卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102978193 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978193 A *CN102978193A* (21)申请号 201210455315.6 (22)申请日 2012.11.13 CCTCC No ： M 2012299 2012.07.25 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12P 17/02(2006.01) C12P 13/00(2006.01) C12R 1/645(2。

2、006.01) (71)申请人浙江工业大学地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人郑裕国薛锋柳志强万南微高爱存沈寅初 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人黄美娟冷红梅 (54) 发明名称卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用 (57) 摘要本发明提供了一种源自壤霉菌（Agromyces sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。该卤醇脱卤酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示，其编码基因序列如如SEQ ID NO.1所。

3、示。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC No ： M 2012299 的卤醇脱卤酶及其编码基因；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒 pET28b-Deh，再转化至大肠杆菌 BL21 中，获得再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有卤醇脱卤酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物转化与催化。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页序列表 3 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。

4、发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页序列表 3 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 2. 编码权利要求 1 所述卤醇脱卤酶的基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如 SEQ ID NO.1 所示。 4. 如权利要求 2 所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC No ： M 2012299。 5. 壤霉菌（Agromyces sp.） ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编 43。

5、0072，保藏编号 CCTCC No ： M 2012299，保藏日期 2012 年 7 月 25 日。 6. 一种含有权利要求 2 所述卤醇脱卤酶基因的重组载体。 7. 权利要求 2 所述的基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用。 8. 如权利要求 7 所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有 SEQ ID NO.1 所示卤醇脱卤酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。 9. 权利要求 1 所述卤醇脱卤酶在微生物转化 1,3- 二氯丙二醇制备环氧氯丙烷中的应用。 10. 权利要求 1 。

6、所述卤醇脱卤酶在微生物转化 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯制备 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。权利要求书 CN 102978193 A 2 1/5 页 3 卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用（一）技术领域 0001 本发明涉及一种卤醇脱卤酶、编码基因及载体，产卤醇脱卤酶的新菌株，以及其在制备环氧氯丙烷和 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。（二）背景技术 0002 卤醇脱卤酶，也叫卤醇 - 卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解有机卤化合物的关键酶之。

7、一。根据其序列同源性分为 HheA、 HheB、 HheC 3 类。有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于排废以及人工合成卤化物的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物和脱卤酶降解有机卤化物已引起人们广泛的关注，在环境污染治理，特别是手性环氧化物合成方面等具有十分重要的作用。 0003 卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低络氨酸的 pKa 值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，。

8、进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶不但可以催化碳 - 卤键的断裂进行脱卤反应，可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如 N3-、 NO2-、 CN-等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的 - 取代醇。因此可以用来合成一些非自然手性化合物。 0004 卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及 - 取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。 0005 近年，已从多种。

9、微生物中发现了卤醇脱卤酶，如 Agrobacterium radiobacter AD1， Agrobacter sp. AD2， Corynebacterium sp. N-1074， Agrobacterium tumefaciens， Arthrobacter erithii H10a， Alcaligenes sp. DS-K-S38 ， Pseudomonas sp. DS-k-2DI 等。部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化形成环氧化合物及 - 取代醇。但是对已有卤醇脱卤酶进行研究的同时，挖掘新的的微生物来源的卤醇脱卤。

10、酶基因仍是今后研究的热点。（三）发明内容 0006 本发明目的是提供一种源自壤霉菌（Agromyces sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。 0007 本发明采用的技术方案是： 0008 一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 0009 本发明还涉及编码所述卤醇脱卤酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO ： 1所示。说明书 CN 102978193 A 3 2/5 页 4 0010 该卤醇脱卤酶基因由如下方法得到：利用硫酸铵沉淀和离子交换等分离纯化手段。

11、从壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC NO ： M 2012299 菌株中分离纯化得到脱卤酶蛋白，经过 N 端序列测序和肽指纹图谱分析，发现该酶与 Arthrobacter sp. AD2 和 Corynebacterium sp. N-1074 的 Haloalcohol Dehalogenase HheA 存在同源性，以此设计引物。利用 PCR 技术，在引物 1（ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC）、引物 2（TTAGGGCAGATAGCC ACCG）的作用下以来源于壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC NO ： M 2012299 菌。

