苷的富集物， 其中芍药苷纯度为 52.6%、 芍药内酯苷纯度为 15.6%。 0041 实施例 4 ： 半制备型高速逆流制备芍药苷和芍药内酯苷 0042 取实施例 2 所得芍药苷和芍药内酯苷富集物 200 mg， 用溶剂体系正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 （4:1:5） 20ml 溶解。以溶剂体系的上相作为固定相， 下相作为流动相， 流动相流速 1.5 ml/min， 离心分离仪转速 950 r/min， 紫外检测器波长 254 nm， 恒温循环水箱 35。自 动收集器以 5 min 每管自动收集， 高速逆流色谱图见图 1。所获得芍药苷 （峰 2） 和芍药。
20、内酯 苷 （峰1） 流份， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到芍药苷72.4 mg、 芍药内酯苷 25.1 mg， 纯度分别为 97.5%（图 2） 、 92.1%（图 3） 。 0043 实施例 5 ： 制备性型高速逆流色谱分离纯化 0044 取实施例 2 所得芍药苷和芍药内酯苷富集物 200 mg， 用溶剂体系正丁醇 - 乙酸乙 酯-水 （4:1:5） 20ml溶解。 以溶剂体系的上相作为固定相， 下相作为流动相， 流动相流速5.0 ml/min， 离心分离仪转速 400 r/min， 紫外检测器波长 254 nm， 恒温循环水箱 35。所获得 芍药苷和芍药内酯苷流份， 减压浓缩， 冷冻干燥， 。
21、得到芍药苷 77.5mg、 芍药内酯苷 24.6mg， 纯度分别为 95.2%、 90.6%。 0045 实施例 6 ： 制备性型高速逆流色谱分离纯化 0046 取实施例 3 所得芍药苷和芍药内酯苷富集物 1.0 g， 用溶剂体系正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 （4:1:5） 20ml 溶解。以溶剂体系的上相作为固定相， 下相作为流动相， 流动相流速 7.0 ml/min， 离心分离仪转速400 r/min， 紫外检测器波长254 nm， 恒温循环水箱35。 所获 得芍药苷和芍药内酯苷流份， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到芍药苷360.2 mg、 芍药内酯苷148.0 mg， 纯度分别为 96.。
22、1%、 89.0%。 0047 实施例 7 ： 制备性型高速逆流色谱分离纯化 0048 取实施例 3 所得芍药苷和芍药内酯苷富集物 400 mg， 用溶剂体系正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 （4:1:5） 20ml 溶解。以溶剂体系的上相作为固定相， 下相作为流动相， 流动相流速 7.0 ml/min， 离心分离仪转速400 r/min， 紫外检测器波长254 nm， 恒温循环水箱35。 所获 得芍药苷和芍药内酯苷流份， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到芍药苷 141.6 mg、 芍药内酯苷 66.2 mg， 纯度分别为 96.4%、 90.9%。 0049 实施例 8 ： 制备性型高速逆流色谱分。
23、离纯化 0050 取实施例 3 所得芍药苷和芍药内酯苷富集物 1.0 g， 用溶剂体系正丁醇 - 乙酸乙 酯 - 水 （4:1:5） 20ml 溶解。以溶剂体系的上相作为固定相， 下相作为流动相， 流动相流速 5.0 ml/min， 离心分离仪转速400 r/min， 紫外检测器波长254 nm， 恒温循环水箱35。 所获 得芍药苷和芍药内酯苷流份， 减压浓缩， 冷冻干燥， 得到芍药苷383.2 mg、 芍药内酯苷128.5 说 明 书 CN 103044503 A 6 5/6 页 7 mg， 纯度分别为 93.1%， 90.2%。 0051 实施例 9 ： 0052 对于芍药苷和芍药内酯苷的。
24、提取分离采用直接提取分离 （提取 + 高速逆流分离） 、 提取粗分离 （提取 + 大孔树脂分离） 及本发明方法 （提取 + 大孔树脂富集分离 + 高速逆流纯 化分离） 的结果比较如下 ： 0053 1. 采用超声等方式提取后， 直接采用高速逆流分离的实验条件及结果 ： 0054 实验条件 ： 0055 超声提取 ： 称取杭白芍四等品粉末 100g， 用 2L 50% 乙醇溶液超声提取 2 次， 每次 30 分钟， 所用仪器为 “弘祥隆” CTXNW-2B 超声循环提取机， 超声频率 59kHz， 横波间隙 3 秒， 搅拌速度950rpm。 将提取液合并， 先用棉花过滤， 再用滤纸抽滤， 减压浓。
25、缩至无醇味， 冷冻干 燥， 得粗提物粉末。 0056 高速逆流分离 ： TAUTO（TBE-300A） 半制备型 HSCCC。溶剂体系为正丁醇 - 乙酸乙 酯-水 （4:1:5） ， 以溶剂体系上相为固定相， 下相为流动相。 流动相流速1.5 ml/min， 离心分 离仪转速 950r/min， 紫外检测器波长 254 nm， 恒温循环水箱 35。部分自动收集器以 3min 每管自动收集。 0057 高速逆流色谱分离上样量 ： 取 200mg 白芍提取物浸膏溶于 10ml 上相和 10ml 下相 中。 0058 实验结果 ： 0059 高速逆流色谱图见图 4， 所得芍药内酯苷 （峰 1） 和芍。
26、药苷 （峰 2） 的峰型单一， 有较 高分离度。液相分析显示， 在 230nm 下， 芍药内酯苷的检测纯度最高达 97.70% （峰面积百分 比） ， 芍药苷的检测纯度最高达 93.54%（峰面积百分比） 。但一次逆流色谱分离得到的芍药 苷和芍药内酯苷的量甚至不足 1mg。 0060 2. 采用超声等方式提取后， 采用大孔树脂粗分离的实验条件及结果 ： 0061 实验条件 ： 0062 超声提取 ： 条件同 1。 0063 大孔树脂粗分离 ： 称取 60ml AB-8 大孔树脂装入玻璃柱中， 柱体积为 20 ml， 上样， 上样量为12g， 吸附后， 先用水160 ml去除杂质， 再用30%乙。
27、醇200 ml洗脱芍药苷和芍药内 酯苷， 最后用 95% 乙醇再生树脂， 流速为 1ml/min。 0064 实验结果 ： 0065 将 30% 乙醇部位浓缩蒸干， 得 2.67g 芍药苷和芍药内酯苷的富集物， 其中芍药苷、 芍药内酯苷的纯度分别为48.0%、 11.8%。 大孔树脂达不到两种物质的分离， 所得分离产物为 两种物质的混合物。 0066 3. 采用本发明方法提取分离的实验条件及结果 ： 0067 实验条件 ： 0068 超声提取条件同 1。 0069 大孔树脂粗分离 ： 条件同 2。 0070 高速逆流分离 ： 条件同 1。 0071 实验结果 ： 0072 所用上述芍药苷和芍药。
28、内酯苷富集物 200 mg， 获得芍药苷和芍药内酯苷流份， 减 说 明 书 CN 103044503 A 7 6/6 页 8 压浓缩， 冷冻干燥， 得到芍药苷 72.4 mg、 芍药内酯苷 25.1 mg， 纯度分别为 97.5%、 92.1%。 0073 总结 ： 本发明结合大孔树脂富集和高速逆流色谱分离， 与单独使用高速逆流色谱 分离或大孔树脂分离比较， 能高效、 快速地同时制备纯度较高的芍药苷和芍药内酯苷单体。 说 明 书 CN 103044503 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103044503 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103044503 A 10 。