气泡发酵工艺.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103003439 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 103003439 A *CN103003439A* (21)申请号 201180031397.5 (22)申请日 2011.06.16 10166818.4 2010.06.22 EP C12P 35/00(2006.01) C12P 37/00(2006.01) C12M 1/04(2006.01) (71)申请人中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司地址荷兰海尔伦 (72)发明人约瑟夫约翰尼斯玛利亚霍米斯特沃特阿德里安努斯温登范 (74)专利代理机构北京东方亿思知识产权代理有限责任公。

2、司 11258 代理人肖善强 (54) 发明名称气泡发酵工艺 (57) 摘要本发明涉及使用微生物生产有价值的化合物的工业规模发酵工艺，其中总能量输入的 50 是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的 50是通过机械手段来递送的。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/060053 2011.06.16 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/161004 EN 2011.12.29 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权。

3、局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 生产化合物的工艺，所述工艺使用能产生所述化合物的藻类、细菌或真菌，其中反应培养基的体积从 10m3至 5000m3并且反应培养基的粘度从 10 厘泊至 200 厘泊，所述工艺的特征在于总能量输入的 50是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的 50是通过机械手段来递送的。 2.根据权利要求1的工艺，其中所述总能量输入的75是通过注入含氧气体来递送的并且所述总能量输入的 25是通过机械手段来递送的。 3. 根据权利要求 1 的工艺，其中 100的所述总能量输入是通过注入含氧气体。

4、来递送的。 4. 根据权利要求 1 至 3 的任一项的工艺，其中所述注入含氧气体的压力校正表面气速是在 7cm/sec 和 25cm/sec 之间。 5. 根据权利要求 1 至 4 的任一项的工艺，所述工艺在鼓泡塔中进行。 6. 根据权利要求 1 至 5 的任一项的工艺，其中所述化合物是 - 内酰胺。 7. 根据权利要求 1 至 6 的任一项的工艺，其中所述藻类、细菌或真菌是 Acremonium 种或 Penicillium 种。 8. 根据权利要求 6 至 7 的任一项的工艺，其中所述化合物是己二酰 -7-ACA、己二酰 -7-ADCA 或青霉素 G。权利要求。

5、书 CN 103003439 A 2 1/5 页 3 气泡发酵工艺技术领域 0001 本发明涉及在工业规模上发酵生产有价值的化合物，其中总能量输入的 50是通过注入含氧气体来递送的。 0002 发明背景 0003 很多有价值的化合物是通过在大的工业规模的发酵罐中发酵生产来制造的，在所述发酵罐中，可以是丝状真菌 ( 比如针对像 - 内酰胺的化合物是 Penicillium chrysogenum)的微生物在受控条件下生产有价值的化合物。为了在发酵液中获得有价值的化合物的高生产力，需要高生物质浓度。大多数发酵工艺以带有搅拌和通气的浸没式发酵进行。为了给微生物提供必要的氧气，。

6、通气是必要的，并且为了确保发酵液和气泡的良好混合以实现从注入的空气进入发酵液的有效氧传递，搅拌是必要的。氧传递的效率由于发酵液的高粘度而被减小，所述发酵液的高粘度是由发酵液中的高生物质浓度和 / 或由使用的微生物的形态学引起的。低效的混合导致具有降低的生物质形成的降低的氧传递，和因此降低的有价值化合物生产。在大多数常见工艺中，特别是用于生产 - 内酰胺 ( 比如青霉素 G) 的大多数常见工艺中，约 30-40的能量输入源自空气注入并且大约 60-70来自机械搅拌。搅拌和空气注入都将大量的能量引入了发酵罐中，所述发酵罐增加由微生物生长产生的热量并通常被迫 ( 强迫 )。

7、冷却以将发酵工艺的温度保持在期望值。 0004 在过去 50 年中，大量研究工作集中在改进例如 - 内酰胺的发酵工艺，对青霉素 G 特别关注。1950-1984 年这段时期已被 G.J.M Hersbach， C.P van der Beek and P.W.M van Dijk(The penicillins ： properties， biosynthesis and fermentation.In ： E.J Vandamme， Editor， Biotechnology of industrial antibiotics， Marcel Dekker， New York(198。