12、株中的总基因组 DNA 为模板克隆长约 0.75kb 的卤醇脱卤酶基因片段。将该片段连接到 pMD18-T 载体上获得克隆载体 pMD18-T-Deh 和转化了 pMD18-T-Deh 的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为735bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为（SEQ ID NO.1）： 0011 1 ATGCGCATCG CCCTCGTGAC TCATGCACGG CATTTTGCAG GCCCCGCCGC CGTCGAGGCG 0012 61 CTTACGCGGG ATGGCTATAC CGTGGTTTGC CACGACGCGA。

13、 GCTTCGCTGA TGCAGCTGAA 0013 121 CGACAGCGTT TCGAGTCGGA GAACCCGGGC ACCATCGCGC TCGCCGAGCA GAAGCCCGAG 0014 181 CGTCTGGTCG ACGCCACGCT GCAGTACGGG GAAGCGATCG ACACGATCGT CTCGAACGAT 0015 241 TACATTCCGC GCCCGATGAA TCGGCTCCCG ATCGAGGGAA CGAGCGAGGC CGACATCCGA 0016 301 CAGATGTTCG AGGCGCTCAG CATCTTCCCG ATCCTGCTCC。

14、 TGCAGTCGGC CATCGCGCCG 0017 361 CTACGGGCTG CAGGCGGCGC CTCCGTTATC TTCATCACGT CCTCGGTTGG CAAGAAGCCG 0018 421 CTCGCCTACA ACCCTCTCTA TGGGCCCGCG CGCGCCGCTA CCGTCGCGCT TGTCGAATCG 0019 481 GCAGCGAAGA CGCTGTCCCG TGACGGAATC TTGCTCTATG CGATCGGTCC GAACTTCTTC 0020 541 AACAACCCGA CGTACTTCCC GACGTCGGAT TGGGAGAACG。

15、 ACCCCGAGCT CCGGGATCGT 0021 601 GTCGAGCGGG ACGTGCCGCT CGGTCGCCTC GGCCGTCCGG ACGAGATGGG TGCGCTGATC 0022 661 ACCTTCCTCG CTTCGCGTCG TGCAGCGCCC ATCGTGGGGC AGTTCTTCGC TTTCACCGGT 0023 721 GGCTATCTGC CCTAA 0024 利用软件对该基因序列进行分析，推知所述卤醇脱卤酶基因编码 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列： 0025 1 MRIALVTHAR HFAGPAAVEA LTRDGYTVVC HD。

16、ASFADAAE RQRFESENPG TIALAEQKPE 0026 61 RLVDATLQYG EAIDTIVSND YIPRPMNRLP IEGTSEADIR QMFEALSIFP ILLLQSAIAP 0027 121 LRAAGGASVI FITSSVGKKP LAYNPLYGPA RAATVALVES AAKTLSRDGI LLYAIGPNFF 0028 181 NNPTYFPTSD WENDPELRDR VERDVPLGRL GRPDEMGALI TFLASRRAAP IVGQFFAFTG 0029 241 GYLP 0030 本发明所述基因源自壤霉菌（Agromyces sp。

17、.） CCTCC No ： M 2012299。 0031 本发明还涉及一株产卤醇脱卤酶的新菌株壤霉菌（Agromyces sp.） ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编 430072，保藏编号 CCTCC No ： M 2012299，保藏日期 2012 年 7 月 25 日。 0032 本发明还涉及一种含有所述卤醇脱卤酶基因的重组载体，以及利用该重组载体转化获得的基因工程菌。 0033 本发明还涉及所述的基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用。 0034 本申请发明人根据测序结果设计胞内表达。

18、引物 3（CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C）和引物 4（CCGCTCGAGTTAGGGCAGATA GCCACCG），以克隆载体说明书 CN 102978193 A 4 3/5 页 5 pMD18-T-Deh为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的卤醇脱卤酶基因。将卤醇脱卤酶基因同表达载体 pET28b 连接，构建了含有卤醇脱卤酶基因的表达重组质粒 pET28b-Deh。 0035 将胞内表达重组质粒 pET28b-Deh 转化至大肠杆菌 BL21 菌株中，获得含有重组质粒 pET28b-Deh 的重组大肠杆菌 BL21/pET2。

