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一种脑炎病毒蛋白及其编码基因和应用.pdf

  • 上传人：罗明
  • 文档编号：5265653
  • 上传时间：2018-12-30
  • 格式：PDF
  • 页数：16
  • 大小：10.18MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201210553179.4

    		 申请日：

    2010.10.09
    公开号：

    CN103045545A

    		 公开日：

    2013.04.17
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 7/01申请日:20101009|||公开
    IPC分类号：

    C12N7/01; C12N15/40; C12N15/861; C07K14/18; A61K39/12; A61K48/00; A61P31/14; A61P43/00; C12R1/93(2006.01)N

    		 主分类号：

    C12N7/01
    申请人：

    中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
    发明人：

    常国辉; 林磊; 吴晓燕; 户义; 张雨; 柳洪涛; 李靖; 罗彦军; 孙伟; 康晓平; 杨银辉; 祝庆余
    地址：

    100071 北京市丰台区东大街20号军医科院微生物流行病研究所
    优先权：

    专利代理机构：

    北京纪凯知识产权代理有限公司 11245

    		 代理人：

    关畅;任凤华
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    内容摘要

    本发明公开了一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白是如下1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。本发明的实验证明，本发明获得的重组腺病毒vAd-E2E3有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗。

    权利要求书

    权利要求书含有蛋白的编码基因的重组病毒；
    所述蛋白，是如下1）或2）的蛋白：
    1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
    2）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。
    根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于：所述编码基因为如下a1）、a2）或a3）或a4）所示的基因：
    a1）序列表中序列1所示的DNA分子；
    a2）序列表中序列1自5’末端第1‑1589位核苷酸所示的DNA分子；
    a3）在严格条件下与a1）或a2）限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；
    a4）与a1）或a2）限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
    根据权利要求1或2所述的重组病毒，其特征在于：
    所述重组病毒为重组腺病毒；所述重组腺病毒为将重组载体转入宿主细胞后，得到的重组腺病毒；
    所述重组载体为含有权利要求2中所述编码基因的重组载体。
    根据权利要求3所述的重组病毒，其特征在于：所述重组载体为pAdeasy‑1和重组穿梭质粒经过同源重组得到的；所述重组穿梭质粒是将权利要求2中所述编码基因插入到载体pShuttle‑CMV的多克隆位点间得到的质粒。
    根据权利要求3或4所述的重组病毒，其特征在于：所述宿主细胞为真核细胞。
    根据权利要求5所述的重组病毒，其特征在于：所述真核细胞为离体的哺乳动物细胞。
    根据权利要求6所述的重组病毒，其特征在于：所述离体的哺乳动物细胞为HEK‑293细胞。
    一种疫苗，它的活性成分为权利要求1‑7中任一所述的重组腺病毒。
    权利要求1‑7中任一所述重组腺病毒在制备疫苗中的应用，所述疫苗为脑炎病毒疫苗。
    权利要求1‑7中任一所述重组腺病毒在制备提高IFN‑γ活性的增强剂中的应用。