8、4)， 45 140) 综述过。通过增加搅动功率和通气速率，增加最大氧传递。这些措施的缺点是，引入了更多的能量，其还需要改进的冷却能力并因而增加了产物的成本费用 (Hersbach 等人， 95 页 )。或者，可选择给予较低粘度发酵液的菌株和 / 或发酵条件 (Hersbach 等人， 51 页，第 4 段 )。 0005 最近， Burlingame 和 Verdoes(BioPharm Int.， 2006， 19(1)， 1-5) 分离了 Chrysosporium lucknowense 的低粘度突变体，所述突变体显示了特征为菌丝碎片的形态学和命名为 “繁殖体” 的分。

9、散单元 (element) 的形成。这些繁殖体的培养物展示了更低的粘度、更好的营养物和氧传递以及更高的蛋白生产。当两种菌株在类似条件下生长时，与亲本菌株比较，低粘度突变体产生了约 2 倍的总蛋白产率。低粘度菌株允许进一步改进的培养条件，当应用所述条件时，其导致蛋白生产额外的 3 倍增加。 0006 还通过改变发酵罐中的进料策略，已获得了粘度降低。例如， Bhargava 等人 (Biotechnol.Bioeng.， 2003， 82， 111-117) 表明，在使用产生重组葡糖淀粉酶的 Aspergillus oryzae 菌株的发酵中，限。

10、制碳源的脉冲 - 进料策略降低了粘度和平均菌丝体颗粒大小。伴随这些改变，由这些菌株的葡糖淀粉酶生产量得以增加。 0007 已发现在发酵工艺中使用固定化细胞时高粘度的另一解决方案。现有技术中有很多公开，其中已在摇瓶、小规模实验室发酵罐、鼓泡塔和气升罐中用固定化细胞进说明书 CN 103003439 A 3 2/5 页 4 行发酵，见 B.Konig 等人 (Biotechnol.Bioeng.， 1982， 24(2)， 259-280)、 Gbewonyo 等人 (Biotechnol.Bioeng.， 1983， 25(12)， 2873-2887)、 Al-Qo。

11、dah Zakaria(Appl.Biochem. Biotechnol.， 2000， 87(1)， 37-55)、 M.Gavrilescu 等人 (Acta Biotechnologica， 1998， 18(3)， 201-229)、 W.Zhou 等人 (J.Biotechnol.， 1993， 28(2-3)， 165-177)、 Punita Mishra 等人 (World J.Microbiol.Biotechnol.， 2005， 21(4)， 525-530)、 P.Srivastava 等人 (Process Biochem.， 1999， 34(4)， 329)、 M。

12、.Kawagoe 等人 (J.Ferm.Bioeng.， 1997， 84(4)， 333-336) 和 M.Kawagoe 等人 (J.of Bioscience and Bioeng.， 1999， 87(1)， 116-118)。例如 Gbewonyo 等人 (Biotechnol.Bioeng.， 1983， 25(12)， 2873-2887) 表明了，通过固定化 Penicillium chrysogenum 并将菌丝体生长限于微珠粒，较之自由悬浮的菌丝体结构，在 3 升鼓泡塔中的青霉素生产量被改进了许多。作者已建议：当细胞以球状球团的形式生长时，培养发酵液保留较。

13、小的粘性并能保持更好的气液质量传递性质。 0008 但是，使用固定化细胞的缺点是细胞生长减少。结果，发酵液中的产物水平也非常低。在 Gbewonyo 等人的具体的例子中，每升发酵液仅获得 5.5g 的青霉素 G。尽管该值比在鼓泡塔中的用悬浮细胞的对照实验高出 10 倍，但其比在搅拌且通气的发酵罐中的青霉素 G 的工业生产期间获得的水平 ( 25g/l) 低得多。 0009 而且，为技术人员所熟知的是，在小规模发酵罐中获得的生产力通常不完全代表在较大规模下获得的那些生产力，特别是当有某一程度的粘度时。例如，大规模的混合时间通常比小规模的混合时间长得多，其可导致限制生。