19、8b-Deh，以重组菌为酶源可进行生物催化与转化。 0036 具体的，所述的应用为：构建含有 SEQ ID NO ： 1 所示卤醇脱卤酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。 0037 本发明还涉及所述卤醇脱卤酶在微生物转化 1,3- 二氯丙二醇制备环氧氯丙烷中的应用。 0038 本发明还涉及所述卤醇脱卤酶（SEQ ID NO ： 2）在微生物转化 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯制备 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。 0039 本发明的有益效果主要体现在。

20、：提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC No ： M 2012299 的卤醇脱卤酶及其编码基因；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒 pET28b-Deh，再转化至大肠杆菌 BL21 中，获得再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有卤醇脱卤酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物转化与催化。本发明卤醇脱卤酶作为转化用酶，以 1,3- 二氯丙二醇、 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯等为底物，可以进行转化反应制备环氧氯丙烷、 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯等。（四）附。

21、图说明 0040 图 1 为克隆载体 pMD18-T-Deh 物理图谱； 0041 图 2 为 pET28b-Deh 重组质粒物理图谱； 0042 图 3 为卤醇脱卤酶基因 PCR 扩增 argrose 电泳图；其中， 25 为利用引物 1 和引物 2 扩增得到的卤醇脱卤酶基因片段； 1 为 DL2000 DNA Marker ； 0043 图 4 阳性重组质粒 pET28b-Deh 的酶切结构图；其中， 1 为 DNA/Hind DNA Marker ； 2 为 pET28b-Deh/NdeI 样品； 3 为 pET28b-Deh/Xho I 样品； 4 为 pET28b。

22、-Deh/Nde I and XhoI 样品； 5 为 DL 2000 DNA Marker 片段。 0044 图 5 为卤醇脱卤酶 SDS-PAGE 图； 1 ： IPTG 诱导的 E.coli BL21/pET28b-Deh ； 2 ：未诱导的 E.coli BL21/pET28b-Deh ； 3 ： E.coli BL21, 4 ：蛋白质分子量 Marker。（五）具体实施方式 0045 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 0046 实施例 1 ： 0047 用核酸快速提取仪提取壤霉菌（Agromyces sp.） CCTCC 。

23、No ： M 2012299 菌体的总基因组 DNA，以该基因组 DNA 为模板，在引物 1（ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC）和引物 2 （TTAGGGCAGATAGCC ACCG）的作用下进行 PCR 扩增。 0048 PCR 反应体系各组分加入量（总体积 100L）： 10Pfu DNA Polymerase Buffer 说明书 CN 102978193 A 5 4/5 页 6 10L(Mg2+)， 10mM dNTP mixture （dATP、 dCTP、 dGTP 和 dTTP 各 2.5mM） 0.5L，浓度为 50M 的克隆引物 1、引物 2 。

24、各 0.5L，基因组 DNA 1L， Pfu Taq DNA Polymerase 1L，无核酸水 86.5L。 0049 采用 Biorad 的 PCR 仪， PCR 反应条件为：预变性 94 3min，然后进入温度循环 94 30s， 60 30 s， 72 1.5min，共 30 个循环，最后 72延伸 10min，终止温度为 8。 0050 取 10L PCR 反应液用 0.9% 琼脂糖凝胶电泳检测，如图 3 在 750bp 左右出现明显条带。切胶回收该片段并纯化，直接同 T 载体进行连接，得到克隆重组质粒 pMD18-T-Deh （质粒图谱参见图 1）。将。

25、该重组质粒电转化至大肠杆菌 JM109 中，利用篮白斑统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物 1 和引物 2 扩增到的核苷酸序列长度为 735bp（SEQ ID NO ： 1），该序列编码一个完整的开放阅读框。 0051 实施例 2 ： 0052 根据实施例 1 分析结果设计引物 3（CGCCATATGCGCATCGCCCTC GTGACTC）和引物 4 （CCGCTCGAG TTAGGGCAGATAGCCACCG），并分别在引物3和引物4中引入了Nde I和XhoI限制性酶切位点。在引物 4 和引物 4 的引发下，利用高保真 Pf。

26、u DNA 聚合酶（fermentas）进行扩增，获得长为735bp的卤醇脱卤酶基因片段（SEQ ID NO ： 1），测序后利用Nde I和XhoI限制性内切酶（fermentas）对扩增片段进行处理，并利用 T4 DNA 连接酶（TaKaRa）将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体 pET28b 进行连接，构建表达载体 pET28b-Deh。将构建的胞内表达载体 pET28b-Deh 电转化至大肠杆菌 BL21 （Invitrogen）中，涂平板 37 下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图 4。 0053 实施例 3 ：。