    说明书

    说明书一种脑炎病毒蛋白及其编码基因和应用
    本申请是申请号为201010506163.9、申请日为2010年10月9日、发明创造名称为“脑
    炎病毒蛋白及其编码基因与应用”的分案申请。
    技术领域
    本发明涉及一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用。
    背景技术
    脑炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他异种蛋白引发的超敏反应所致的大脑急性炎症性疾病。脑炎可以是病毒性感染原发的临床表现，或者是继发的临床表现，引起原发的脑炎的病毒有脊髓灰质炎病毒，埃可病毒、柯萨奇病毒等流行性病毒，或散发性的通过蚊子、蜱等节肢动物传播的黄病毒属的森林脑炎和批膜病毒科甲病毒属的东方马脑炎病毒等。
    甲病毒为披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员，以蚊蜱等吸血昆虫为传播媒介，可引起多种人畜共患传染病。近年来，国外已对多株甲病毒部分或全部序列测序。国内对这类病毒的分子生物学研究亦取得一定的结果。已有的研究结果表明：该病毒属中和抗体决定簇主要集中在结构蛋白E1和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例更高。加之近年来腺病毒载体因具有安全性好、宿主范围广、感染效率高等多种优点，被广泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究，为此我们分析比较了多株甲病毒核苷酸序列，人工合成了同源性较高的3kb的核苷酸，利用腺病毒载体构建重组基因工程疫苗，为预防和治疗疾病奠定了基础。
    发明内容
    本发明的一个目的是提供一种与脑炎病毒疫苗相关蛋白及其编码基因。
    本发明提供的蛋白E2E3，人工合成，是如下1）或2）的蛋白：
    1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
    2）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质。
    序列表中的序列2由529个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
    上述蛋白质E2E3的编码基因也是本发明保护的范围，所述编码基因为如下1）‑4）中任一所示的基因：
    1）序列表中序列1所示的DNA分子；
    2）序列表中序列1自5’末端第1‑1589位核苷酸所示的DNA分子；
    3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；
    4）与1）或2）限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
    含有上述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌、表达盒或重组病毒也是本发明保护的范围。
    所述重组载体为pAdeasy‑1和重组穿梭质粒经过同源重组得到的；所述重组穿梭质粒是在载体pShuttle‑CMV的KpNI和HindIII酶切位点间插入所述编码基因得到的。
    所述重组病毒为重组腺病毒；所述重组腺病毒为将上述蛋白的编码基因转染宿主细胞获得的重组腺病毒。
    所述宿主细胞为真核细胞，优选为离体的哺乳动物细胞，尤其优选为HEK‑293细胞。
    本发明的另一个目的是提供一种疫苗。
    本发明提供的疫苗，其活性成分为如下任意一种：
    1）所述的蛋白；2）所述编码基因；3）所述重组腺病毒。
    上述重组腺病毒在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
    所述疫苗为脑炎病毒疫苗。
    上述重组腺病毒在制备提高IFN‑γ活性的增强剂中的应用也是本发明保护的范围。
    本发明的实验证明，人工合成E2E3通过转染HEK‑293细胞而组装成携带有目标抗原基因的重组腺病毒vAd‑E2E3。重组腺病毒vAd‑E2E3感染293细胞能有效表达目的蛋白；通过滴鼻途径接种BalB/C小鼠，利用间接免疫荧光技术检测特异性抗体水平，结果表明，所构建的重组腺病毒虽然产生特异性抗体的时间和维持的水平有所不同，但均产生了较好体液免疫反应，为进一步开展免疫保护实验提供了重要的数据支持。由于病毒在机体内极微量的蛋白表达即可激起免疫反应，因此构建的携带有脑炎病毒结构基因的重组腺病毒vAd‑E2E3，有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗株。