14、产力的营养物的浓度中的梯度的存在。当应用至大规模的发酵，比如 10m3 规模或更大规模的发酵时，在小规模上论证的现有技术中提出的建议因而不是必然成功的。现有技术从未公开也没有建议：通常在搅拌的通气的发酵罐中进行的有价值化合物的工业规模粘性发酵工艺可在鼓泡塔中以高生物质浓度有利地进行。 0010 发明详述 0011 在第一方面中，本发明提供了生产化合物的工艺，所述工艺使用能产生所述化合物的藻类、细菌或真菌，其中反应培养基的体积从 10m3至 5000m3并且反应培养基的粘度从 10厘泊至200厘泊，所述工艺的特征在于总能量输入的50是通过注入含氧气体来递送的并且总能。

15、量输入的 50是通过机械手段来递送的。优选地，总能量输入的 75并且更优选地 95是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的 50、优选地 25、更优选地 5是通过机械手段来递送的。在最优选的实施方式中， 100的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且没有能量输入是通过机械手段来递送的。该实施方式包括鼓泡塔，所述鼓泡塔特征在于通过注入含氧气体来实现发酵罐的内含物的混合。本发明的优势是，通过注入含氧气体来减少或替代用于能量输入的机械手段，增加了在发酵工艺中的有价值的化合物对能量的产率 ( 例如，被定义为在发酵工艺中每单位量的消耗的能量所产生的 - 内酰胺的量 )。。

16、0012 在本发明上下文中，术语 “总能量输入” 被定义为通过压缩气体或机械手段引入发酵罐中的组合能量并且排除通过进料至发酵罐中的气体或液体所引入的化学能或热能。 0013 在本发明上下文中，术语 “机械手段” 在本文中被定义为能将能量直接 ( 即不是间接地经由气相 ) 输入液相的任何手段。合适的手段是本领域技术人员所熟知的搅拌设备。用于发酵罐的搅拌设备在本领域中详细记载并且是商业上广泛可得到的。说明书 CN 103003439 A 4 3/5 页 5 0014 在本发明上下文中，术语 “鼓泡塔” 是指由垂直排列的圆柱形柱组成的用于气液反应的装置，所述圆柱形柱可以以许多构。

17、建形式构造。气体引入在柱的下半部发生并引起紊流以确保最佳气体交换。通过气体鼓泡 (gas sparging) 以及由上升的气泡而产生的液体转移和夹带，发生混合。鼓泡塔的特征在于高液体含量和适度相界面并被用在各种类型的发酵中。 0015 “工业规模” 在本文中被定义为在下述发酵罐中进行的发酵工艺，所述发酵罐具有 10m3、优选地 25m3、更优选地 50m3、最优选地 100m3、优选地小于 5000m3的体积。或者，工业规模在本文中可被定义为具有至少 4 米、更优选地至少 5 米、更优选地至少 6 米、更优选地至少 7 米、更优选地至少 8 米、更优选地至少。

18、9 米、更优选地至少 10 米的高度的发酵罐。优选地，发酵罐具有小于 15 米的高度。工业规模还可被定义为在发酵液中发酵结束时的产物比如脂肪酸或-内酰胺的浓度为至少5g/l、优选地至少10g/l、更优选地至少15g/ l、更优选地至少 20g/l 和最优选地至少 25g/l。 0016 含氧气体可以是任何含氧气体，比如空气、富集氧的空气、纯氧或其混合物。优选地，含氧气体是空气。当含氧气体以在 4cm/sec 和 30cm/sec 之间、优选地在 7cm/sec 和 25cm/sec 之间、更优选地在 10cm/sec 和 20cm/sec 之间的压力校正的表面气速在。

19、发酵罐的下半部释放时，获得最佳结果。 0017 本发明的工艺适用于对感兴趣的任何有价值的化合物的发酵生产，所述化合物包括初级或次级代谢产物、药物蛋白或药物肽、或工业酶。初级代谢产物是对生长、发育或繁殖来说必需并且是许多物种所共有的生物分子。初级代谢产物例如是主要代谢途径 ( 比如糖酵解途径或 TCA 循环 ) 的中间产物。初级代谢产物的例子是氨基酸和核酸。次级代谢产物对生长、发育或繁殖来说不是必需的，但其具有生态功能。次级代谢产物的例子是抗生素或 - 内酰胺化合物，特别是 - 内酰胺抗生素。一种优选的有价值的化合物是 - 内酰胺化合物。- 内酰胺化合物的例子是克。