27、 0054 将实施例 2、验证后的含有胞内表达重组质粒 pET28b-Deh 的重组大肠杆菌 BL21/ pET28b-Deh 分别用含有 50g/ml 卡那霉素抗性的 LB 液体培养基培养 12h，再以 1% 接种量（v/v）接种到新鲜的含有 50g/ml 卡那霉素抗性的 LB 液体培养基中，培养至菌体浓度 OD600约 0.6 左右，再向 LB 液体培养基加入终浓度为 0.5mM 的 IPTG，诱导培养 10h 后， 4、 10000rpm 离心 10min，收集含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。 0055 实施例 4 ： 0056 以实施例 3 中获得的含有胞内表达重组质粒。

28、的重组大肠杆菌 BL21/pET28b-Deh 湿菌体作为转化用酶，以 1,3- 二氯丙二醇为底物，进行转化反应制备环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下： 10mL 磷酸盐缓冲液（pH 8）中加入 0.2g 湿菌体和 0.5%（v/ v）的 1,3- 二氯丙二醇， 30摇床 150r/min 条件下反应 60 min，加入丙酮中止反应。 0057 采用气相检测环氧氯丙烷的浓度，采用气相色谱 Agilent 6890N 测定，色谱柱类型： BGB-175 毛细管柱；色谱条件：柱温 90，进样室温度 220， FID 检测器 220，氦气流量为 1.6mL/。

29、min ；分流比为 40:1。酶活单位（U）定义为：在 30、 pH 8.0 条件下，在 1min 内催化 1,3- 二氯丙二醇生成 1mol 环氧氯丙烷所需要的酶量定义为 1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表 1。 0058 表 1 ：以重组大肠杆菌 BL21/pET28b-Deh 为酶源测定的卤醇脱卤酶活力测定结果 0059 说明书 CN 102978193 A 6 5/5 页 7 菌株 / 质粒酶活 (U/g (wet cells) 大肠杆菌 BL210 大肠杆菌 BL21/pET28b 0 大肠杆菌 BL21/pET28b-Deh17.5 。

30、0060 实施例 6 ： 0061 以实施例3中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-Deh湿菌体作为转化用酶，以 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向 25 mL 烧瓶中加入 15 mL 50 mM NaH2PO4溶液， 1 g (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，水浴预热至45 C，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入4mL适当浓度的酶液或菌悬液，用NaCN控制pH在 7.7，反应30 min。取样，用等体积。

31、的乙酸乙酯萃取，操作同上，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量。 0062 反应液中 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯和 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为 Agilent 7890A，所用毛细管柱型号为 HP-5 ( 柱长 30 m，内径 0.25 mm，液膜厚度 0.25 m，填料为 5% Phenyl/95% dimethylpolysiloxane)，进样口温度为230 C，检测器温度为250 C，柱温165 C。载气为氮气，流速1.5 mL/min。 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯和 (R。

32、)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯的保留时间分别为 3.02 min 和 3.49 min。 0063 表 2 ：以重组大肠杆菌 BL21/pET28b-Deh 为酶源测定的卤醇脱卤酶活力测定结果 0064 菌株 / 质粒酶活 (U/g (wet cells) 大肠杆菌 BL210 大肠杆菌 BL21/pET28b 0 大肠杆菌 BL21/pET28b-Deh5.1 0065 由以上实验结果可知，本发明得到的含有卤醇脱卤酶基因的重组大肠杆菌具有一定的卤醇脱卤酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。卤醇脱卤酶（SED ID NO. 2）作为转化用酶，可以以。