    附图说明
    图1为pAd‑E2E3酶切鉴定图
    图2为重组质粒Pac I酶切和PCR鉴定
    具体实施方式
    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
    下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
    东部马脑炎病毒(EasternEquineEncephalomyelitis virus）（HE Jing;CHANG GuoHui;WU Jin Song;LI ZhongDuo;ZHU QingYu：Cloningand expression of E2gene of eastern equine encephalomyelitis virus.Bulletin of The Academy ofMilitary MedicalSciences.2002.02.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。）
    HEK‑293细胞（Invitrogen公司产品，Cat.No.R750‑07）；实验所需限制性内切酶分别购自TaKaRa和Biolabs公司；脂质体Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；Platinum pfx Taqase购自Invitrogen公司。
    实施例1、重组腺病毒（vAd‑E2E3）的获得
    1、含有目的基因pAdtrack‑E2E3的构建及鉴定
    根据东部马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalomyelitis virus）(NC‑001547）的基因组序列，突变序列中的多个位点，设计出序列表中的序列1，人工合成出序列1。
    设计引物扩增编码E2E3蛋白的基因，引物序列（引物分别含有KpNI和HindIII酶切位点）见下：
    E2E3‑F:5’‑ACGGggtaccATGTCACTAGTGACCACCATGTGTCT‑3’
    E2E3‑R:5’‑ACCCaagcttACTAAAAAAGGCACGACACAG‑3’
    以人工合成出序列1的DNA为模板，利用E2E3‑F和E2E3‑R引物对进行PCR反应，得到的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到了预期大小一致的片段，约为1.5Kb。
    经测序，该PCR产物具有序列表中的序列1自5’末端第1‑1589位核苷酸，将该PCR产物的基因命名E2E3，其OFR为序列1的自5’末端第1‑1589位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为E2E3，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，序列2由529个氨基酸残基组成。
    回收PCR产物，对PCR产物进行加“A”处理，处理后的PCR样品与pMD‑18T载体（TaKaRa公司产品，Code:D101A.Lot CK3201A）相连，转化DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落提取质粒后测序验证，结果为该质粒为将序列表中序列1的自5’末端第1‑1589位核苷酸插入pMD‑18T得到的，命名为pTE2E3。
    用KpNI和HindIII双酶切重组质粒pTE2E3和质粒pShuttle‑CMV（Invitrogen公司产品，Catalog#240007），酶切产物分别用凝胶回收试剂盒切胶回收，并在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH10B（Invitrogen公司产品，Cat.No.18290‑015）后挑选阳性克隆，提取质粒进行测序，结果为该质粒为将序列表中序列1的自5’末端第1‑1589位核苷酸插入pShuttle‑CMV的KpnI和HindIII酶切位点间得到的载体，命名为pAdtrack‑E2E3。
    2、重组腺病毒载体的构建
    菌BJ5183购自上海杰美基因医药科技有限公司，货号为：GMS12223.2。
