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1、(10)申请公布号 CN 102994486 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994486 A *CN102994486A* (21)申请号 201210477657.8 (22)申请日 2004.10.22 DSM15940 2003.09.22 PA200301562 2003.10.23 DK 200480031211.6 2004.10.22 C12N 9/58(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(200。
2、6.01) C11D 3/386(2006.01) (71)申请人 诺维信公司 地址 丹麦鲍斯韦 (72)发明人 吴文平 K.V. 约库姆森 M.A. 斯特林格 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 史悦 (54) 发明名称 在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶 (57) 摘要 本发明涉及在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋 白酶。 具体地， 本发明涉及在洗涤剂组合物稳定性 改善的蛋白酶。 此外， 本发明涉及包含本发明蛋白 酶的清洁组合物或洗涤剂组合物以及此蛋白酶在 洗涤剂组合物中的用途。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 。
3、权利要求书 2 页 说明书 37 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 37 页 序列表 3 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 选自下列的蛋白酶 ： a.包含与如SEQ ID NO:2的第1-226位氨基酸所示氨基酸序列具有至少73%同一性的 氨基酸序列的蛋白酶 ； 和 b. 由在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列所编码的蛋白酶 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 127-804 位核苷酸所示核酸序列的互补链， 或 (ii) 至少 100 个核苷酸的 (i) 的亚序列 ； 和 c. 与如 SE。
4、Q ID NO:2 的第 1-266 位氨基酸所示氨基酸序列相比具有 1-50、 优选 1-40 或 1-30、 更优选 1-20、 最优选 1-10 个氨基酸替代的蛋白酶。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶具有与如 SEQ ID NO:2 的第 1-226 位氨基酸所示氨基酸序列具有大于75.0%、 或大于80.0%、 或大于85.0%、 或大于90.0%、 或大 于92.0%、 或大于94.0%、 或大于96.0%、 或大于97.0%、 或大于98.0%、 或大于99.0%同一性的 氨基酸序列。 3. 根据权利要求 1 所述的蛋白酶， 其包含如 SEQ ID NO:2。
5、 的第 1-226 位氨基酸所示的 氨基酸序列。 4. 根据权利要求 1 所述的蛋白酶， 其由如 SEQ ID NO:2 的第 1-226 位氨基酸所示的氨 基酸序列组成。 5. 根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶是具有如 SEQ ID NO:2 的第 -25-226 位氨基酸所示氨基酸序列的蛋白酶的变体， 所述变体包含一个或多个氨 基酸残基的替代、 缺失和 / 或插入。 6. 蛋白酶或其变体， 其中所述蛋白酶由克隆入在大肠杆菌 (Escherichiacoli)DSM 15940 中存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分所编码， 所述变体与所述蛋白酶 的成熟部分具有。