33、 1,3- 二氯丙二醇、 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯为底物，进行生物催化与转化制备环氧氯丙烷和 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸乙酯。说明书 CN 102978193 A 7 1/3 页 8 0001 0002 序列表 CN 102978193 A 8 2/3 页 9 0003 序列表 CN 102978193 A 9 3/3 页 10 序列表 CN 102978193 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说明书附图 CN 102978193 A 11 2/2 页 12 图 3 图 4 图 5 说明书附图 CN 102978193 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201210455315.6	申请日：	2012.11.13
公开号：	CN102978193A	公开日：	2013.03.20
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/88申请日:20121113\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N9/88; C12N15/60; C12N1/14; C12N15/63; C12N15/70; C12P17/02; C12P13/00; C12R1/645(2006.01)N	主分类号：	C12N9/88
申请人：	浙江工业大学
发明人：	郑裕国; 薛锋; 柳志强; 万南微; 高爱存; 沈寅初
地址：	310014 浙江省杭州市下城区潮王路18号
优先权：
专利代理机构：	杭州天正专利事务所有限公司 33201	代理人：	黄美娟;冷红梅
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内容摘要

本发明提供了一种源自壤霉菌（Agromyces sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。该卤醇脱卤酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因序列如如SEQ ID NO.1所示。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC No：M 2012299的卤醇脱卤酶及其编码基因；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28b-Deh，再转化至大肠杆菌BL21中，获得再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有卤醇脱卤酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物转化与催化。

权利要求书

权利要求书一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码权利要求1所述卤醇脱卤酶的基因。
如权利要求2所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。
如权利要求2所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC No：M 2012299。
壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
一种含有权利要求2所述卤醇脱卤酶基因的重组载体。
权利要求2所述的基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用。
如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有SEQ ID NO.1所示卤醇脱卤酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。
权利要求1所述卤醇脱卤酶在微生物转化1,3‑二氯丙二醇制备环氧氯丙烷中的应用。
权利要求1所述卤醇脱卤酶在微生物转化 (S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯制备 (R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用。