    将腺病毒骨架质粒pAdeasy‑1（Invitrogen公司产品，Catalog#240005，含有GFP报告基因）经过PacI(购自Biolabs公司，货号为：R05647S)酶切后，转入宿主菌BJ5183中，得到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy‑1的宿主菌BJ5183。
    将上述pAdtrack‑E2E3和穿梭质粒pShuttle‑CMV用PmeI（购自Biolabs公司，货号为：R0560S）经37℃充分消化，使用Gel Extractionkit试剂盒（购自OMGEA公司，货号为：D2500‑01）回收线性化的pAdtrack‑E2E3和pShuttle‑CMV。
    将线性化的质粒pAdtrack‑E2E3电转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy‑1的宿主菌BJ5183感受态细胞中，由于大肠杆菌BJ5183具有Sm抗性，pAdeasy‑1具有Amp抗性，而重组质粒pAdtrack‑E2E3和穿梭载体质粒pShuttle‑CMV具有Kan抗性，在重组过程中穿梭质粒上的Kan抗性取代了pAdeasy‑1上的Amp抗性，因此根据Kan和Sm双重抗性来筛选阳性克隆，得到的阳性克隆。
    提取转入线性化的质粒pAdtrack‑E2E3的阳性克隆的质粒进行PacI酶切鉴定，1%DNA凝胶电泳结果见图1所示1：pAdTrack‑E2E32：阳性克隆质粒3:pShuttle‑CMV4：pAdeasy‑15：DL15000Marker，从图中可以看出泳道1重组穿梭质粒pAdTack‑QE经过pacⅠ酶切后，产生2个片段，其中一个含有目的基因E2E3约7Kb,另一个片段含有穿梭质粒pShuttle‑CMV上的复制子和卡那霉素抗性基因大小约3Kb，泳道2经过PacⅠ酶切后，产生2个片段，所产生的小片段的大小为4.5Kb，含有复制子和卡那霉素抗性基因，大片度为含有目的基因的E2E3的病毒骨架大小约为35Kb（病毒骨架大小约33.5Kb而目的基因E2E31.5Kb）。将该重组质粒命名为重组质粒pAd‑E2E3。
    提取转入线性化的质粒pAdtrack‑E2E3的阳性克隆的质粒进行PCR鉴定，引物为E2E3‑F、E2E3‑R，结果见图2所示，1：pShuttle‑CMV2：pAdTrack‑E2E33：pAd‑E2E34：pAdeasy‑15：DL15000Marker，可以看出，重组质粒pAd‑E2E3可扩增出与预期的目的片度1.5Kb，进一步说明说明已经成功构建携带有目的基因E2E3的重组腺病毒骨架质粒pAd‑E2E3。
    3、组装成重组腺病毒
    将HEK‑293细胞接种到6孔板中，37℃培养，细胞生长至60%‑70%,用脂质体Lipofectamin2000（购自Invitrogen公司）介导重组腺病毒骨架质粒pAd‑E2E3转染入细胞中，转染完成7‑10天后，收集细胞，经3轮反复冻融，离心收集上清液，即为含有目的基因的重组腺病毒vAd‑E2E3。转染实验按照说明书进行，培养7‑10天，定期在荧光显微镜下检测是否产生荧光，判断转染是否成功，由于该重组病毒上含有绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因。
    4、重组腺病毒vAd‑E2E3的扩增及目的蛋白的表达
    1）重组腺病毒vAd‑E2E3的扩增
    将上述3获得的转染完成7‑10天后，收集细胞，经3轮反复冻融，离心收集上清液，即为重组腺病毒vAd‑E2E3，进行下一代扩增，连续扩增3代，第二次收集上清液，比第一次数量增多。
    2）目的蛋白的表达
    取200ul上述获得的第二次收集的上清液（重组腺病毒vAd‑E2E3，病毒的浓度为LgTCID50/0.2ml=8.0）感染5x106的HEK‑293细胞，4天后，收集细胞。细胞经处理后进行SDS‑PAGE电泳。结果为：经SDS电泳，得到大小为110KD的蛋白（E2E3蛋白），与预期蛋白的大小一致。说明重组腺病毒有效的介导E2E3在细胞中表达。
    采用同样的方法将上述线性化的pShuttle‑CMV和pAdeasy‑1共同转入宿主菌BJ5183感受态细胞中，得到重组腺病毒载体，记作pAd‑GFP；将pAd‑GFP转染HEK‑293细胞，获得阴性对照腺病毒vAd‑GFP。对照腺病毒vAd‑GFP中无E2E3蛋白表达。
    实施例2、重组腺病毒（vAd‑E2E3）的滴鼻接种中和抗体测定
    6‑7周龄的BALB/c小鼠随机分为3组，分别为vAd‑GFP对照组和vAd‑E2E3免疫组，每组20只小鼠。
    vAd‑GFP对照组：拭鼻方式感染20ul由实施例1获得对照腺病毒vAd‑GFP(108pfu）。
    vAd‑E2E3免疫组：拭鼻方式感染20ul由实施例1获得的重组腺病毒（vAd‑E2E3）(108pfu）。
    PBS对照组：拭鼻方式感染20ulPBS溶液（0.01M/L pH7.2）
    一、血清和淋巴细胞检测
    将3个小组在第一次免疫后的第4周加强免疫一次。在免疫后每间隔一周时间通过尾静脉采集小鼠血液，离心后分别收集血清和淋巴细胞沉淀。
    1、间接免疫荧光试验测定免疫小鼠血清中病毒的抗体反应
    用东部马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalomyelitis virus）感染的HEK‑293制备抗原片，制备的方法如下所述：
    实验前准备：把抗原片摆放在抗原架上，每个架上排放2排，1排4个，完毕后用罩子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行：
    1）待75cm2方瓶的HEK‑293细胞生长至80%左右的时候，用东部马脑炎病毒2ml感染细胞1小时后，吸出吸附液，补加新鲜的细胞维持液，放入培养箱中培养；
    2）当细胞出现细胞病变的时候（约25%‑50%），按照细胞传代的方法消化细胞，用适量体积的培养液（含有10%胎牛血清的DMEM细胞生长液，具体配方：向500mlDMEM液体中加入50ml胎牛血清、100X Antibiotic‑Antimycotic、100X NEAA、100ulHEPES，之后用实验室配制的经过0.22um滤膜过滤除菌的7.5%（质量百分含量）NaHCO3调节溶液的pH值至7.0‑7.2，上述液体均为GIBCO公司产品）；3ml）悬浮细胞，每个抗原孔加入40ul细胞悬液，盖上盖子后放入培养箱中继续培养8小时；
    3）取一烧杯内盛PBS溶液（0.01mol/L pH=7.2），将吸附后的抗原片缓缓放入溶液中，浸泡1min左右，取出放在工作台内晾干，约需30min；
    4）将抗原片放入盛有丙酮（国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度99.5%）的烧杯中，‑20℃30min或者过夜；
    5）取出晾干后保存于低温（‑40℃以下）冰箱中备用。
    间接免疫荧光法：采集小鼠全血后放置于37℃培养箱孵育30min，经800rpm离心15min后吸取上清得到血清。之后将血清按照实验要求进行稀释后进行间接免疫荧光实验，具体实验步骤如下：
    1）从冰箱中取出抗原片，肉眼观察上面的细胞是否脱落，如果有脱落孔，放弃不用；
    2）在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈，防止所加样品溢流；
    3）根据实验的需要稀释所检测的血清后加样，每孔20‑25ul，一般需要做复孔，故需要50ul，根据需要做倍比稀释；
    首浓度按照1:10，故需要加入10ul血清+90ul抗体稀释液，在漩涡混合器上充分混匀后取出50ul1:10稀释液+50ul血清稀释液（1:20），依此稀释下去，一般稀释至1:160；
    4）把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育30min；
    5）取出抗原片，放入洗板槽内，向里面加入洗涤液（0.005M PBS+0.02%(体积百分含量)Tween20），在水平振荡器上洗涤5min，重复3次；
    6）待抗原片完全风干后，加入1:50稀释的荧光抗体25ul/孔，放入饭盒后在37℃、5%CO2培养箱中孵育30min；
    荧光抗体的稀释：取出针对所加入血清来源的适量荧光抗体，用0.02%(质量百分含量)伊文斯兰溶液按照1:50稀释抗体，该实验所使用的抗体为FITC‑conjugate‑Goat Anti‑Human IgG购自Sigma公司。
    7）重复步骤5）；
    8）风干后，滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。
    利用间接免疫荧光试验测，结果显示在首次免疫2周后小鼠血清抗体水平开始升高，效价达至1:80，3周后降至较低水平；血清效价为1:30。加强免疫后，抗体水平再次迅速升高，升高幅度比首次免疫整体要高。加免后1周达至达到1:160，并持续至4周左右，而对照组vAd‑GFP和PBS始终未检测出特异性抗体。
    2、流式分析淋巴细胞中CD4+、CD8+数
    流式分析淋巴细胞中CD4、CD8+数，结果如下：