6、大于 73% 的同一性。 7. 根据权利要求 6 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶与多核苷酸的蛋白酶编码部分编 码的蛋白酶成熟部分具有大于 75.0%、 或大于 80.0%、 或大于 85.0%、 或大于 90.0%、 或大于 92.0%、 或大于 94.0%、 或大于 96.0%、 或大于 97.0%、 或大于 98.0%、 或大于 99.0% 的同一性， 其中所述多核苷酸被克隆入在保藏号 DSM 15940 的大肠杆菌中存在的质粒片段内。 8. 根据权利要求 6 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶包含由克隆入在大肠杆菌 DSM 15940 中存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分编码的蛋白酶。
7、。 9. 根据权利要求 6 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶由克隆入在大肠杆菌 DSM 15940 中 存在的质粒片段内的多核苷酸的蛋白酶编码部分所编码的蛋白酶组成。 10. 根据权利要求 1 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶由在中等严格条件下、 优选在高严 格条件下与下列序列杂交的核酸序列编码 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 127-804 位核苷酸所示核酸序列的互补链， 或 (ii) 至少 100 个核苷酸的 (i) 的亚序列。 11. 根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白 酶。 12. 根据前述权利要求中任意一项所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶。
8、在 35贮藏后具有 至少 50% 的残余活性， 其中活性测定是按照 “实施例 V 洗涤剂中的稳定性” 所述测试的。 13. 根据权利要求 11 所述的蛋白酶， 其中所述蛋白酶在 35贮藏后具有至少 55% 的残 权 利 要 求 书 CN 102994486 A 2 2/2 页 3 余活性， 例如在35贮藏后具有至少60%的残余活性， 更优选地在35贮藏后具有至少65% 的残余活性。 14. 所分离的核酸序列， 其中所述核酸序列包含编码前述权利要求中任意一项所定义 蛋白酶的核酸序列。 15. 编码蛋白酶的所分离核酸序列， 其中所述核酸序列选自 ： a. 与如 SEQ NO:1 的第 52-804。
9、 位核苷酸所示核酸序列具有至少 80% 同一性的核酸序 列 ； 和 b. 在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列 ： (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 52-804 位核苷酸所示核酸序列的互补链 ； 或 (ii) 至少 100 个核苷酸的 (i) 的亚序列。 16. 根据权利要求 14 所述的核酸序列， 其中所述核酸序列具有与如 SEQID NO:1 的第 52-804位核苷酸所示核酸序列具有至少86%， 诸如至少87%， 例如至少88%， 优选至少89%， 诸 如至少 90%， 例如至少 91%， 更优选至少 92%， 诸如至少 93%， 例如至少 94%， 最优选至少 95%， 诸。
10、如至少 96%， 例如至少 97%， 具体而言至少 98%， 优选至少 99% 同一性的核酸序列。 17. 包含权利要求 14-16 中任意一项所述的核酸序列的核酸构建体， 其中所述核酸构 建体与能够指导蛋白酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。 18. 重组表达载体， 其中所述重组表达载体包含权利要求 17 的核酸构建体、 启动子和 转录终止信号以及翻译终止信号。 19. 重组宿主细胞， 其中所述重组宿主细胞包含权利要求 17 的核酸构建体。 20. 根据权利要求 19 所述的宿主细胞， 其为真菌或酵母， 优选为丝状真菌， 尤其为曲霉 属 (Aspergillus)。 21. 根据。
11、权利要求 20 所述的宿主细胞， 其为米曲霉 (Aspergillus oryzae)。 22.根据权利要求19所述的宿主细胞， 其为细菌， 优选为芽孢杆菌属(Bacillus)， 尤其 为迟缓芽孢杆菌 (Bacillus lentus)。 23. 用于生产根据权利要求 1-13 中任意一项所述蛋白酶的方法， 所述方法包括 ： a. 在可诱导蛋白酶产生的条件下培养如权利要求 19-22 中任意一项所定义的重组宿 主细胞 ； 和 b. 回收蛋白酶。 24. 清洁组合物或洗涤剂组合物， 优选衣物洗涤组合物或洗碟组合物， 其包含根据权利 要求 1-13 中任意一项所述的蛋白酶。 25. 根据权利要求。
12、 24 所述的组合物， 其额外包含纤维素酶、 脂肪酶、 角质酶、 氧化还原 酶、 另外的蛋白酶、 淀粉酶或其混合物。 26. 如权利要求 1-13 中任意一项所定义蛋白酶在清洁组合物或洗涤剂组合物中的用 途。 27. 用于清洁或洗涤硬质表面或衣物的方法， 所述方法包括将硬质表面或衣物与权利 要求 25-26 中所定义的组合物接触。 权 利 要 求 书 CN 102994486 A 3 1/37 页 4 在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶 0001 本发明申请是基于申请日为 2004 年 10 月 22 日， 申请号为 200480031211.6( 国际 申请号为 PCT/DK2004/0007。
13、30)， 名称为 “在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶” 的发明专利 申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及具有在洗涤剂组合物中改善稳定性的蛋白酶。 本发明还涉及编码所述 蛋白酶的分离多核苷酸、 核酸构建体、 重组表达载体、 包含所述核酸构建体的宿主细胞和用 于生产和使用本发明蛋白酶的方法。此外， 本发明涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物和 洗涤剂组合物以及涉及所述蛋白酶在洗涤剂组合物中的用途。 0003 发明背景 0004 在洗涤剂工业中， 向洗涤配方中添加酶的应用已超过 30 年。用于此类配方的酶包 括蛋白酶、 脂肪酶、 淀粉酶、 纤维素酶、 甘露糖苷酶以及其它酶或其混合物。 商业上。
14、最重要的 酶是蛋白酶。 0005 在 本 领 域 内， 例 如 在 EP 130756(GENENTECH)( 对 应 于 美 国 再 公 告 专 利 号 34,606(GENENCOR) ； EP 214435(HENKEL) ； WO 87/04461(AMGEN) ； WO 87/05050(GENEX) ； EP 260105(GENENCOR) ； Thomas、 Russell 和 Fersht(1985)Nature 318 375-376 ； Thomas、 Russell 和 Fersht(1987)J.Mol.Biol.193803-813 ； Russel 和 Fersh。
15、t Nature 328 496-500(1987) ； WO 88/08028(Genex) ； WO 88/08033(Amgen) ； WO 95/27049(SOLVAY S.A.) ； WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE 公 司 ) ； WO 95/30010(PROCTER&GAMBLE 公 司 ) ； WO 95/29979(PROCTER&GAMBLE 公司 ) ； US 5.543.302(SOLVAY S.A.) ； EP 251 446(GENENCOR) ； WO 89/06279(NOVOZYMES A/S) ； WO 91/00345(NOVOZY。
16、MES A/S) ； EP 525 610 A1(SOLVAY) ； WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.) 公开了为数众多的此类蛋白酶变体。 0006 WO 89/06270(Novozymes A/S) 公开了包含有限底物特异性蛋白酶的洗涤剂组合 物， 其中所述蛋白酶是能够断裂赖氨酸或精氨酸的 C- 末端侧肽键的胰蛋白酶样蛋白酶。 0007 而 WO 94/25583 公开了编码镰孢霉属 (Fusarium) 胰蛋白酶样蛋白酶 DNA 序列的 克隆并且从所述 DNA 序列中获得了活性胰蛋白酶样蛋白酶的表达。 0008 然而， 即便已经描述了众多有用的蛋白酶和蛋白酶变。
17、体， 但是为了众多的工业用 途仍需要进一步改善蛋白酶或蛋白酶变体。 0009 具体而言， 由于洗涤剂中存在的物质往往会降低蛋白酶的稳定性， 所以蛋白酶在 洗涤剂中的稳定性问题已经变得尤其明显。 0010 因此， 本发明的目标是提供改良的蛋白酶， 所述蛋白酶适用于例如洗衣房和 / 或 硬质表面清洁的洗涤剂中。 0011 发明简述 0012 本发明在第一个方面涉及具有在洗涤剂中稳定性改善的蛋白酶， 所述蛋白酶选自 0013 a.具有与如SEQ ID NO:2的第1-266位氨基酸所示氨基酸序列至少73%同一性的 氨基酸序列的蛋白酶 ； 说 明 书 CN 102994486 A 4 2/37 页 5。
18、 0014 b. 由在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列所编码的蛋白酶 ： 0015 (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 127-804 位核苷酸所示的核酸序列的互补链， 或 0016 (ii) 至少 100 个核苷酸的 (i) 的亚序列 ； 以及 0017 c. 与如 SEQ ID NO:2 的第 1-266 位氨基酸所示氨基酸序列相比具有 1-50、 优选 1-40 或 1-30、 更优选 1-20、 最优选 1-10 个氨基酸替代的蛋白酶。 0018 本发明在第二个方面涉及包含编码本发明蛋白酶的核酸序列的分离多核苷酸。 0019 本发明在第三个方面涉及编码蛋白酶的分离多核苷酸， 。
19、所述多核苷酸选自 ： 0020 a. 具有与如 SEQ ID NO:1 的第 52-804 位核苷酸所示核酸序列至少 80% 同一性的 核酸序列 ； 和 0021 b. 在低严格条件下与下列序列杂交的核酸序列 ： 0022 (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 52-804 位核苷酸所示核酸序列的互补链 ； 或 0023 (ii) 至少 100 个核苷酸的 (i) 的亚序列。 0024 本发明在第四个方面涉及包含本发明核酸序列的核酸构建体， 其中所述核酸序列 与能够指导蛋白酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。 0025 本发明在第五个方面涉及包含本发明核酸构建体、 启动子和转录。
20、终止信号及翻译 终止信号的重组表达载体。 0026 本发明在第六个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。 0027 本发明在第七个方面涉及生产本发明蛋白酶的方法， 所述方法包括 ： 0028 (a) 在诱导产生所述蛋白酶的条件下培养本发明重组宿主细胞 ； 和 0029 (b) 回收蛋白酶。 0030 本发明在第八个方面涉及包含本发明蛋白酶的清洁组合物或洗涤剂组合物、 优选 衣物洗涤组合物或洗碟组合物。 0031 本发明的另一些方面涉及本发明蛋白酶在清洁组合物或洗涤剂组合物中的用途 ； 用于清洁或洗涤硬质表面或衣物的方法， 所述方法包括将硬质表面或衣物与本发明组合物 接触。 0032 定义。
21、 0033 在更详细讨论本发明之前， 首先定义如下术语和惯例。 0034 氨基酸的命名 0035 A Ala 丙氨酸 0036 V Val 缬氨酸 0037 L Leu 亮氨酸 0038 I Ile 异亮氨酸 0039 P Pro 脯氨酸 0040 F Phe 苯丙氨酸 0041 W Trp 色氨酸 0042 M Met 甲硫氨酸 0043 G Gly 甘氨酸 0044 S Ser 丝氨酸 0045 T Thr 苏氨酸 说 明 书 CN 102994486 A 5 3/37 页 6 0046 C Cys 半胱氨酸 0047 Y Tyr 酪氨酸 0048 N Asn 天冬酰胺 0049 Q Gl。
22、n 谷氨酰胺 0050 D Asp 天冬氨酸 0051 E Glu 谷氨酸 0052 K Lys 赖氨酸 0053 R Arg 精氨酸 0054 H His 组氨酸 0055 X Xaa 任意氨基酸 0056 核酸的命名 0057 A 腺嘌呤 0058 G 鸟嘌呤 0059 C 胞嘧啶 0060 T 胸腺嘧啶 ( 仅在 DNA 中 ) 0061 U 尿嘧啶 ( 仅在 RNA 中 ) 0062 蛋白酶 0063 将断裂蛋白质底物中酰胺键的酶归类为蛋白酶或(可互换地为)肽酶(见Walsh， 1979， Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H.Freeman and Co。
23、mpany， San Francisco， 第 3 章 )。 0064 丝氨酸蛋白酶 0065 丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在酶的活性位点内存在一个必需丝氨酸 残 基 的 酶 (White， Handler 和 Smith， 1973，“Principles of Biochemistry” ， 第 五 版， McGraw-Hill Book Company， NY， 第 271-272 页 )。 0066 细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为 20,000-45,000 道尔顿。它们可被二异丙基氟 磷酸抑制。 细菌丝氨酸蛋白酶水解单纯末端酯并且其活性类似于同样为丝氨酸蛋白酶的真 核胰凝乳蛋白酶。。
24、更狭义的术语碱性蛋白酶则含盖一个亚类， 其反映某些丝氨酸蛋白酶具 有高的最佳 pH(9.0-11.0)( 综述见 Priest(1977)Bacteriological Rev.41 711-753)。 0067 胰蛋白酶样蛋白酶 0068 术语 “胰蛋白酶样蛋白酶” 在本上下文中旨在指具有类似于胰蛋白酶活性的蛋白 酶， 即能够断裂位于赖氨酸或精氨酸的 C 末端侧肽键的酶。如在以下材料和方法部分中实 施例 IV 所述， 基于胰蛋白酶底物断裂的测定法测定胰蛋白酶样蛋白酶活性。 0069 母体蛋白酶 0070 母体蛋白酶可以是从自然来源分离的蛋白酶， 其中可以在保留蛋白酶特征的同 时对此蛋白酶进行。
25、后续修饰。而且， 母体蛋白酶还可以是通过如 J.E.Ness 等， Nature Biotechnology， 17， 893-896(1999)所描述的DNA改组技术制备的蛋白酶。 备选地， 术语 “母 体蛋白酶” 可称作 “野生型蛋白酶” 。 0071 蛋白酶的修饰 0072 将此处所用的术语 “修饰” 定义为包括蛋白酶的化学性修饰以及编码蛋白酶的 DNA 说 明 书 CN 102994486 A 6 4/37 页 7 的遗传操作。所述修饰可以是氨基酸侧链替换、 在目的氨基酸处的替代、 缺失和 / 或插入。 0073 蛋白酶变体 0074 在本发明的上下文中， 术语蛋白酶变体或已突变的蛋白。
26、酶意指一种由表达突变基 因的生物产生的蛋白酶， 其中所述突变基因源自拥有原始基因或母体基因并且产生相应母 体酶的母体微生物， 为了能够在宿主中表达时产生该突变蛋白酶已经将母体基因突变成为 突变基因。类似地， 突变基因还可源自经 DNA 改组技术产生的母体基因。 0075 同源蛋白酶序列 0076 在本上下文中， 两种氨基酸序列之间的同源性由参数 “同一性” 描述。 0077 为了确定两种蛋白酶之间的同一性程度， 可应用默认设置的 Vector NTI 程序包 v8的AlignX应用的GAP程序。 来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两种序列间 “同 一性百分数” 。 0078 基于此描述， 。
27、本领域熟练技术人员可以常规鉴定根据本发明可修饰的适宜同源蛋 白酶和相应的同源活性位点环区域。 0079 分离多核苷酸 0080 如此处所用， 术语 “分离多核苷酸” 指已经分离和纯化并且因此处于适用于遗传工 程蛋白质生产系统形式的多核苷酸。此类分离分子可以是从其天然环境中分离的那些分 子， 并且包括cDNA克隆和基因组克隆以及源自DNA改组实验或源自位点定向自然发生实验 的多核苷酸。本发明的分离多核苷酸不含通常与之结合的其它基因， 但可包含 5 和 3 非 翻译区 , 如启动子和终止子。鉴定所结合的区域对于本领域的普通技术人员而言是轻而易 举的 ( 见例如 Dynan 和 Tijan， Nat。
28、ure 316:774-78， 1985)。术语 “分离核酸序列” 可备选地 称作 “分离 DNA 序列” 、“克隆核酸序列” 或 “克隆 DNA 序列” 。 0081 分离蛋白质 0082 当术语 “分离的” 应用于蛋白质时表明该蛋白质已经脱离了其天然环境。 0083 在一个优选的方式中， 分离蛋白质基本不含其它蛋白质， 尤其是其它同源蛋白质 ( 即 “同源杂质” ( 见下 )。 0084 如通过 SDS-PAGE 所确定， 分离蛋白质纯度大于 10%、 优选大于 20%、 更优选大于 30%。 此外， 优选提供如通过SDS-PAGE所确定的高度纯化形式的蛋白质， 即纯度大于40%、 大 于。
29、 60%、 大于 80%， 更优选大于 95% 并且最优选大于 99%。 0085 术语 “分离蛋白质” 可备选地称作 “纯化蛋白质” 。 0086 同源杂质 0087 术语 “同源杂质” 意指源自最初获得本发明蛋白酶的同源细胞中的任何杂质 ( 例 如除本发明蛋白酶之外的另外的多肽 )。 0088 获得自 0089 如此处所使用的与特定微生物来源有关的术语 “获得自” 意指由特定来源产生的 或由所来源基因已经插入的细胞产生的多核苷酸和 / 或蛋白酶。 0090 底物 0091 如此处所使用的与蛋白酶的底物有关的术语 “底物” 应当解释为该术语的最广义 形式， 如包括包含至少一种对蛋白酶水解敏感。
30、的肽键的化合物。 0092 产物 说 明 书 CN 102994486 A 7 5/37 页 8 0093 如所使用的与源自蛋白酶的酶反应产物有关的术语 “产物” 在本发明的上下文中 应当解释为包括涉及蛋白酶的水解反应的产物。产物可以为后续水解反应中的底物。 0094 洗涤性能 0095 在本上下文中， 术语 “洗涤性能” 用作表示酶在例如洗涤或硬质表面清洁过程中去 除污迹、 特别是所清除物体上的蛋迹的能力。 还可参见实施例VII中的 “模式洗涤剂洗涤性 能测试” 。 0096 附图简述 0097 图 1 描述了本发明蛋白酶的抑制谱图。 0098 图 2 描述了本发明蛋白酶的底物特异性。 00。
31、99 图 3 描述了本发明蛋白酶的温度谱图。 0100 图 4 描述了如 DMC 测定法所测定的本发明蛋白酶的 pH 谱图。 0101 图 5 描述了如 ACZL- 酪蛋白 - 测定法所测定的本发明蛋白酶的 pH 谱图。 0102 图 6 描述了本发明蛋白酶的 pH- 稳定性谱图。 0103 发明详述 0104 在本发明第一个引起关注的方面， 具有改善稳定性的胰蛋白酶样蛋白酶是与如 SEQ ID NO:2(即成熟蛋白酶)的第1-266位氨基酸所示的氨基酸序列具有至少73%同一性 的分离蛋白酶。 0105 在一个引起关注的实施方案中， 本发明的蛋白酶与如 SEQ ID NO:2 的第 1-266。
32、 位 氨基酸所示氨基酸序列具有大于75%、 或大于80%、 或大于85%、 或大于90%、 或大于92%、 或大 于 94%、 或大于 96%、 或大于 97%、 或大于 98%、 或大于 99% 的同一性。 0106 在另一个引起关注的方面， 所述蛋白酶是具有如 SEQ ID NO:2 的第 -25-266 位氨 基酸所示氨基酸序列的蛋白酶变体， 所述蛋白酶变体包含一个或多个氨基酸残基的替代、 缺失和 / 或插入。 0107 序列比对和同一性值的计算可以使用对蛋白质和 DNA 比对均有用的完全 Smith-Waterman 比对进行。氨基酸序列可以使用默认设置的 Vector NTI 程序包。
33、 v8 的 AlignX 应用程序比对， 该应用程序使用改进 ClustalW 算法 (Thompson,J.D.， Higgins,D. G. 和 Gibson T.J.， 1994)、 blosum62mt2 得分矩阵、 开口罚分 10 和缺口延伸罚分 0.1。 0108 通过对具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白酶的氨基酸序列与认为是现有技术最 接近蛋白酶的氨基酸序列之间进行此种比对， 发现了同一性为 73% 的成熟蛋白质。 0109 在本发明另一个引起关注的实施方案中， 分离蛋白酶由这样的核酸序列编码， 其 中所述核酸序列在低严格条件下、 优选在中等严格条件下、 更优选在高严格条。
34、件下与 (i) 如 SEQ ID NO:1 的第 127-804 位核苷酸所示核酸序列的互补链， 或 (ii) 至少 100 个核苷酸 的(i)的亚序列杂交(J.Sambrook， E.F.Fritsch和T.Maniatus， 1989， Molecular Cloning， A Laboratory Manual， 第二版， ColdSpring Harbor， New York)。 0110 如SEQ ID NO:1的第127-804位核苷酸所示核酸序列互补链的亚序列可以为至少 100 个核苷酸或优选至少 200 个核苷酸、 或至少 300 个核苷酸， 或至少 400 个核苷酸。而且， 。
35、亚序列应当编码具有蛋白水解活性的蛋白酶片段。 蛋白酶还可以是具有蛋白水解活性的蛋 白酶等位基因变体或片段。 0111 SEQ ID NO:1 的核酸序列或其亚序列以及 SEQ ID NO:2 的氨基酸序列或其片段可 说 明 书 CN 102994486 A 8 6/37 页 9 用于设计核酸探针， 以便根据本领域众所周知的方法从不同属或种的株系中鉴定和克隆编 码具有蛋白水解活性的subtilase的DNA。 具体而言， 此类探针可用于在标准DNA印迹方法 中与目的属或种的基因组 DNA 或 cDNA 杂交以便鉴定和分离其相应基因。此类探针比完整 序列明显较短， 但长度应该至少 15 个、 优选。
36、 25 个并且更优选 35 个核苷酸。还可使用更长 的探针。DNA 探针和 RNA 探针均可使用。探针一般是标记的以便用于检测相应基因 ( 例如 用 32P、3H、35S、 生物素或抗生物素蛋白标记 )。此类探针包括于本发明中。 0112 因此， 从其它此类生物中制备的基因组DNA文库或cDNA文库可筛选与上述探针杂 交并且编码本发明 subtilase 的 DNA。来自其它此类生物的基因组 DNA 或其它 DNA 可以通 过熟练技术人员所知的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其它分离技术分离。 来自文库的 DNA 或分离 DNA 可以转移并固定在硝酸纤维素或其它适宜载体材料上。为了鉴定与 SEQ。
37、 ID NO:1 或其亚序列同源的克隆或 DNA， 将所述载体材料用于 DNA 印迹。为了本发明的目的， 杂 交作用指核酸序列与对应于 SEQ ID NO:1 中所示核酸序列、 其互补链或其亚序列的标记核 酸探针在低严格条件至高严格条件下杂交。使用 X 射线胶片检测在此类条件下与核酸探针 杂交的分子。 0113 对于至少 100 个核苷酸长度的长探针， 将低严格条件至高严格条件定义为在标准 DNA 印迹方法之后于 42在 5SSPE、 0.3% SDS、 200g/ml 已剪切和变性鲑精 DNA 和 25% 甲酰胺 ( 对于低严格条件 )、 35% 甲酰胺 ( 对于中等严格条件 ) 或 50%。
38、 甲酰胺 ( 对于高严格 条件 ) 中预杂交和杂交。 0114 对于至少 100 个核苷酸长度的长探针， 载体材料用 2SSC、 0.2% SDS 于优选至少 50 ( 低严格条件 )、 更优选至少 55 ( 中等严格条件 )、 甚至更加优选 65 ( 高严格条 件 ) 下最终洗涤三次， 每次 15 分钟。 0115 对于长度大约 15 个核苷酸至大约 70 个核苷酸的短探针， 将严格条件定义为在标 准DNA印迹方法之后于低于根据Bolton和McCarthy(1962， Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) 。
39、的计算方法所计算 Tm 值 5-10的温度下， 在 0.9M NaCl、 0.09M Tris-HCl pH 7.6、 6mMEDTA、 0.5%NP-40、 1Denhardt 溶液、 1mM 焦磷酸钠、 1mM 磷酸二氢钠、 0.1mMATP 和 0.2mg/ml 酵母 RNA 中进行预杂交、 杂交和杂交后洗涤。 0116 对于长度大约 15 个核苷酸至大约 70 个核苷酸的短探针， 载体材料于低于所计算 Tm 值 5-10的温度下， 在添加 0.1%SDS 的 6SCC 中洗涤一次 (15 分钟 ) 并且用 6SCC 洗 涤两次 ( 每次 15 分钟 )。 0117 本领域众所周知， 一。
40、种氨基酸残基替换成相似氨基酸残基的所谓保守替换预期在 酶的特征上仅产生轻微改变。 0118 下表 1 列出了保守氨基酸替换的组别。 0119 表 1 0120 保守氨基酸置换 说 明 书 CN 102994486 A 9 7/37 页 10 0121 0122 因此， 在本发明又一个令人关注的实施方案中， 具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋 白酶同时具有一个或多个氨基酸残基的替代、 缺失和 / 或插入。 0123 而且， 与具有 SEQ ID NO:2 氨基酸序列的蛋白酶具有免疫化学同一性或部分免 疫化学同一性的所分离蛋白酶 ( 优选纯化形式 ) 也处于本发明范围内。免疫化学特性可 以通。
41、过众所周知的 Ouchterlony 双向免疫扩散方法由免疫交叉反应同一性检测确定。具 体而言， 根据 Harboe 和 Ingild 在 N.H.Axelsen， J.和 B.Weeks 编辑的 A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis， BlackwellScientific Publications， 1973，第 23 章或 Johnstone 和 Thorpe 的 Immuno-chemistry in Practice， Blackwell Scientific Publications， 1982( 更具体在第 27-31 页 。
42、) 所描述的方法免疫兔 ( 或其它啮齿类动物 ) 制备抗血清， 其中所述抗血清包含与具有 SEQ ID NO:2 氨基酸序列的蛋白酶表位发生免疫 反应或结合的多克隆抗体。具有免疫化学同一性的蛋白酶是与抗血清以相同方式反应的 蛋白酶， 所述的相同方式例如在使用特异免疫化学技术时沉淀完全融合、 相同的沉淀形态 学和 / 或相同的电泳迁移率。Axelsen， Bock 和在 N.H.Axelsen， J.和 B.Weeks 编 辑 的 A Manual of Quantitativeimmunoelectrophoresis， Blackwell Scientific Publications， 1。
43、973， 第 10 章中深入解释了免疫化学同一性。具有部分免疫化学同一性的 蛋白酶是与抗血清以部分相同方式反应的蛋白酶， 所述的部分相同方式例如在使用特异 免疫化学技术时沉淀的部分融合、 部分相同的沉淀形态学和 / 或部分相同的电泳迁移率。 Bock 和 Axelsen 在 N.H.Axelsen， J.和 B.Weeks 编辑的 A Manual ofQuantitative 说 明 书 CN 102994486 A 10 8/37 页 11 immunoelectrophoresis， Blackwell Scientific Publications， 1973， 第11章中描述了部 分。
44、免疫化学同一性。 0124 抗体还可以是单克隆抗体。 单克隆抗体可根据如E.Harlow和D.Lane， 编者， 1988， Antibodies， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press， ColdSpring Harbor， New York 的方法制备和使用。 0125 本发明人分离了编码具有如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的subtilase的基因 并且将其插入至大肠杆菌 (Escherichia coli)NN049696 中。根据国际承认用于专利程序 的微生物菌种保藏布达佩斯条约， 将携带所述基因的大肠杆菌 NN04969。
45、6 株于 2000 年 2 月 8日保藏于德意志微生物保藏中心(MascheroderWeg 1B， D-38124 Braunschweig， 德国)并 且指定保藏号为 DSM 15940。 0126 在本发明一个令人关注的实施方案中， 所述蛋白酶与由多核苷酸的蛋白酶编码部 分所编码蛋白酶具有大于73.0%、 或大于75.0%、 或大于80.0%、 或大于85.0%、 或大于90.0%、 或大于92.0%、 或大于94.0%、 或大于96.0%、 或大于97.0%、 或大于98.0%、 或大于99.0%的同 一性， 其中所述的多核苷酸的蛋白酶编码部分已经被克隆进入保藏号 DSM 15940 。
46、大肠杆菌 NN049696 中质粒片段。 0127 如上所述， 本发明的蛋白酶在洗涤剂中表现出改善的稳定性。 因此， 为了使熟练技 术人员能选择有效的和优选的蛋白酶， 为此目的本发明人提供了能够由熟练技术人员容易 实施以便评估所讨论蛋白酶性能的适宜测试法。 0128 因此， 可使用此处实施例 V 中公开的稳定性测试以评估所选择蛋白酶的稳定性。 也就是说， 当蛋白酶混合到标准洗涤剂组合物中时， 可以使用此实施例评估与参考系统 ( 混合到相同模式洗涤剂系统中并在相同条件下测试 ) 相比较的蛋白酶的稳定性。 0129 在本发明一个令人关注的方面中， 当在 “实施例 V 洗涤剂中的稳定性” 中测试时所。
47、 述蛋白酶在 30时具有至少 40% 的残余活性， 在 30时具有至少 50% 的残余活性， 例如在 30时具有至少 60% 的残余活性， 更优选地在 30时具有至少 70% 的残余活性。 0130 在本发明另一个令人关注的方面中， 当在 “实施例 V 洗涤剂中的稳定性” 中测试时 所述蛋白酶在 35时具有至少 40% 的残余活性， 在 35时具有至少 50% 的残余活性， 例如 在 35时具有至少 60% 的残余活性， 更优选地在 35时具有至少 70% 的残余活性。 0131 因此， 对于衣物洗涤目的特别令人关注的蛋白酶是这样的蛋白酶， 当该蛋白酶在 如此处 “稳定测试” 所述的包含下列成。
48、分的模式洗涤剂组合物中测试时表现出与相同条件 下测试的参照酶相比改善的稳定性 ： 0132 说 明 书 CN 102994486 A 11 9/37 页 12 0133 本发明的蛋白酶可通过用于人工产生多样性的标准技术构建， 例如通过不同 蛋 白 酶 基 因 的 DNA 改 组 ( 见 WO 95/22625 和 J.E.Ness 等， NatureBiotechnology， 17， 893-896(1999)。 0134 显而易见， 本发明的蛋白酶还可从天然来源分离， 即本发明的蛋白酶可以是 例如真菌多肽， 并且更优选是丝状真菌蛋白酶， 如镰孢霉属、 顶孢霉属 (Acremonium)、 曲 霉 属 (Aspergillus)、 短 梗 霉 属 (Aureobasidium)、 隐 球 酵 母 属 (Cryptococcus)、 Filibasidium、腐 质 霉 属 (Humicola)、 Magnaporthe、毛 霉 属 (Mucor)、毁 丝 霉 属 (Myceliophthora)、 Neocallimastix、 脉孢菌属 (Neurospora)、 拟青霉属 (Paecilomyces)、 青霉属 (Penicillium)、 Pir。