说明书

说明书卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用
（一）技术领域
本发明涉及一种卤醇脱卤酶、编码基因及载体，产卤醇脱卤酶的新菌株，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用。
（二）背景技术
卤醇脱卤酶，也叫卤醇‑卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解有机卤化合物的关键酶之一。根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC 3类。有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于排废以及人工合成卤化物的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物和脱卤酶降解有机卤化物已引起人们广泛的关注，在环境污染治理，特别是手性环氧化物合成方面等具有十分重要的作用。
卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低络氨酸的pKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶不但可以催化碳‑卤键的断裂进行脱卤反应，可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N3‑、NO2‑、CN‑等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的β‑取代醇。因此可以用来合成一些非自然手性化合物。
卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及β‑取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。
近年，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，如Agrobacterium radiobacter AD1，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N‑1074，Agrobacterium tumefaciens，Arthrobacter erithii H10a，Alcaligenes sp. DS‑K‑S38 ，Pseudomonas sp. DS‑k‑2DI 等。部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化形成环氧化合物及β‑取代醇。但是对已有卤醇脱卤酶进行研究的同时，挖掘新的的微生物来源的卤醇脱卤酶基因仍是今后研究的热点。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种源自壤霉菌（Agromyces sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及编码所述卤醇脱卤酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO：1所示。
该卤醇脱卤酶基因由如下方法得到：利用硫酸铵沉淀和离子交换等分离纯化手段从壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC NO：M 2012299菌株中分离纯化得到脱卤酶蛋白，经过N端序列测序和肽指纹图谱分析，发现该酶与Arthrobacter sp. AD2 和 Corynebacterium sp. N‑1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此设计引物。利用PCR技术，在引物1（ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC）、引物2（TTAGGGCAGATAGCC ACCG）的作用下以来源于壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC NO：M 2012299菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约0.75kb的卤醇脱卤酶基因片段。将该片段连接到pMD18‑T载体上获得克隆载体pMD18‑T‑Deh和转化了pMD18‑T‑Deh的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为735bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为（SEQ ID NO.1）：
1      ATGCGCATCG CCCTCGTGAC TCATGCACGG CATTTTGCAG GCCCCGCCGC CGTCGAGGCG
61     CTTACGCGGG ATGGCTATAC CGTGGTTTGC CACGACGCGA GCTTCGCTGA TGCAGCTGAA
121    CGACAGCGTT TCGAGTCGGA GAACCCGGGC ACCATCGCGC TCGCCGAGCA GAAGCCCGAG
181    CGTCTGGTCG ACGCCACGCT GCAGTACGGG GAAGCGATCG ACACGATCGT CTCGAACGAT
241    TACATTCCGC GCCCGATGAA TCGGCTCCCG ATCGAGGGAA CGAGCGAGGC CGACATCCGA
301    CAGATGTTCG AGGCGCTCAG CATCTTCCCG ATCCTGCTCC TGCAGTCGGC CATCGCGCCG
361    CTACGGGCTG CAGGCGGCGC CTCCGTTATC TTCATCACGT CCTCGGTTGG CAAGAAGCCG
421    CTCGCCTACA ACCCTCTCTA TGGGCCCGCG CGCGCCGCTA CCGTCGCGCT TGTCGAATCG
481    GCAGCGAAGA CGCTGTCCCG TGACGGAATC TTGCTCTATG CGATCGGTCC GAACTTCTTC
541    AACAACCCGA CGTACTTCCC GACGTCGGAT TGGGAGAACG ACCCCGAGCT CCGGGATCGT
601    GTCGAGCGGG ACGTGCCGCT CGGTCGCCTC GGCCGTCCGG ACGAGATGGG TGCGCTGATC
661    ACCTTCCTCG CTTCGCGTCG TGCAGCGCCC ATCGTGGGGC AGTTCTTCGC TTTCACCGGT
721    GGCTATCTGC CCTAA
利用软件对该基因序列进行分析，推知所述卤醇脱卤酶基因编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列：
1      MRIALVTHAR HFAGPAAVEA LTRDGYTVVC HDASFADAAE RQRFESENPG TIALAEQKPE
61     RLVDATLQYG EAIDTIVSND YIPRPMNRLP IEGTSEADIR QMFEALSIFP ILLLQSAIAP
121    LRAAGGASVI FITSSVGKKP LAYNPLYGPA RAATVALVES AAKTLSRDGI LLYAIGPNFF
181    NNPTYFPTSD WENDPELRDR VERDVPLGRL GRPDEMGALI TFLASRRAAP IVGQFFAFTG
241    GYLP
本发明所述基因源自壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC No：M 2012299。
本发明还涉及一株产卤醇脱卤酶的新菌株——壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
本发明还涉及一种含有所述卤醇脱卤酶基因的重组载体，以及利用该重组载体转化获得的基因工程菌。
本发明还涉及所述的基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用。
本申请发明人根据测序结果设计胞内表达引物3（CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C）和引物4（CCGCTCGAGTTAGGGCAGATA GCCACCG），以克隆载体pMD18‑T‑Deh为模板，通过PCR扩增得到了用于表达的卤醇脱卤酶基因。将卤醇脱卤酶基因同表达载体pET28b 连接，构建了含有卤醇脱卤酶基因的表达重组质粒pET28b‑Deh。
将胞内表达重组质粒pET28b‑Deh转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有重组质粒pET28b‑Deh的重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh，以重组菌为酶源可进行生物催化与转化。
具体的，所述的应用为：构建含有SEQ ID NO：1所示卤醇脱卤酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。
本发明还涉及所述卤醇脱卤酶在微生物转化1,3‑二氯丙二醇制备环氧氯丙烷中的应用。