    免疫小鼠中，vAd‑E2E3免疫1周后CD4+淋巴细胞占总淋巴细胞的8%，2周以后恢复至正常水平约占5%，加强免疫后，vAd‑E2E3免疫组CD4+淋巴细胞开始持续升高，由占总淋巴细胞的5%上升至25%，而PBS对照组以及vAd‑GFP组CD4+淋巴细胞一直占总淋巴细胞的5%，无明显的改变。
    免疫组小鼠中，vAd‑E2E3免疫1周后达至高峰，CD8+淋巴细胞占总淋巴细胞的17%，随后恢复至正常水平约占2%，在首免后3周CD8+淋巴细胞数量再次升高占总淋巴细胞的3%；加强免疫后，vAd‑E2E3免疫组CD8+淋巴细胞开始持续升高，在免疫2周后达至峰值约占总淋巴细胞的12%，3周后下降至正常水平2%，4周后又缓慢升至较高水平约占8%，而PBS对照组以及vAd‑GFP组CD8+淋巴细胞一直占总淋巴细胞的7%。
    二、利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）对细胞因子生成细胞进行定量
    加强免疫4周后，每组随机挑选4只小鼠，处死后立即无菌采取脾脏，加入10ml含有10%胎牛血清的1640培养液（含有10%胎牛血清的1640培养液：向500ml RPMIMEDIUM1640液体中加入50ml胎牛血清、100X Antibiotic‑Antimycotic、100X NEAA、100ul HEPES，之后用实验室配置的经过过滤除菌的7.5％NaHCO3（质量百分比）调节溶液的pH值为7.0—7.2；上述RPMI MEDIUM1640、胎牛血清、100XAntibiotic‑Antimycotic、100X NEAA、HEPES均为GIBCO公司产品；RPMI MEDIUM1640GIBCO公司产品，LOT:8109086），将脾组织通过200目铜网制成细胞悬液，收集到无菌的离心管中，15000rpm/min离心5min，弃上清液后用1640培养基离心洗涤细胞两次，最后将脾细胞稀释成2×107个/ml，制成细胞悬液备用。以细胞培养的东部马脑炎病毒作为特异刺激因子（将2×107个/ml个脾细胞108pfu的东部马脑炎病毒混合，共同孵育48小时，按照ELISPOT实验的操作，脾细胞与特异的刺激因子要分别加入到孔中，之后在孔内反应，不能在孔外混合后加入其内），利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）对细胞因子生成细胞进行定量。
    具体的实验步骤：
    1．Coating antibody(包被抗体):无菌条件下进行
    用Coating buffer(1×PBS pH7.2)稀释capture抗体（200倍），终浓度5ug/ml包被板子，每孔加100ul稀释的capture抗体4℃过夜。
    2.Blocking（封闭）：无菌条件下进行
    吸干孔中包被液，洗板子，每孔加入200ul Blocking溶液,洗孔一次。（在灭菌吸水纸上扣干）
    3.Cell Activation(刺激细胞):无菌条件下进行
    3.1弃Blocking溶液，准备刺激用的抗原，用组织完全培养基稀释适宜浓度50ug/ml，每孔加入100ul；(不要拍板子)
    3.2准备1×106个脾细胞悬液，每孔加入100ul；(注：避免震动)
    3.3盖上盖子，板子放置37℃,5%CO2,99%湿度的培养箱根据细胞情况培养48小时。（注：时刻避免碰撞）
    4.Detection antibody（检测抗体）：
    4.1在无菌条件下吸去细胞悬液，用去离子水（冰冷的去离子水，低渗法裂解细胞）洗2遍，每遍浸泡3‑5min，以下实验操作可以拿到超净工作台外进行；
    4.2每孔用200ul wash bufferⅠ洗3遍，弃wash bufferⅠ（最后一遍后拍干）
    4.3稀释Detection抗体，用稀释buffer(1×PBS+10%FBS)250倍稀释，终浓度2ug/ml。每孔加入100ul；
    4.4盖上盖子，室温培养2小时。
    5.加入酶连抗体：
    5.1弃Detection抗体溶液，每孔用200ul wash bufferⅠ洗3遍。（最后一遍拍干）；
    5.2用稀释buffer稀释Streptavidin‑HRP（用稀释buffer（1×PBS+10%FBS）稀释100倍。现用现配，用完多余的弃之）每孔加100ul；
    5.3盖上盖子，室温培养1小时。
    6.结果检测：
    6.1弃Streptavidin‑HRP溶液，每孔用200ul wash bufferⅠ洗4遍；
    6.2每孔用200ul wash bufferⅡ洗2遍（最后一遍拍干）；
    6.3加入底物AEC，每孔加100ul（注意避光）。控制斑点形成约需要15min；
    6.4用去离子水（洗2遍）终止底物反应；
    6.5室温避光空气吹干板子2小时‑过夜，至板子全干，避光保存板子待检测。注：不要将板子放到烤箱中，防止膜发脆、破裂。）
    结果：ELISPOT的结果是通过最后的板子出斑的数目来确定，通过肉眼看到vAd‑E2E3免疫组出斑数目明显增加，说明经东部马脑炎病毒的刺激后，vAd‑E2E3免疫组小鼠脾细胞分泌IFN‑γ活性明显增高，抗原刺激后vAd‑QE免疫组小鼠脾细胞分泌IFN‑γ活性是对照vAd‑GFP组的4倍，是PBS对照组的11倍（根据出斑数目来统计倍数）。
    三、攻毒实验
    1、发病和存活状况
    加强免疫4周后，vAd‑GFP对照组、vAd‑E2E3免疫组和PBS对照组的每组处死后剩余的小鼠在BSL‑3实验室进行攻毒实验，再将8只小鼠为一组，分为两组：
    vAd‑GFP对照组A：腹腔注射215个LD50（半数致死剂量）东部马脑炎病毒
    vAd‑GFP对照组B：腹腔注射21个LD50东部马脑炎病毒
    vAd‑E2E3免疫组A：腹腔注射215个LD50（半数致死剂量）东部马脑炎病毒
    vAd‑E2E3免疫组B：腹腔注射21个LD50东部马脑炎病毒
    PBS对照组A：腹腔注射215个LD50（半数致死剂量）东部马脑炎病毒
    PBS对照组B：腹腔注射21个LD50东部马脑炎病毒
    持续4周观察小鼠发病和存活状况。
    结果为加强免疫4周后，215个LD50的东部马脑炎病毒攻击后，vAd‑E2E3免疫组A的保护效率为0（8只小鼠都死亡）；21个LD50东部马脑炎病毒攻击时，vAd‑E2E3免疫组B的保护率仅为25%（8只小鼠死亡6只）；对照组（vAd‑GFP对照组A、vAd‑GFP对照组B、PBS对照组A、PBS对照组B）均无保护作用（8只小鼠都死亡）。保护率是最后存活小鼠的数量与其攻毒前小鼠的数量比值。
    2、利用BHK细胞单层测定小鼠血清中和抗体
    收集上述攻毒后的各组小鼠的血清，利用BHK细胞（Invitrogen公司产品，Cat.No.R760‑07）单层测定小鼠血清中和抗体。先将免疫小鼠血清适当稀释后，置56℃水浴中处理30min，破坏其中的补体和其他不耐热的非特异性毒性因子，然后以维持液（含有2%（体积百分比）胎牛血清的细胞维持液的配置方法：向500ml DMEM液体中加入10ml胎牛血清、100X Antibiotic‑Antimycotic、100X NEAA、100ul HEPES，之后用实验室配置的经过过滤除菌的7.5%NaHCO3（质量百分比）调节溶液的pH值为7.0—7.2；上述DMEM、胎牛血清、100X Antibiotic‑Antimycotic、100X NEAA、HEPES均为GIBCO公司产品）在无菌离心管中进行2倍连续稀释。取100个TCID50东部马脑炎病毒病毒液和等体积不同稀释度的血清，充分混匀后置37℃孵育1h，中间上下颠倒离心管混匀液体1‑2次，1小时后取出96孔板，其内的BHK细胞已铺满单层，吸去细胞单层上的培养基，加入作用过的病毒‑抗体混合液（即上述孵育过的混匀液体，请核实），培养板上同时设阳性和阴性对照孔（阳性对照为用细胞维持液稀释为100个TCID50的东部马脑炎病毒病毒液，阴性对照为用细胞维持液稀释的不同浓度的血清，空白对照为细胞维持液）。放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养，每天观察和记录细胞病变的情况。
    中和实验检测血清效价，具体方法为：通过显微镜观察细胞的病变情况（病变时细胞膨大变圆聚集），当孔内细胞病变达到90%以上记为++++，细胞病变达到75%以上记为+++，细胞病变达到50%以上记为++，细胞病变达到25%以上记为+，无细胞病变记为‑，最后用Reed‑Muench法计算血清的中和指数。
    结果：接种病毒前vAd‑E2E3免疫组A和vAd‑E2E3免疫组B小鼠血清效价均为1:80,攻毒4周后，接种21个LD50的东部马脑炎病毒攻击后的vAd‑E2E3免疫组B存活小鼠的血清效价为1:300，215个LD50东部马脑炎病毒攻击后的vAd‑E2E3免疫组A的存活小鼠血清效价则为1:30。而对照组（vAd‑GFP对照组A、vAd‑GFP对照组B、PBS对照组A、PBS对照组B）均无特异性抗体的产生。
    结果表明，所构建的重组腺病毒vAd‑E2E3产生了较好体液免疫反应，为进一步开展免疫保护实验提供了重要的数据支持。

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