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1、(10)申请公布号 CN 103041404 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103041404 A *CN103041404A* (21)申请号 201210153708.1 (22)申请日 2012.05.17 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (71)申请人 上海七海复泰生物科技有限公司 地址 200437 上海市杨浦区密云路 1018 号 802 (72)发明人 李琦 滕以刚 (54) 发明名称 一种鱼类虹彩病毒 DNA 疫苗制备方法 (57。
2、) 摘要 本发明为一种鱼类虹彩病毒的 DNA 疫苗， 它 包含真核转录启动子、 虹彩病毒主要衣壳蛋白 （MCP） 的基因、 ankyrinrepeats 基因和真核转录 终止子， 还包括用于扩增质粒的复制起始位点和 抗性筛选标记 （图 1） 。本发明涉及的 DNA 疫苗， 推 荐采用肌肉注射的方法， 此外还可以采用口服和 浸泡的方式免疫。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种虹彩病毒 DNA。
3、 疫苗制备方法， 其特征在于， 该 DNA 载体 ： a) 含有编码和表达虹彩病毒衣壳蛋白 （MCP） 的基因 ; b) 含有编码 ankyrin repeats 基因 ； c) 可以是同时含有衣壳蛋白和 ankyrin repeats 两个基因的混合物。 2. 如权利 1 所描述的 DNA 载体， 载体上的免疫原性基因的启动子和增强子可以是常用 的强启动子如 Pcmv 等， 也可以是使真核细胞尤其是鱼类来源的组成型或者组织特异性的 启动子， 如 ATP 酶启动子、 肌动蛋白启动子等。 3. 如权利 1 和 2 所描述的 DNA 疫苗在制备养殖鱼类虹彩病毒防治中的应用。 4.如权利3所描述的应。
4、用， 其特征在于， 其中所说的制备是 ： 如权利1和2所描述的DNA 载体、 生理盐水和免疫佐剂。 5. 如权利 3 所描述的应用， 其特征在于， 其中所制备的 DNA 疫苗通过注射方式给药， 给 药浓度为 1-10ug/ 尾。 6. 如权利 3 所描述的应用， 其特征在于， 其中所制备的 DNA 疫苗通过浸泡给药， 给药浓 度为 1-10ug/ 尾。 权 利 要 求 书 CN 103041404 A 2 1/2 页 3 一种鱼类虹彩病毒 DNA 疫苗制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 特别涉及一种水产养殖中 DNA 疫苗制备方法， 具体的 说是防治虹彩病毒的 DNA 疫苗。
5、制备方法。 背景技术 0002 本发明涉及编码和表达鱼虹彩病毒免疫原的载体构建， 虹彩病毒是造成渔业生产 中巨大损失的一种致病病毒， 致死率高达 60% 以上。本专利涉及到生产和制备该疫苗的方 法， 也涉及到了虹彩病毒 DNA 疫苗的接种方法。 0003 虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物， 是大型 20 面体状 DNA 病毒， 分为虹彩病毒属 (Iridovirus)， 绿虹彩病毒属 (Chloriridovirus)， 淋巴囊肿病毒属 (Lymphocystivirus)， 蛙病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。 在水 产业中造成巨大损失的。
6、虹彩病毒有红鲷鱼虹彩病毒 (red sea bream iridovirus)、 台湾石 斑鱼虹彩病毒 (Taiwan Grouper iridovirus)、 传染性脾肾坏死病毒 (Infectious spleen and kidney necrosis virus)、 大黄鱼虹彩病毒 (Large yellow croaker iridovirus) 和 大菱鲆红体病虹彩病毒 (Turbot reddish body iridovirus)。 0004 病毒类疾病没有有效的药物来控制， 接种疫苗预防是针对病毒类疾病的一种经 济有效的手段。目前世界上应用的虹彩病毒疫苗只有日本鲷鱼虹彩病毒疫。
7、苗 (Kazuhiro Nakajima etc, Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridovirus disease in a field trial test, Dis Aquat Org, Vol. 36: 73-75,1999)， 其疫苗采用 灭活方法制备。国内研发中的虹彩病毒疫苗也都采取灭活方法制备， 病毒的培养使疫苗的 生产成本非常昂贵， 这限制了疫苗的推广。 0005 主 要 衣 壳 蛋 白 是 虹 彩 病 毒 的 重 要 免 疫 原， ankyrin repeat containing protein 也有文献。
8、报道其具有免疫原性 (Yun Im Kim etc, Production of polyclonal antibody against recombinant ORF 112L of rock bream iridovirus and in vitro neutralization)。 0006 本发明为一种 DNA 疫苗， 通过免疫接种， 使鱼自身表达虹彩病毒 major capsid protein 和 ankyrin repeats containing protein 这两种病毒蛋白， 通过抗原提呈， 使鱼 的免疫细胞产生针对这两种蛋白质的抗体， 从而达到免疫保护的作用。 发明内容 。
9、0007 本发明的目的是构建一个 DNA 疫苗， 通过接种， 鱼类自身能够表达虹彩病毒的具 有免疫原性的蛋白质， 进而产生对虹彩病毒的抗体， 保护鱼类免受虹彩病毒的侵害。 0008 本发明提供的 DNA 疫苗， 包括以下内容 ： a） 质粒构建 ： 氨苄青霉素抗性筛选比较和原核复制起始位点取自质粒pBR322, NdeI和EcoRI酶切， Agrose 胶回收 2Kb 的片段 ； MCP 基因和 ankyrin repeats containing protein 基因为全 说 明 书 CN 103041404 A 3 2/2 页 4 基因合成， 其前面加上真核启动子， 后面加上终止子。基因拼。
10、接成一条片段， 通过同源重组 与质粒 pBR322 的 ori 和 amp 片段连接， 转化大肠杆菌 DH5a（图 1） 。挑选阳性克隆， DNA 测 序验证 ； b) 以上构建的质粒和生理盐水、 佐剂混合后， 得到 DNA 疫苗。 附图说明 0009 以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。 0010 图 1 是表达载体示意图。 0011 该 DNA 疫苗与其他技术路线构建的疫苗相比具有如下优点 ： a、 生产成本低， 适合大批量生产 ； DNA 分子稳定， 适合储藏和运输 ； b、 安全， DNA 疫苗表达的是一段病毒基因， 不会发生病毒逆变 ； c、 该DNA疫苗同时表达MCP和anky。
11、rin repeats protein， 它是一个两价疫苗， 同时DNA 分子本身就可以作为佐剂， 可以与生理盐水混合直接注射。 具体实施方式 0012 实施例 1 ： DNA 疫苗的制备 载体构建 ： 全基因合成片段 Pcmv-MCP-SV40 pA-Pcmv-ankyrin repeats-SV40 pA， MCP 和 ankyrin repeats 核苷酸序列见附件。此片段同质粒 pBR322 上的 2k 片段同源重组 （GBI） ， 反应体系为 ： 15ul GBclonart 反应液 ； 1ul pBR322 片段 ； 2ul 全基因合成片段 ； 2ul ddH2O。50孵育 30m。
12、in 后， 取 5ul 转化大肠杆菌 DH5a。氨苄青霉素 LB 固体平板筛选。测 序验证正确克隆， 500ml LB培养基扩大培养， 大量抽提质粒备用。 液体LB培养基的配方为 ： 0.5% 的酵母提取液 ； 1% 的蛋白胨 ； 1% 的氯化钠， 条 pH 值至 7.0， 121， 15 分钟灭菌。固体 LB 培养基为在液体 LB 培养基的基础上添加 1.5% 的琼脂粉 ； DNA 疫苗配方 ： 生理盐水配方为 0.65% 的氯化钠溶解于蒸馏水， 氯化钠的浓度可以使 0.5% 到 0.9% 之 间。也可以是任氏生理盐水或者乐氏生理盐水。推荐 DNA 疫苗配方为 ： 1ugDNA 溶解在 1u。
13、l 生理盐水中。 0013 实施例 2 ： 以大菱鲆为对象的注射给药免疫保护实验 试验大菱鲆随机分为 14 组， 每组 3 个水槽， 10 尾 / 槽。将制备的 DNA 疫苗采用肌肉注 射方式免疫， 注射量为 1ug/ 尾和 10ug/ 尾， 对照为生理盐水。免疫 4 周后， 用虹彩病毒攻毒 （105CFU/ 尾） 。15 天后观察死亡数， 计算每组的免疫保护率 （见表 1） 。 0014 表 1 从上可以看出， 该 DNA 疫苗对虹彩病毒有良好的防治效果， 免疫保护率为 82%。 说 明 书 CN 103041404 A 4 1/2 页 5 1. MCP 核苷酸序列 ： atgtctgcaa。
14、tctcaggtgcgaacgtaaccagtgggttcatcgacatctccgctttcgatgcgatggagacc cacttgtacggcggcgacaatgccgtgacatactttgcccgcgagaccgtgcgtagttcctggtacagcaaactacc cgtcaccctgtcaaaacagactggccatgccaatttcggccaggagtttagtgtgacggtggccaggggtggcgact acctcattaatgtgtggctgcgtgttaagatcccctccatcacatccagcaaggaaaacagctacattcgctggtgt gac。
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19、ccgtgctccattccacaccgtgtgaatggccaacatgttttttt ggtaataaaaatggattcccttgtcgacctcatccgggctggcggtgtgcctgatgtggctcaatatgccgatcagg tggatgaatacaatgcggagggcttcacgccgctgatggtggccgtggaagccggcaacgcgggcgccgtacgcgcg ctgctcaccatgggtgcggaccccaacgatggccatgcgcatggccaccgcgtgcctcttattgcggcagtaggcgg gccatgggatgtgtttgtggc。
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23、gtggactttatcac 序 列 表 CN 103041404 A 5 2/2 页 6 atatttcacgccgcgacagggggtatcactgttgacgggccaggtcccaccgtacatgtacgtgggccgcgtggggc tggcttacactcacatgatgaccctgaggaacatggccatcggggcgctgccgtggcacagccgggattccgcgcag acacacattgactttggggtatataaaacactatga 序 列 表 CN 103041404 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103041404 A 7 。