本发明还涉及所述卤醇脱卤酶（SEQ ID NO：2）在微生物转化 (S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯制备 (R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC No：M 2012299的卤醇脱卤酶及其编码基因；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28b‑Deh，再转化至大肠杆菌BL21中，获得再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有卤醇脱卤酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物转化与催化。本发明卤醇脱卤酶作为转化用酶，以1,3‑二氯丙二醇、(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯等为底物，可以进行转化反应制备环氧氯丙烷、(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯等。
（四）附图说明
图1为克隆载体pMD18‑T‑Deh物理图谱；
图2 为pET28b‑Deh重组质粒物理图谱；
图 3为卤醇脱卤酶基因PCR扩增 argrose 电泳图；其中，2~5为利用引物1和引物2扩增得到的卤醇脱卤酶基因片段；1为 DL2000 DNA Marker；
图4阳性重组质粒pET28b‑Deh的酶切结构图；其中，1 为λDNA/HindⅢ DNA Marker；2为pET28b‑Deh/NdeI样品；3为pET28b‑Deh/Xho I样品；4为pET28b‑Deh/Nde I and XhoI样品；5 为DL 2000 DNA Marker片段。
图5 为卤醇脱卤酶SDS‑PAGE 图；1：IPTG 诱导的E.coli BL21/pET28b‑Deh；2：未诱导的E.coli BL21/pET28b‑Deh；3：E.coli BL21, 4：蛋白质分子量 Marker。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
用核酸快速提取仪提取壤霉菌（Agromyces sp.）CCTCC No：M 2012299菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1（ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC）和引物2（TTAGGGCAGATAGCC ACCG）的作用下进行PCR扩增。
PCR反应体系各组分加入量（总体积100μL）：10×Pfu  DNA Polymerase Buffer 10μL(Mg2+)，10mM dNTP mixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM）0.5μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu Taq DNA Polymerase 1μL，无核酸水86.5μL。
采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃ 3min，然后进入温度循环94℃ 30s，60℃ 30 s，72℃ 1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为8℃。
取10μL PCR反应液用0.9%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3在750bp左右出现明显条带。切胶回收该片段并纯化，直接同T 载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18‑T‑Deh（质粒图谱参见图1）。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为735bp（SEQ ID NO：1），该序列编码一个完整的开放阅读框。
实施例2：
根据实施例1分析结果设计引物3（CGCCATATGCGCATCGCCCTC GTGACTC）和引物4（CCGCTCGAG TTAGGGCAGATAGCCACCG），并分别在引物3和引物4中引入了Nde I和XhoI限制性酶切位点。在引物4和引物4的引发下，利用高保真Pfu DNA 聚合酶（fermentas）进行扩增，获得长为735bp的卤醇脱卤酶基因片段（SEQ ID NO：1），测序后利用Nde I和XhoI限制性内切酶（fermentas）对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA 连接酶（TaKaRa）将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b进行连接，构建表达载体pET28b‑Deh。将构建的胞内表达载体pET28b‑Deh电转化至大肠杆菌BL21（Invitrogen）中，涂平板37℃下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图4。
实施例3：
将实施例2、验证后的含有胞内表达重组质粒pET28b‑Deh的重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh分别用含有50μg/ml 卡那霉素抗性的LB液体培养基培养12h，再以1%接种量（v/v）接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导培养10h后，4℃、10000rpm离心10min，收集含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。
实施例4：
以实施例3中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh湿菌体作为转化用酶，以1,3‑二氯丙二醇为底物，进行转化反应制备环氧氯丙烷。转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液（pH 8）中加入0.2g湿菌体和0.5%（v/ v）的1,3‑二氯丙二醇，30℃摇床150r/min条件下反应60 min，加入丙酮中止反应。
采用气相检测环氧氯丙烷的浓度，采用气相色谱Agilent 6890N测定，色谱柱类型：BGB‑175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为 40:1。酶活单位（U）定义为：在30℃、pH 8.0条件下，在1min内催化1,3‑二氯丙二醇生成1µmol 环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表1。
表1：以重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh为酶源测定的卤醇脱卤酶活力测定结果
菌株/质粒酶活(U/g (wet cells))大肠杆菌BL210大肠杆菌BL21/pET28b 0大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh17.5
实施例6：
以实施例3中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh湿菌体作为转化用酶，以(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向25 mL烧瓶中加入15 mL 50 mM NaH2PO4溶液，1 g (S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，水浴预热至45 ˚C，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入4mL适当浓度的酶液或菌悬液，用NaCN控制pH在7.7，反应30 min。取样，用等体积的乙酸乙酯萃取，操作同上，气相检测(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯含量。
反应液中(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯和(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为Agilent 7890A，所用毛细管柱型号为HP‑5 (柱长 30 m，内径 0.25 mm，液膜厚度0.25 μm，填料为5% Phenyl/95% dimethylpolysiloxane)，进样口温度为230 ˚C，检测器温度为250 ˚C，柱温165 ˚C。载气为氮气，流速1.5 mL/min。(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯和(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯的保留时间分别为3.02 min和3.49 min。
表2：以重组大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh为酶源测定的卤醇脱卤酶活力测定结果
菌株/质粒酶活(U/g (wet cells))大肠杆菌BL210大肠杆菌BL21/pET28b 0大肠杆菌BL21/pET28b‑Deh5.1
由以上实验结果可知，本发明得到的含有卤醇脱卤酶基因的重组大肠杆菌具有一定的卤醇脱卤酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。卤醇脱卤酶（SED ID NO. 2）作为转化用酶，可以以1,3‑二氯丙二醇、(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯为底物，进行生物催化与转化制备环氧氯丙烷和(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯。