说明书用于造血谱系细胞生长和分化的细胞培养基
发明领域
本发明涉及用于造血谱系（hematopoietic lineage）细胞生长和/或分化的细胞培养基。
技术背景
本领域持续大量需求易分解的血液制品，特别是为了输血目的，目前天然人血液的供给不能充分满足此目的。因此，已经研究了许多天然血液的替代品。
然而，稳定的或重组的血红蛋白已经示出令人失望的性质，人工氧转运蛋白的适应症是有限的并且通过酶处理或抗原掩蔽而与ABO系统和/或RhD抗原相容的“通用”红细胞的开发缓慢。因此需要这些方法的替代方法。
因此特别希望的是尝试从干细胞体外产生红系细胞（erythroid cells）如红细胞。
然而，体外再现在体内需要几个月的自然构建是一个相当大的挑战。事实上，在其在人类中的发生过程中，红细胞生成涉及在两个波段（wave）从中胚层进化。原始的（primitive）红细胞生成早在妊娠第三周在卵黄囊（胚胎外组织）中开始，并且产生原始成核红细胞巨幼红细胞，其合成GowerI(ζ2ε2)和Gower II(α2ε2)型胚胎血红蛋白。确定的（definitive）红细胞生成在妊娠第五周期间在主动脉‑性腺‑中肾（AGM）区开始，之后迁移至胎肝，然后至骨髓。产生的红系细胞逐渐成熟，导致产生无核红细胞（RBC），其是正常红细胞并且含有胎儿(α2γ2)及然后成人(α2β2)血红蛋白。
迄今为止，已经报道了从人胚胎干细胞产生红细胞的一些尝试，如Maet al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:13087‑13092所述。然而，这些实验通常依赖于在存在基质细胞条件下的共培养步骤，这样难以按比例扩大生产。
发明概述
本发明由本发明人意外发现，包含胰岛素、运铁蛋白和血浆或血清的细胞培养基可用于从人胚胎干细胞、人诱导的多能干(iPS)细胞或者人造血干细胞大量产生红细胞或者网织红细胞，而不需要在细胞基质上共培养。
因此，本发明涉及用于造血谱系细胞生长和/或分化的细胞培养基，其包含：
‑胰岛素，浓度为1‑50μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为100μg/ml‑2000μg/ml；及
‑血浆或血清，浓度为1%‑30%。
本发明还涉及如上所述细胞培养基在造血谱系细胞的生长和/或分化中的应用。
本发明进一步涉及生长和/或分化造血谱系细胞的方法，其包含至少一个用上述细胞培养基培养细胞的步骤。
附图简述
图1示出红系细胞的扩增和分化。通过G‑CSF动员的白细胞去除术(LK)获得的人CD34+细胞根据三阶段方案扩增并且在存在5%人血浆条件下培养(见“材料和方法”章节)。点是四个单独实验的平均值。
图2示出在第18天CD71、CD36、血型糖蛋白A和RhD表达的流式细胞计量分析。实心柱表示相关mAb，空心柱表示不相关mAb的阴性对照。该图示出代表四个单独分析的一个实验。
图3示出在第18天在培养基(左侧)和对照RBC(右侧)上LK衍生的网织红细胞的变形性谱。渗透梯度的细胞变形计量法（ektacytometry）用于测量无核红细胞的伸长(见“材料与方法”章节)。曲线是指osmoscan变量，即分别在等渗、高渗和低渗条件下确定的最大变形指数(DImax)及Ohyper和Omin。所述变量的正常值通过检测来自144个正常成年人的样品获得，DImax范围在0.41‑0.53，Omin的范围是143‑163mOsm/Kg，Ohyper的范围是335‑375mOsm/Kg。
图4示出通过HPLC分析确定的网织红细胞在第18天的血红蛋白状态(Bio‑Rad Variant II)。洗脱峰中血红蛋白的百分比表示HbF、HbA1c、HbA2和总HbA级分。
图5示出在37℃网织红细胞悬浮液（三角形）和对照RBC悬浮液在含有150mM NaCl的10mM Hepes缓冲液(pH7.4)中在不同DPG/Hb4比率的张力测量氧结合曲线。RBC等温线根据10个不同血液样品的平均MWC参数模拟。
图6示出用于从hESC产生红系细胞的连续培养步骤的示意图。将未分化的hESC簇在“EB培养基”中培养20天。然后将解离的第15‑20天的EB在液体培养基中在存在细胞因子相继混合物的条件下培养直至28天(见“材料和方法”章节)。
图7示出在第6‑20天的EB(一个代表性实验)中，在EB分化期间hESC衍生的细胞的造血标志物CD45、CD34和CD45/CD34的表达百分比(左侧y轴)以及CFC形成的动力学(右侧y轴)。
图8示出在EB分化期间hESC衍生的细胞的红系细胞标志物CD71、CD36和GlycoA。
图9示出在液体培养基中红系细胞系的定型（commitment）。在指定时间取等份液体培养物，进行细胞形态学分析。原成红细胞(ProE)，嗜碱性成红细胞(BasoE)，多染性成红细胞(PolyE)，正染性成红细胞(OrthoE)，培养的血细胞(cRBC)。一个代表性实验。
图10示出在衍生自EWC的cRBC中RhD抗原表达。将产生自EB的去核cRBC用抗‑Rh D抗体(Biotest,Reagents for ABO Blood Typing)标记。用二级藻红蛋白缀合的兔抗人抗体(Beckman)显示细胞。
图11示出在不同培养条件下在第25天液体培养基中的红系细胞大小。细胞大小用光学显微镜测量，每次测量100个细胞。AD(贴壁细胞)；NA(非贴壁细胞)；NA/MS5、NA/MSC、NA/MQ (分别在MS5细胞、MSC和巨噬细胞上共培养的非贴壁细胞)；PB(来自成年人外周血的RBC)。
图12示出通过对衍生自EWC的第25天cRBC的Hb进行质谱分析和HPLC分析鉴别的球蛋白链的代表性RP‑HPLC谱。
图13示出对衍生自脐带血细胞的第24天cRBC的Hb进行质谱分析和HPLC分析鉴别的球蛋白链的代表性RP‑HPLC谱。
图14示出在cRBC血红蛋白(三角形黑色曲线)和来自对照天然RBC的血红蛋白(圆形黑色曲线)闪光光解之后的CO重结合动力学。这两个样品示出相似的结合性质，包括别构转换。通过改变光解脉冲能量，可以改变解离的血红蛋白的总分数（fraction），由此详细探查各种部分结合的群。在高光解水平，产生更多的单结合四聚体，其转变为脱氧构象（T‑态）并且重结合配体更缓慢。在中等水平（中），可以更好探查双重结合的四聚体，这种形式难以用平衡技术研究。在足够低光解水平，主要的光产物是三重结合的四聚体，其快速重结合配体（R态）。显示在CO光解离的不同强度的R‑>T别构转换百分比。CO重结合动力学可以用针对R态构象中的四聚体种类固有的快速速率和T态构象固有的慢速率的两个指数期模拟。R态速率典型是6x106/ms，而T态速率大约慢20倍。由于别构转换偏移所致，在激光光解离的不同强度T态四聚体的分数对于来自cRBC‑EWC的HbF和Hb比HbA高得多。在加入1mM IHP（肌醇六磷酸）后，增加的向低亲和性T态四聚体的别构转换对于HbA要高于来自cRBC‑EWC的HbF和Hb。这可以通过HbF对于IHP的更低的亲和性而解释，如针对2,3DPG所报道的那样，和/或通过在别构效应物不存在下与HbA相比HbF的R‑>T转换百分比更高而解释。
发明详述
如本文所述，“造血谱系细胞”是指在哺乳动物、特别是人的血液中发现的细胞，以及在分化时可产生这种血细胞的细胞。更特别地，本发明的“造血谱系细胞”涉及红系细胞，即红细胞及在分化时直接即一步或者间接即在几个步骤中可产生红细胞的细胞。如本领域技术人员熟知，根据增加的分化程度分类，红系细胞系细胞主要包含胚胎干细胞、造血干细胞(HSC)、原成红细胞、成红细胞、网织红细胞、无核细胞，特别是无核网织红细胞，及红细胞。本发明的造血谱系细胞因此主要包含干细胞，特别是胚胎干细胞(ESC)，成人干细胞，如造血干细胞(HSC)，诱导的多能干(iPS)细胞，以及拟胚体，也包含原成红细胞、成红细胞、网织红细胞及无核细胞，特别是无核网织红细胞。优选地，本发明的造血谱系细胞是人细胞。
iPS细胞为本领域技术人员熟知。其可以通过许多方法及从许多细胞类型获得。例如，iPS细胞可以根据Takahashi & Yamanaka (2006)Cell 126:663‑676及Yamanaka et al.(2007)Nature 448:313‑317的教导而获得。
如本文所述，术语“生长”涉及培养细胞的增殖。如本文所述，术语“分化”涉及在培养基中培养的细胞获得在最初用于接种细胞培养基的细胞中不存在的细胞特性。如本文所述，“分化”特别是指获得进一步使细胞定型为朝向分化为红细胞的途径中的特性。因此，本发明的细胞培养基可特别用于使生长未分化的细胞，如胚胎干细胞，成人干细胞，如造血干细胞，诱导的多能干细胞(iPS)，或者拟胚体，以及将其分化为网织红细胞、无核细胞或者红细胞。
如本文所述，“细胞培养基”涉及任何培养基，特别是任何液体培养基，其可以维持真核细胞、特别是哺乳动物细胞、更特别是人细胞的生长。
优选地，本发明的细胞培养基由其中添加如下成分的基本培养基组成：
‑胰岛素，浓度为1‑50μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为100μg/ml‑2000μg/ml；及
‑血浆或血清，浓度为1%‑30%。
优选地，所述基本培养基自身通常可维持真核细胞、特别是哺乳动物细胞、更特别是人细胞的生长。这种基本培养基为本领域技术人员熟知。例如，可以是Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(IMDM)，任选补加了谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺的肽。因此，本发明的细胞培养基优选进一步包含Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(IMDM)，任选补加谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺的肽。
优选本发明的胰岛素是人重组胰岛素。优选胰岛素的浓度为5μg/ml‑20μg/ml，更优选浓度为8μg/ml‑12μg/ml，及最优选浓度为大约10μg/ml。
优选运铁蛋白是人运铁蛋白。优选运铁蛋白是铁饱和的。优选运铁蛋白浓度为200μg/ml‑1000μg/ml，更优选浓度为300μg/ml‑500μg/ml，及最优选浓度为大约330μg/ml或450μg/ml。所述运铁蛋白可以是重组的。
优选血浆或血清是人血浆或血清。优选血浆或血清浓度为1%‑20%，更优选浓度为4%‑12%，甚至更优选浓度为5%‑10%，最优选浓度为大约5%或10%。
在一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含肝素，特别是浓度为0.5UI/ml‑5UI/ml，更特别浓度为1.5‑3.5UI/ml，最优选浓度为大约2UI/ml。优选当血清也包含于本发明的细胞培养基中时，所述细胞培养基包含肝素。
在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含红细胞生成素(Epo)，特别是人重组红细胞生成素，优选浓度为0.5UI/ml‑20UI/ml，更优选浓度为2.5UI/ml‑3.5UI/ml，最优选浓度为大约3UI/ml。
在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含干细胞因子(SCF)，特别是人重组干细胞因子，优选浓度为50ng/ml‑200ng/ml，更优选浓度为80ng/ml‑120ng/ml，最优选浓度为大约100ng/ml。
在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含白细胞介素‑3(IL‑3)，特别是人重组白细胞介素‑3，优选浓度为1ng/ml‑30ng/ml，更优选浓度为4ng/ml‑6ng/ml，最优选浓度为大约5ng/ml。
在进一步的实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含氢化可的松，优选浓度为5.10‑7‑5.10‑6M，更优选浓度为大约10‑6M。
在另一实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含选自如下的至少一种化合物：
‑血小板生成素(TPO)，特别是重组人血小板生成素，优选浓度为20ng/ml‑200ng/ml，更优选浓度为80ng/ml‑120ng/ml，最优选浓度为大约100ng/ml；
‑FMS‑样酪氨酸激酶3(FLT3)配体，特别是重组人FLT3配体，优选浓度为20ng/ml‑200ng/ml，更优选浓度为80ng/ml‑120ng/ml，最优选浓度为大约100ng/ml；
‑骨形态发生蛋白4(BMP4)，特别是重组人骨形态发生蛋白4，优选浓度为1ng/ml‑20ng/ml，更优选浓度为8ng/ml‑12ng/ml，最优选浓度为大约10ng/ml；
‑血管内皮生长因子A165(VEGF‑A165)，特别是重组人VEGF‑A165，优选浓度为1ng/ml‑20ng/ml，更优选浓度为4ng/ml‑6ng/ml，最优选浓度为大约5ng/ml；及
‑白细胞介素‑6(IL‑6)，特别是重组人IL‑6，优选浓度为1ng/ml‑20ng/ml，更优选浓度为4ng/ml‑6ng/ml，最优选浓度为大约5ng/ml。
优选本发明的细胞培养基用于生长造血干细胞(HSC)及使HSC分化为网织红细胞、无核细胞和/或红细胞。优选本发明的细胞培养基用于生长拟胚体(EB)，特别是得自胚胎干细胞的EB，及使EB分化为网织红细胞、无核细胞和/或红细胞。本领域技术人员明了网织红细胞、无核细胞和/或红细胞可以是以基本纯的细胞群形式获得或者作为网织红细胞、无核细胞和/或红细胞的混合物获得。
优选本发明的方法将HSC分化为网织红细胞、无核细胞、红细胞，或者其混合物，所述方法包括：
‑在第一步骤中，将HSC在包含如下成分的细胞培养基中培养5‑9天，特别是培养7天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为300‑350μg/ml；
‑血浆，浓度为3%‑7%；
‑肝素，浓度为1.5UI/ml‑2.5UI/ml；
‑氢化可的松，浓度为5.10‑7‑5.10‑6M；
‑SCF，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑IL‑3，浓度为4ng/ml‑6ng/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml
‑在第二步骤中，将在第一步骤中获得的细胞在包含如下成分的细胞培养基中培养2‑5天，特别是3‑4天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为300‑350μg/ml；
‑血浆，浓度为3%‑7%；
‑肝素，浓度为1.5UI/ml‑2.5UI/ml；
‑氢化可的松，浓度为5.10‑7‑5.10‑6M；
‑SCF，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
‑在第三步骤中，将在第二步骤中获得的细胞在包含如下成分的细胞培养基中培养6‑10天，特别是至自第一步骤起第18‑21天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为300‑350μg/ml；
‑血浆，浓度为3%‑7%；
‑肝素，浓度为1.5UI/ml‑2.5UI/ml；
‑氢化可的松，浓度为5.10‑7‑5.10‑6M；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
‑从而获得网织红细胞、无核细胞、红细胞，或者其混合物。
优选本发明的方法用于使EB分化为红细胞、网织红细胞、无核细胞，或者其混合物，所述方法包括：
‑在第一步骤中，将EB在包含如下成分的细胞培养基中培养15‑25天，特别是20天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为425‑475μg/ml；
‑血浆，浓度为3%‑7%；
‑肝素，浓度为1.5UI/ml‑2.5UI/ml；
‑SCF，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑TPO，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑FLT3配体，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑BMP4，浓度为8ng/ml‑12ng/ml；
‑VEGF‑A165，浓度为4ng/ml‑6ng/ml；
‑IL‑3，浓度为4ng/ml‑6ng/ml；
‑IL‑6，浓度为4ng/ml‑6ng/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
‑在第二步骤中，将在第一步骤中获得的细胞解离并将解离的细胞在包含如下成分的细胞培养基中培养6‑10天，特别是培养8天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为425‑475μg/ml；
‑血浆，浓度为8%‑12%；
‑肝素，浓度为2.5UI/ml‑3.5UI/ml；
‑SCF，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑IL‑3，浓度为4ng/ml‑6ng/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml
‑在第三步骤中，将在第二步骤中获得的细胞在包含如下成分的细胞培养基中培养2‑4天，特别是培养3天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为425‑475μg/ml；
‑血浆，浓度为8%‑12%；
‑肝素，浓度为2.5UI/ml‑3.5UI/ml；
‑SCF，浓度为80ng/ml‑120ng/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
‑在第四步骤中，将在第三步骤中获得的细胞在包含如下成分的细胞培养基中培养2‑4天，特别是培养3天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为425‑475μg/ml；
‑血浆，浓度为8%‑12%；
‑肝素，浓度为2.5UI/ml‑3.5UI/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
‑在第五步骤中，将在第三步骤中获得的细胞(i)在包含如下成分的细胞培养基中培养8‑12天，特别是培养10天：
‑胰岛素，浓度为8‑12μg/ml；
‑运铁蛋白，浓度为425‑475μg/ml；
‑血浆，浓度为8%‑12%；
‑肝素，浓度为2.5UI/ml‑3.5UI/ml；
‑Epo，浓度为2.5‑3.5UI/ml；
或者(ii)在贴壁基质层上培养8‑12天，特别是培养10天；
从而获得红细胞、网织红细胞、无核细胞，或者其混合物。
实施例
实施例1：在体外从造血干细胞产生网织红细胞
材料和方法
细胞培养
用G‑CSF[白细胞去除术(LK)细胞]动员的正常外周血得自知情同意的健康供体。使用Mini‑MACS柱(Miltenyi Biotech,Bergisch Glodbach,Germany)通过超磁性微珠选择法分离CD34+细胞(纯度>94±3%)。
将细胞在IMDM(Iscove修改的Dulbecco’s培养基，Biochrom,Germany)中培养，其中补加了2mM L‑谷氨酰胺(Invitrogen,Cergy‑Pontoise,France)、330μg/ml铁饱和的人运铁蛋白、10μg/ml胰岛素(Sigma,Saint‑Quentin Fallavier,France)、2IU/ml肝素Choay(Sanofi,France)以及5%溶剂/洗涤剂病毒失活的(S/D)血浆。扩增程序包括三个步骤。在第一个步骤中(0‑7天)，将104/ml CD34+细胞在存在10‑6M氢化可的松(HC)(Sigma)、100ng/ml SCF(由Amgen,Thousand Oaks,CA惠赠)、5ng/ml IL‑3(R&D Systems,Abingdon,UK.)和3IU/ml Epo(Eprex，由Janssen‑Cilag,Issy‑les‑Moulineaux,France惠赠)的条件下培养。在第4天，将1体积的细胞培养物在4体积的含有HC、SCF、IL‑3和Epo的新鲜培养基中稀释。在第二个步骤中(3‑4天)，将细胞在补加SCF和Epo的新鲜培养基中以105/ml重悬。在第三个步骤中(直至第18‑21天)，将细胞在新鲜培养基中在只存在Epo的条件下培养。在第11和14天，将细胞计数分别调节为5x105和1.5x106个细胞/ml。将培养物维持在37°C及5%CO2空气中，结果以铺板后实际扩增率表示。
将细胞用May‑Grünwald‑Giemsa及新亚甲蓝试剂(Sigma)染色，以进行形态学分析，同时使用XE2100自动装置(Sysmex,Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)监测无核细胞的标准血液学参数，包括MCV(fL)、MCHC(%)和MCH(pg/细胞)。
流式细胞计量术
将细胞用未缀合的或者异硫氰酸荧光素(FITC)‑或藻红蛋白(PE)‑缀合的抗体标记。CD71‑FITC抗体和CD36‑FITC抗体(Becton Dickinson,San Jose,CA)、血型糖蛋白A‑PE抗体、CD45‑FITC抗体和CD34‑PE抗体(Beckman Coulter,Marseille,France)用于表型分型(phenotyping)。一抗人抗‑RhD抗体和二抗山羊PE缀合的抗人抗体(Beckman Coulter)用于RhD确定。在FACSCalibur流式细胞计量仪(Becton Dickinson)上使用Cell Quest软件进行分析。
变形性测量
通过经过去白细胞滤膜(Leucolab LCG2,Macopharma,Tourcoing,France)将在培养第18天获得的网织红细胞与有核细胞分离并通过细胞变形计量法(ektacytometry，一种激光衍射方法)检验无核细胞。在细胞变形计量仪中(Technicon,Bayer Corp.,Diagnostics Division,Tarrytown,NY)，将细胞悬浮于4%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，并暴露于增加的渗透梯度(60‑450mOsm/Kg)。记录细胞的激光衍射模式的改变。这种光度测量产生称作变形性指数(DI)的信号。DI曲线的分析提供了对细胞膜动态变形性的测量，其是在170达因/cm2恒定外加剪切应力的重量摩尔渗透压浓度的函数。DImax，以任意单位表示并且定义为DI的最大值，其通常涉及红细胞的平均表面积。Omin定义为重量摩尔渗透压浓度，在该浓度，在低渗条件下获得DI最小值并且依赖于起始表面/体积比。OHyper是重量摩尔渗透压浓度，在该浓度DI降低为在高渗曲线区域中一半DImax值，与MCHC反相关。
酶活性
将毛地黄皂苷(0.2%)加入到白细胞耗竭后获得的红细胞中，用Drabkin’s试剂经分光光度法定量Hb。葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶活性通过使用分别来自Randox Laboratories(Crumlin,UK)和Roche Diagnostics的Synchron CX4Beckman分光光度计和试剂测量340nm处NADPH吸收的增加率而确定。结果表示为单位/克Hb。
Hb分析
Hb级分用离子交换高效液相色谱分离和定量。在洗涤的细胞沉淀上用Bio‑Rad Variant II dual program(Bio‑Rad Laboratories,Hercules,CA)根据厂商指导进行分析。
溶液中氧结合平衡
在70ml张力计中用1cm径长比色杯经张力测量法确定氧结合曲线。光谱测量用Cary 50分光光度计进行，温度用Peltier模块控制。分析在37℃在含有140mM NaCl和2mM葡萄糖的50mM bis‑Tris(pH 7.2)中进行。在氮气氛下充分脱氧后，红细胞悬液在不同氧分压下经使用Hamilton注射器通过橡胶盖注射已知体积的纯氧进入张力计而平衡。饱和分数（fractional saturation）通过模拟可见及Soret区的吸收光谱为RBC悬液的完全脱氧和充氧光谱的线性组合而评估，使用Scientist软件的最小二乘法拟合程序(Micromath Scientific Software,Salt Lake City，UT)。
结果
1.1.造血干细胞分化为网织红细胞
从衍生自用G‑CSF(LK细胞)动员后的健康供体的外周血的CD34+HSC开始，设计在存在5%溶剂/洗涤剂病毒失活的血浆(S/D血浆)条件下的三步方案。首先，用SCF、IL‑3和Epo诱导7天以使细胞增殖和红系细胞定型。其次，用SCF和Epo使红系细胞增殖扩大3‑4天。在第三个步骤中，在只存在Epo的条件下维持细胞直至18‑21天至终末成熟。在第18天，获得CD34+细胞平均扩大倍数为66,200±24,000倍(图1)的平稳期，及第18天无核细胞的百分比为74±5%。在此阶段，所有细胞均示出网织红细胞特性，通过聚甲炔染料(XE2100‑Sysmex)流式分析及通过新亚甲蓝染色评定。平均细胞体积(MCV)为141±6fL，平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)为30±2%，平均细胞血红蛋白(MCH)为42±1pg。对这个细胞群进行的免疫学鉴定证实细胞的网织红细胞谱(图2)，其表达血型糖蛋白A(GPA)、CD71(运铁蛋白受体)和CD36(血小板糖蛋白IV)，分别为99±1%、44±10%和11±4%。
1.2.产生自造血干细胞的网织红细胞的功能分析
为了进行精确的功能分析，将在培养第18天获得的网织红细胞通过经过去白细胞滤膜(Leucolab LCG，Macopharma)而与有核细胞分离。这些网织红细胞的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(G6PD)的含量为65±3单位，丙酮酸激酶(PK)水平为94±7单位/g血红蛋白(Hb)，以保持幼同质红细胞群的性质(Jansen et al.Am J Hematol 1985；20,203‑215)。这表明其能降低谷胱甘肽水平及维持ATP水平，因此保证2,3‑二磷酸甘油酯(2,3‑DPG)的正常水平。
网织红细胞膜变形性通过渗透性扫描细胞变形计量法分析，其测量红细胞伸长。这产生了称作变形性指数(DI)的信号，最大伸长(DImax)是指细胞的平均表面积(Clark et al.Blood 1983；61,899‑910和Mohandas et al.J Clin Invest 1980；66,563‑573)。具有更高平均体积的网织红细胞的DImax(0.63)相应于预期水平并证实这些细胞的正常变形性(图3)。低于80mOsm/kg的Omin表明网织红细胞的增大的表面积/体积比率及降低的渗透脆性，而正常Ohyper值(362mOsm/kg)证实其正常水合。这些数据示出在培养的网织红细胞中保持流变性质。
在体外产生的网织红细胞含有成人血红蛋白A(HbA)(96±0.1%)，表明在这些条件下Hb合成的正常过程(图4)。
张力测量氧平衡测量示出网织红细胞悬浮液以与天然RBC悬浮液相同方式结合及释放氧。网织红细胞的氧亲和性(P50)为28mm Hg，天然RBC的氧亲和性为26±1mm Hg(Kister et al.J Biol Chem 1987；262,12085‑12091和Girard et al.Respir Physiol 1987；68,227‑238)，而这两个样品的Hill系数(n50)均等于2.4±0.1。图5示出在不同DPG/Hb4比率的氧结合等温线(从左至右:<0.2；正常比率≈1;2.4)，使用MWC模型参数从氧结合曲线模拟(Girard et al.Respir Physiol 1987；68,227‑238)。这些结果表明网织红细胞中2,3‑DPG水平可能接近Hb四聚体浓度，如对于天然RBC糖酵解比率观测的那样。与正常浓度相比2,3‑DPG的耗竭使P50降低两倍，而在RBC与10mM葡萄糖延长保温后2,3‑DPG增加使P50升高大约60%。
实施例2：在体外从胚胎干细胞产生红细胞
材料与方法
未分化的hESC培养物
将hES细胞系H1(National Institute of Health[NIH]code WA01,传代23‑45代)维持在未分化状态，通过在补加20%敲除（knockout）血清替代物(Invitrogen)和重组人(rhu)FGF2(10ng/mL；Peprotech，Neuilly‑sur‑Seine,France)的敲除Dulbecco’s修改的Eagle’s培养基(DMEM,Invitrogen,Cergy Pontoise,France)中每周在用丝裂霉素(20μg/mL；Sigma,Saint‑Quentin Fallavier,France)处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上机械传代进行。
拟胚体(EB)形成
在第一天，将未分化的hESC用胶原酶IV(1mg/mL；Invitrogen)处理并转移至低吸附平板(Nunc,Dutscher,Brumath,France)以使得在分化培养基(敲除DMEM培养基，补加20%非热失活胎牛血清，1%非必需氨基酸，1mML‑谷氨酰胺，及0.1mM β‑巯基乙醇，Invitrogen)中过夜保温期间形成拟胚体(EB)。第二天，将EB悬浮于液体培养基(LCM)(IMDM‑glutamax,Biochrom,Berlin,Germany)中，所述培养基含有450μg/mL铁饱和的人运铁蛋白(Sigma)、10μg/mL胰岛素(Sigma)、5%人血浆和2U/mL肝素，存在SCF、TPO、FLT3配体(100ng/mL)，rhu骨形态发生蛋白4(BMP4；10ng/mL)，rhuVEGF‑A165，IL‑3，IL‑6(5ng/mL)(Peprotech)和Epo(3U/mL)(Eprex,Janssen‑Cilag,France惠赠)(后文称作EB培养基)。将EB在37℃在湿润的5%CO2空气中培养20天，每2天或3天更换培养基和细胞因子。通过与胶原酶B(0.4U/mL；Roche Diagnostics,Laval,QC,Canada)在37℃保温30分钟及随后在细胞解离缓冲液(Invitrogen)中在37℃水浴中保温10分钟，随后轻轻抽吸及经过70μm筛，从而将细胞解离为单细胞悬浮液。
cRBC的产生
第0‑8天：计数解离的EB，并在含有10%人血浆和3U/mL肝素的LCM中在存在SCF(100ng/mL)、IL‑3(5ng/mL)和Epo(3U/mL)条件下以1x106个细胞/mL密度铺板。在第1天将非贴壁(NA)细胞(4x105/mL)和贴壁(AD)细胞(106/mL)分别接种在相同培养基和细胞因子中，培养8天。在第4天，将1体积的细胞培养物用4体积含有SCF、IL‑3和Epo的新鲜培养基稀释。在第8‑11天：将细胞以3x105(NA)或105(AD)个细胞/mL的密度悬浮并在补加SCF和Epo的新鲜培养基中培养。在第11‑15天：将细胞以106/mL悬浮(NA和AD细胞)并在补加Epo的新鲜培养基中培养。在第15‑25天：将NA和AD细胞在含有10%人血浆和Epo的LCM中以2x106个细胞/mL悬浮，或者在贴壁基质层上共培养。将该培养物保持在37℃的5%CO2空气中。
基质细胞
评估贴壁细胞层的三个来源：(i)MS‑5基质细胞系，(ii)间充质基质细胞(MSC)(Prockop Science 1997；276,71‑74)，在补加10%胎牛血清(FCS)的alpha MEM培养基(Invitrogen)中从完全正常成人骨髓建立(贴壁MSC被扩增并通过至少两个连续传代纯化)及(iii)来自在含有20%FCS的IMDM‑glutamax中在SCF(50ng/mL)、FLT3‑配体(30ng/mL)和TPO(15ng/mL)存在10天及SCF(30ng/mL)、IL‑3(30ng/mL)和M‑CSF(30ng/mL)存在1周的条件下从CD34+骨髓细胞建立的巨噬细胞的基质细胞。贴壁细胞的FACS染色用于证实CD14和HLA‑DR表达。
半固体培养测定
在甲基纤维素培养物中测定BFU‑E、CFU‑E和CFU‑GM祖细胞。解离的EB的浓度为1x105个细胞/mL，在培养第7天和14天对集落评分。
未分化的hESC、EB及分化的细胞的流式细胞计量分析
将细胞在含有0.1%BSA的PBS中制备，及用单克隆抗体(mAb)混合物标记。使用具备CellQuest采集软件的FACSCalibur流式细胞计量仪(Becton Dickinson，San José，CA，USA)分析样品。如下抗体用于对未分化的hESC、收获的解聚的第2‑20天EB及分化期间的红系细胞进行流式细胞计量分析：SSEA4‑PE(藻红蛋白)和SSEA1‑PE(Clinisciences，Montrouge，France)；TRA‑1‑60，TRA‑1‑81，山羊抗小鼠IgM‑PE及山羊抗小鼠IgG‑PE(Chemicon,Saint‑Quentin en Yvelines，France)；CD34‑PE，CD45‑PE，CD45‑PC7，CD117‑PE，CD71‑FITC，CD36‑FITC和CD235a‑PE(血型糖蛋白A)(Beckman Coulter‑Immunotech，Marseille，France)；CD133‑PE(Miltenyi Biotech，Glodbach，Germany)。门控活细胞用于分析并且用合适的同种型匹配的对照mAb染色确定阳性染色和背景的阈值。
通过层析和质谱测量分析cRBC的血红蛋白组成
各个血红蛋白级分的百分比通过CE‑HPLC测量，使用Bio‑Rad VariantII Hb分析仪(Bio‑Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)进行。得自培养第15天和第25天的hES细胞的cRBC中包含的不同球蛋白链级分的分离通过反相液体层析(RP‑LC)和光谱分析进行。在C4Uptisphere(二氧化硅珠5μm；平均孔径)(Interchim,France)(4.6×250mm)上进行RP‑LC分析。通过两个溶剂系统获得洗脱液(A:10%CH3CN(乙腈)在0.3%TFA(三氟乙酸)中，及B:70%CH3CN在0.3%TFA中)。不同RP‑LC峰的积分可以确定每个分离的球蛋白链级分的面积百分比。其鉴别和鉴定在分离和收集球蛋白链后通过电喷雾离子化质谱分析(ESI‑MS)进行。将结果与用产生自人CD34+脐带血细胞的cRBC获得的数据进行对比。
cRBC的血红蛋白的功能性
血红蛋白(Hb)与一氧化碳的结合通过闪光光解研究，使用4x10mm光学比色杯(4mm用于透射光，及10mm用于激光束)。简言之，在532nm用10‑ns脉冲对配体进行光解离之后，在436nm分析CO重结合Hb四聚体的动力学(Marden et al.Biochemistry 1988；27,1659‑1664)。将RBC在低渗缓冲液中在冰上裂解30分钟。在15,000g离心后，从膜和细胞碎片中取出含Hb的上清，在Hb样品中加入IHP(肌醇六磷酸，1mM)。使用Scientist(Micromath)的非线性最小二乘法程序进行数据拟合。
结果
2.1.以红系细胞定型为条件的hESC分化为hEB
EB培养基的确定
极早地诱导和刺激红细胞生成途径。鉴于加入BMP4看起来是必不可少的(Chadwick et al.Blood 2003；102,906‑915)及VEGF‑A 165(Cerdan et al.Blood 2004；103,2504‑2512)同样，进行8个不同的实验以检测两个其它参数‑细胞因子和血清类型‑的基本作用。在进行这些实验后，定义了以红系细胞定型为条件的EB的培养基(称作EB培养基)。其含有5%混合的人血浆、高浓度运铁蛋白(450μg/mL)及8种细胞因子的混合物：SCF、TPO、FLT3配体(100ng/mL)、rhu BMP4(10ng/mL)、rhu VEGF‑A165、IL‑3、IL‑6(5ng/mL)和Epo(3U/mL)。如在下文章节中所述，这些培养条件在培养结束时可以获得最大数目的成熟的无核RBC。
2.2.hEB的红系细胞潜力的确定
首先，鉴别具有最佳红系细胞潜力的hEB的一或多个分化阶段。根据(1)通过流式细胞计量术分析造血和红细胞生成的特异性标志物的表达及(2)红系祖细胞的形成，分析在培养第2‑20天期间hEB分化的动力学。在分化之前，hESC高水平表达特异于未分化的细胞的标志物，及不表达或低水平表达造血标志物。未分化的细胞的这些标志物的表达逐步下降直至第13天，在至第20天保持微弱阳性。CD34从第2天至第20天表达，在第9‑13天达峰值；CD45从第6天至第20天表达，在第13天为峰值(图7)。令人感兴趣地，运铁蛋白受体CD71在整个培养期间表达，在第6‑20天之间高水平表达。红系细胞标志物CD36和CD235a在第13天微弱表达(图8)。总之，在第15‑20天，hEB明显表达研究的造血和红系细胞标志物：CD45、CD34、CD71、CD36和CD235a。同时，CFC的数目保持较低，在第15天是一小峰，表明hEB的弱集落生成潜力(图7)。基于这些结果，使用培养第15‑20天的hEB进行红系细胞分化。
2.3.hEB分化/成熟化为cRBC‑产生cRBC的方案
本发明人揭示了简便的优化培养条件，包括在存在10%人血浆及基于SCF、IL‑3和Epo的细胞因子进化混合物的条件下在液体培养基中培养(图6)。在第15天的最后培养期，检测对已知其支持造血能力的三种不同基质的去核影响：鼠源MS5细胞、人源间充质干细胞(MSC)和巨噬细胞相对于无基质条件。使培养15和20天的hEB解离，将细胞重悬及培养，根据成红细胞分化/成熟的液体培养方案进行。在第1天，可以区别两种类型的细胞，非贴壁细胞(NA)和贴壁细胞(AD)，分别代表全部细胞的10%和90%。将这两种细胞类型使用相同方案平行培养。在用MGG染色后根据细胞形态学定期评估红细胞成熟，红系细胞膜抗原的表达通过流式细胞计量术确定。
2.4.起始自第15天或第20天hEB的成熟无核cRBC的产生
第15天或第20天hEB在4天液体培养之后完成红系细胞定型，产生95%以上的成红细胞。逐步实现终末分化/成熟，在第11天呈现出3±2%无核细胞，在第15天呈现出17±4%无核细胞，在第18天呈现出31±8%无核细胞及在第21天呈现出48±9%无核细胞。在第25天培养结束时，该群含有58±2%完全无核RBC(图9)。无核水平是完全相当的，无论培养的细胞(NA或AD)、培养条件(有或无基质)或者基质性质(MS5、MSC或巨噬细胞)如何。从第15天或第20天hEB中产生的红系细胞能产生cRBC，称作“无核窗口细胞”(EWC)。在此液体培养期间唯一显著的差异是NA细胞的扩增高于AD细胞的扩增(在第20天分别为24‑61倍及4‑5倍)。因此，起始自衍生自hEB的106细胞，产生144×106个红系细胞或者82×106个cRBC。
2.5.分析产生自EWC的cRBC–成熟cRBC的膜标志物
对产生的cRBC的膜抗原进行流式细胞计量分析证实其成熟度。在培养结束时，所有产生的cRBC均强表达CD235a和CD71。CD36表达降低而增加细胞成熟度(在第11天为5%±1，在第25天为7±3%)，RhD抗原在80%以上的细胞中表达升高证实cRBC的高水平膜成熟(图10)。
2.6.cRBC的大小
在第25天液体培养结束时，通过显微镜测量cRBC的大小并将其与来自对照成人外周血的RBC相比。在不存在基质的条件下或者在MS5细胞、MSC或巨噬细胞上共培养之后，cRBC的大小相当，平均直径10μm(图11)。
2.7.cRBC的血红蛋白分析
为了分析由cRBC合成的血红蛋白的类型，将通过反相HPLC和质谱分析对球蛋白链进行的研究与通过HPLC对四聚体血红蛋白的鉴别相组合。
经RP‑LC和质谱鉴别及定量cRBC中的球蛋白链
经RP‑LC分离球蛋白链允许定量cRBC的血红蛋白生成：1‑5%β,19‑29%γ‑G，36‑43%α和11‑21%γ‑A链。还观察到了在不同实验中强度可变的两个额外峰，从不存在到小于15%，相应于胚胎链ε和ζ。因此，存在胎儿链的大量主要合成（35‑50%），成人链的弱生成（2%）和胚胎链的可变合成(<10%)，大约40%是α链。这些结果经质谱鉴别RP‑LC洗脱的级分而证实，并且与衍生自脐带血的CD34+HSC的cRBC获得的结果相同（图12和13）。
经CE‑HPLC研究血红蛋白合成
经CE‑HPLC分析四聚体Hb显示合成2.5%HbA和74‑80%HbF，谱与衍生自脐带血的CD34+HSC衍生的cRBC获得的结果可重叠（图12和13）。这些结果与我们用RP‑LC和质谱的发现一致，首次证实在衍生自hESC的cRBC中四聚体形式的胎儿血红蛋白的合成。
2.8.cRBC血红蛋白的功能性
cRBC血红蛋白的功能性在闪光光解后经配体结合动力学评估（图14）。在CO的光解离后双分子动力学提供了血红蛋白功能的灵敏探针。因此，观测到两相，相应于用于配体结合的两种血红蛋白四级状态。快速成分从R态四聚体产生，慢成分来自T态四聚体产生。在高水平光解离下，主要种类是单和双重配体结合的，而在低水平主要测量到CO结合三重配体结合的种类。因此，对于不同部分配体结合结合种类的别构平衡可以通过改变光解离水平探查。在正常HbA中的R‑>T转换发生在第二个配体结合Hb四聚体之后。在存在别构效应物如IHP时，转换点在后来发生并且内在R和T亲和性也降低。针对来自cRBC的血红蛋白的CO重结合动力学（图14）几乎可与胎儿血液样品的重叠，这与从HPLC分析所预期的一样，显示cRBC中的大量HbF。加入IHP后，R‑>T转换朝向低亲和性四聚体移位，程度与胎儿血液中类似（相同幅度的慢T态重结合相）。CO闪光光解实验因此证实cRBC中的HbF不仅在生理条件下是有功能的，而且应答强别构效应物。