20、拉维酸 (clavulanic acid)、青霉素 ( 例如青霉素 G、青霉素V或6-氨基青霉烷酸)和半合成青霉素，比如阿莫西林，和头孢菌素(比如头孢菌素 C)。在一个非常优选的实施方式中，本发明提供了使用能产生青霉素 G 的 Penicillium chrysogenum菌株生产青霉素G的工艺，而且所述工艺的特征在于100的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且发酵罐是鼓泡塔。 0018 其他优选的实施方式是用于生产 - 内酰胺的工艺，其中 - 内酰胺是 - 内酰胺中间产物的 N- 酰化衍生物，比如 7- 氨基 -3- 氨基甲酰氧甲基 -3- 头孢烯 -4- 羧酸 (。

21、7ACCCA)、 7- 氨基头孢烷酸 (7-ACA)、 7- 氨基 -3- 氯 -3- 头孢烯 -4- 羧酸 (7-ACCA)、 7- 氨基脱乙酰氧 - 头孢烷酸 (7-ADCA)、 7- 氨基脱乙酰基头孢烷酸 (7-ADAC)、 7- 氨基 -3-(Z/ E)-1- 丙烯 -1- 基 -3- 头孢烯 -4- 羧酸 (7-PACA) 等等。如在 WO 93/05158、 WO 93/08287 或 WO 2004/106347 中公开的，在 7- 氨基位置上的酰基优选是产生相应己二酰衍生物的己二酸。其他的合适侧链已在 WO 95/04148、 WO 95/04149、 WO 96/385。

22、80、 WO 98/48034 和 WO 98/48035 中公开。 0019 用于本发明工艺的合适的微生物菌株可以是生产感兴趣的有价值的化合物的任何野生型菌株。此外，本发明的合适的微生物菌株可以是这样的菌株，所述菌株是通过使感兴趣的亲本菌株或野生型菌株经历经典诱变处理或经历重组DNA转化而获得和/或改进的菌株。在一个优选的实施方式中，适用于本发明的工艺的微生物菌株是藻类、酵母、真菌、原说明书 CN 103003439 A 5 4/5 页 6 生动物或细菌。微生物菌株可包括丝状菌株或非丝状菌株。 0020 优选地，微生物菌株是藻类、细菌或真菌。优选的细菌是 Ac。

23、tinomycete。优选地， Actinomycete 是 Streptomyces clavuligerus，其优选产生作为有价值的化合物的克拉维酸。优选地，真菌选自由 Aspergillus、 Trichoderma、 Penicillium 和 Acremonium 构成的组。优选的例子是，用于生产青霉素 G 或青霉素 V 的 Penicillium chrysogenum，用于生产头孢菌素 C 的 Acremonium chrysogenum，以及 Aspergilli( 比如 Aspergillus niger 或 Aspergillus oryzae)，其作为野。

24、生型菌株或经经典改进的菌株，所述菌株生产酶 ( 比如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和已知在工业中使用的其它酶 ) 或者经遗传修饰以过量表达编码这类酶的基因。 0021 在一种优选的实施方式中，真菌是 Penicillium chrysogenum，并且次级代谢产物是己二酰 -7-ADCA、己二酰 -7-ACA、己二酰 -7-ADCA、己二酰 -7-ACCA、己二酰 7-PACA 或己二酰 -7-ACCCA，最优选的是己二酰 -7-ADCA。如在 WO93/05158 中公开的， Penicillium chry。

25、sogenum 菌株被用编码扩环酶的基因转化并表达编码扩环酶的基因。该经工程改造的 Penicillium chrysogenum 菌株在存在作为侧链前体的己二酸时于发酵容器中生长时，产生并排出己二酰 -7-ADCA。 0022 可由本发明的发酵工艺生产的青霉素的例子是青霉素 G、青霉素 V 或如在 WO 2008/040731 中公开的阿莫西林以及许多其他青霉素。头孢菌素的例子是头孢菌素 C，但优选地是如上述的 7-ADCA 的 N- 酰基衍生物。 0023 出乎意料地发现，在其中 100的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且没有能量输入是通过机械手段来递送的工业规模的发酵。

26、工艺中，甚至在相对高的粘度下获得了高生产力。因而，反应培养基中的合适的粘度是从 5 厘泊至 500 厘泊，优选地从 10 厘泊至 200 厘泊，更优选地从 15 厘泊至 150 厘泊，最优选地从 25 厘泊至 75 厘泊。为了使发酵罐中的发酵液充分混合以及氧从注入的含氧气体 ( 比如空气 ) 传递进入发酵液，发酵液的粘度不应该过高并且优选地在 80 厘泊以下。粘度通常主要由两个因素确定，即发酵液中的生物质浓度和微生物的形态 ( 称为 “生物质比粘度” ) 0024 本发明的工艺不涉及面包酵母生产并因而排除面包酵母生产。面包酵母的工业生产可以在通气而不用搅拌的鼓泡塔中。

27、进行。但是，在该工艺中，产生的生物质本身是生产工艺的目的，并且根据本发明的工艺，不能通过面包酵母生产有价值的化合物。 0025 本发明的工艺可用但不限于下述建议的实施例来阐释。 0026 将具有正常开管鼓风机和 Rushton 涡轮的 100m3搅拌釜发酵罐改型来测定在粘性真菌发酵工艺中减少通过搅拌器的能量输入的作用。如期望地，降低能量输入将减少发酵罐底部的气泡分散，鼓风机被在发酵罐底部的全部表面积上分布空气的鼓风机所替代。通过改变搅拌器速率改变搅拌器的能量输入。空气流速保持恒定。在没有能量输入是通过搅拌完成的情况下，将搅拌器从容器中去除。 0027 用通过空气流的能。

28、量输入相对于通过搅拌的能量输入的各种比率 (40、 50、 75、 95 和100)，进行具有从10厘泊逐渐增加至200厘泊的粘度的用Penicillium chrysogenum 的青霉素发酵，以测定搅拌器能量输入的作用。在氧传递限制生产时的发酵阶段期间，实现所述比率。结果在图 1 和 2 中给出。 0028 当通过叶轮的能量输入减少时，产物的量减少，这是因为氧传递减少。其在通过空说明书 CN 103003439 A 6 5/5 页 7 气的从 95至 100能量输入的最后步骤中增加。这种作用被认为是由去除搅拌器引起的，搅拌器的存在和慢的动作可妨碍发酵罐中的气泡流。。

29、能量输入减少比生产量减少要多，因此每产物所需的能量的量减少 ( 见图 2)。 0029 这些图显示了当通过通气输入所有的能量时，发现了最佳作用。这导致每产物量的总花费减少以及每产物量的碳足迹更小。 0030 图例 0031 图1展示了在用Penicillium chrysogenum的青霉素发酵中每次发酵产生的产物量。X- 轴是通过空气的能量输入的量 ( 总能量输入的 )。Y- 轴是产生的产物量 ( 相对于搅拌釜发酵 )。 0032 图 2 展示了在改变搅拌器速度时，用 Penicillium chrysogenum 的青霉素发酵中的比功率消耗。X- 轴是通过空气的能量输入的量 ( 总能量输入的 )。Y- 轴是消耗的能量的量 ( 相对于搅拌釜发酵 )。说明书 CN 103003439 A 7 1/2 页 8 图 1 说明书附图 CN 103003439 A 8 2/2 页 9 图 2 说明书附图 CN 103003439 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201180031397.5	申请日：	2011.06.16
公开号：	CN103003439A	公开日：	2013.03.27
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12P 35/00申请公布日:20130327\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12P 35/00申请日:20110616\|\|\|公开
IPC分类号：	C12P35/00; C12P37/00; C12M1/04	主分类号：	C12P35/00
申请人：	中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司
发明人：	约瑟夫·约翰尼斯·玛利亚·霍米斯特; 沃特·阿德里安努斯·温登·范
地址：	荷兰海尔伦
优先权：	2010.06.22 EP 10166818.4
专利代理机构：	北京东方亿思知识产权代理有限责任公司 11258	代理人：	肖善强
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内容摘要

本发明涉及使用微生物生产有价值的化合物的工业规模发酵工艺，其中总能量输入的≥50％是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的≤50％是通过机械手段来递送的。

权利要求书

权利要求书生产化合物的工艺，所述工艺使用能产生所述化合物的藻类、细菌或真菌，其中反应培养基的体积从10m3至5000m3并且反应培养基的粘度从10厘泊至200厘泊，所述工艺的特征在于总能量输入的≥50％是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的≤50％是通过机械手段来递送的。
根据权利要求1的工艺，其中所述总能量输入的≥75％是通过注入含氧气体来递送的并且所述总能量输入的≤25％是通过机械手段来递送的。
根据权利要求1的工艺，其中100％的所述总能量输入是通过注入含氧气体来递送的。
根据权利要求1至3的任一项的工艺，其中所述注入含氧气体的压力校正表面气速是在7cm/sec和25cm/sec之间。
根据权利要求1至4的任一项的工艺，所述工艺在鼓泡塔中进行。
根据权利要求1至5的任一项的工艺，其中所述化合物是β‑内酰胺。
根据权利要求1至6的任一项的工艺，其中所述藻类、细菌或真菌是Acremonium种或Penicillium种。
根据权利要求6至7的任一项的工艺，其中所述化合物是己二酰‑7‑ACA、己二酰‑7‑ADCA或青霉素G。

说明书

说明书气泡发酵工艺
技术领域
本发明涉及在工业规模上发酵生产有价值的化合物，其中总能量输入的≥50％是通过注入含氧气体来递送的。
发明背景
很多有价值的化合物是通过在大的工业规模的发酵罐中发酵生产来制造的，在所述发酵罐中，可以是丝状真菌(比如针对像β‑内酰胺的化合物是Penicillium chrysogenum)的微生物在受控条件下生产有价值的化合物。为了在发酵液中获得有价值的化合物的高生产力，需要高生物质浓度。大多数发酵工艺以带有搅拌和通气的浸没式发酵进行。为了给微生物提供必要的氧气，通气是必要的，并且为了确保发酵液和气泡的良好混合以实现从注入的空气进入发酵液的有效氧传递，搅拌是必要的。氧传递的效率由于发酵液的高粘度而被减小，所述发酵液的高粘度是由发酵液中的高生物质浓度和/或由使用的微生物的形态学引起的。低效的混合导致具有降低的生物质形成的降低的氧传递，和因此降低的有价值化合物生产。在大多数常见工艺中，特别是用于生产β‑内酰胺(比如青霉素G)的大多数常见工艺中，约30‑40％的能量输入源自空气注入并且大约60‑70％来自机械搅拌。搅拌和空气注入都将大量的能量引入了发酵罐中，所述发酵罐增加由微生物生长产生的热量并通常被迫(强迫)冷却以将发酵工艺的温度保持在期望值。
在过去50年中，大量研究工作集中在改进例如β‑内酰胺的发酵工艺，对青霉素G特别关注。1950‑1984年这段时期已被G.J.M Hersbach，C.P van der Beek and P.W.M van Dijk(The penicillins：properties，biosynthesis and fermentation.In：E.J Vandamme，Editor，Biotechnology of industrial antibiotics，Marcel Dekker，New York(1984)，45 140)综述过。通过增加搅动功率和通气速率，增加最大氧传递。这些措施的缺点是，引入了更多的能量，其还需要改进的冷却能力并因而增加了产物的成本费用(Hersbach等人，95页)。或者，可选择给予较低粘度发酵液的菌株和/或发酵条件(Hersbach等人，51页，第4段)。
最近，Burlingame和Verdoes(BioPharm Int.，2006，19(1)，1‑5)分离了Chrysosporium lucknowense的低粘度突变体，所述突变体显示了特征为菌丝碎片的形态学和命名为“繁殖体”的分散单元(element)的形成。这些繁殖体的培养物展示了更低的粘度、更好的营养物和氧传递以及更高的蛋白生产。当两种菌株在类似条件下生长时，与亲本菌株比较，低粘度突变体产生了约2倍的总蛋白产率。低粘度菌株允许进一步改进的培养条件，当应用所述条件时，其导致蛋白生产额外的3倍增加。
还通过改变发酵罐中的进料策略，已获得了粘度降低。例如，Bhargava等人(Biotechnol.Bioeng.，2003，82，111‑117)表明，在使用产生重组葡糖淀粉酶的Aspergillus oryzae菌株的发酵中，限制碳源的脉冲‑进料策略降低了粘度和平均菌丝体颗粒大小。伴随这些改变，由这些菌株的葡糖淀粉酶生产量得以增加。
已发现在发酵工艺中使用固定化细胞时高粘度的另一解决方案。现有技术中有很多公开，其中已在摇瓶、小规模实验室发酵罐、鼓泡塔和气升罐中用固定化细胞进行发酵，见B.Konig等人(Biotechnol.Bioeng.，1982，24(2)，259‑280)、Gbewonyo等人(Biotechnol.Bioeng.，1983，25(12)，2873‑2887)、Al‑Qodah Zakaria(Appl.Biochem.Biotechnol.，2000，87(1)，37‑55)、M.Gavrilescu等人(Acta Biotechnologica，1998，18(3)，201‑229)、W.Zhou等人(J.Biotechnol.，1993，28(2‑3)，165‑177)、Punita Mishra等人(World J.Microbiol.Biotechnol.，2005，21(4)，525‑530)、P.Srivastava等人(Process Biochem.，1999，34(4)，329)、M.Kawagoe等人(J.Ferm.Bioeng.，1997，84(4)，333‑336)和M.Kawagoe等人(J.of Bioscience and Bioeng.，1999，87(1)，116‑118)。例如Gbewonyo等人(Biotechnol.Bioeng.，1983，25(12)，2873‑2887)表明了，通过固定化Penicillium chrysogenum并将菌丝体生长限于微珠粒，较之自由悬浮的菌丝体结构，在3升鼓泡塔中的青霉素生产量被改进了许多。作者已建议：当细胞以球状球团的形式生长时，培养发酵液保留较小的粘性并能保持更好的气液质量传递性质。
但是，使用固定化细胞的缺点是细胞生长减少。结果，发酵液中的产物水平也非常低。在Gbewonyo等人的具体的例子中，每升发酵液仅获得5.5g的青霉素G。尽管该值比在鼓泡塔中的用悬浮细胞的对照实验高出10倍，但其比在搅拌且通气的发酵罐中的青霉素G的工业生产期间获得的水平(＞25g/l)低得多。
而且，为技术人员所熟知的是，在小规模发酵罐中获得的生产力通常不完全代表在较大规模下获得的那些生产力，特别是当有某一程度的粘度时。例如，大规模的混合时间通常比小规模的混合时间长得多，其可导致限制生产力的营养物的浓度中的梯度的存在。当应用至大规模的发酵，比如10m3规模或更大规模的发酵时，在小规模上论证的现有技术中提出的建议因而不是必然成功的。现有技术从未公开也没有建议：通常在搅拌的通气的发酵罐中进行的有价值化合物的工业规模粘性发酵工艺可在鼓泡塔中以高生物质浓度有利地进行。
发明详述
在第一方面中，本发明提供了生产化合物的工艺，所述工艺使用能产生所述化合物的藻类、细菌或真菌，其中反应培养基的体积从10m3至5000m3并且反应培养基的粘度从10厘泊至200厘泊，所述工艺的特征在于总能量输入的≥50％是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的≤50％是通过机械手段来递送的。优选地，总能量输入的≥75％并且更优选地≥95％是通过注入含氧气体来递送的并且总能量输入的≤50％、优选地≤25％、更优选地≤5％是通过机械手段来递送的。在最优选的实施方式中，100％的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且没有能量输入是通过机械手段来递送的。该实施方式包括鼓泡塔，所述鼓泡塔特征在于通过注入含氧气体来实现发酵罐的内含物的混合。本发明的优势是，通过注入含氧气体来减少或替代用于能量输入的机械手段，增加了在发酵工艺中的有价值的化合物对能量的产率(例如，被定义为在发酵工艺中每单位量的消耗的能量所产生的β‑内酰胺的量)。
在本发明上下文中，术语“总能量输入”被定义为通过压缩气体或机械手段引入发酵罐中的组合能量并且排除通过进料至发酵罐中的气体或液体所引入的化学能或热能。
在本发明上下文中，术语“机械手段”在本文中被定义为能将能量直接(即不是间接地经由气相)输入液相的任何手段。合适的手段是本领域技术人员所熟知的搅拌设备。用于发酵罐的搅拌设备在本领域中详细记载并且是商业上广泛可得到的。
在本发明上下文中，术语“鼓泡塔”是指由垂直排列的圆柱形柱组成的用于气液反应的装置，所述圆柱形柱可以以许多构建形式构造。气体引入在柱的下半部发生并引起紊流以确保最佳气体交换。通过气体鼓泡(gas sparging)以及由上升的气泡而产生的液体转移和夹带，发生混合。鼓泡塔的特征在于高液体含量和适度相界面并被用在各种类型的发酵中。
“工业规模”在本文中被定义为在下述发酵罐中进行的发酵工艺，所述发酵罐具有≥10m3、优选地≥25m3、更优选地≥50m3、最优选地≥100m3、优选地小于5000m3的体积。或者，工业规模在本文中可被定义为具有至少4米、更优选地至少5米、更优选地至少6米、更优选地至少7米、更优选地至少8米、更优选地至少9米、更优选地至少10米的高度的发酵罐。优选地，发酵罐具有小于15米的高度。工业规模还可被定义为在发酵液中发酵结束时的产物比如脂肪酸或β‑内酰胺的浓度为至少5g/l、优选地至少10g/l、更优选地至少15g/l、更优选地至少20g/l和最优选地至少25g/l。
含氧气体可以是任何含氧气体，比如空气、富集氧的空气、纯氧或其混合物。优选地，含氧气体是空气。当含氧气体以在4cm/sec和30cm/sec之间、优选地在7cm/sec和25cm/sec之间、更优选地在10cm/sec和20cm/sec之间的压力校正的表面气速在发酵罐的下半部释放时，获得最佳结果。
本发明的工艺适用于对感兴趣的任何有价值的化合物的发酵生产，所述化合物包括初级或次级代谢产物、药物蛋白或药物肽、或工业酶。初级代谢产物是对生长、发育或繁殖来说必需并且是许多物种所共有的生物分子。初级代谢产物例如是主要代谢途径(比如糖酵解途径或TCA循环)的中间产物。初级代谢产物的例子是氨基酸和核酸。次级代谢产物对生长、发育或繁殖来说不是必需的，但其具有生态功能。次级代谢产物的例子是抗生素或β‑内酰胺化合物，特别是β‑内酰胺抗生素。一种优选的有价值的化合物是β‑内酰胺化合物。β‑内酰胺化合物的例子是克拉维酸(clavulanic acid)、青霉素(例如青霉素G、青霉素V或6‑氨基青霉烷酸)和半合成青霉素，比如阿莫西林，和头孢菌素(比如头孢菌素C)。在一个非常优选的实施方式中，本发明提供了使用能产生青霉素G的Penicillium chrysogenum菌株生产青霉素G的工艺，而且所述工艺的特征在于100％的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且发酵罐是鼓泡塔。
其他优选的实施方式是用于生产β‑内酰胺的工艺，其中β‑内酰胺是β‑内酰胺中间产物的N‑酰化衍生物，比如7‑氨基‑3‑氨基甲酰氧甲基‑3‑头孢烯‑4‑羧酸(7ACCCA)、7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)、7‑氨基‑3‑氯‑3‑头孢烯‑4‑羧酸(7‑ACCA)、7‑氨基脱乙酰氧‑头孢烷酸(7‑ADCA)、7‑氨基脱乙酰基头孢烷酸(7‑ADAC)、7‑氨基‑3‑[(Z/E)‑1‑丙烯‑1‑基]‑3‑头孢烯‑4‑羧酸(7‑PACA)等等。如在WO 93/05158、WO 93/08287或WO 2004/106347中公开的，在7‑氨基位置上的酰基优选是产生相应己二酰衍生物的己二酸。其他的合适侧链已在WO 95/04148、WO 95/04149、WO 96/38580、WO 98/48034和WO 98/48035中公开。
用于本发明工艺的合适的微生物菌株可以是生产感兴趣的有价值的化合物的任何野生型菌株。此外，本发明的合适的微生物菌株可以是这样的菌株，所述菌株是通过使感兴趣的亲本菌株或野生型菌株经历经典诱变处理或经历重组DNA转化而获得和/或改进的菌株。在一个优选的实施方式中，适用于本发明的工艺的微生物菌株是藻类、酵母、真菌、原生动物或细菌。微生物菌株可包括丝状菌株或非丝状菌株。
优选地，微生物菌株是藻类、细菌或真菌。优选的细菌是Actinomycete。优选地，Actinomycete是Streptomyces clavuligerus，其优选产生作为有价值的化合物的克拉维酸。优选地，真菌选自由Aspergillus、Trichoderma、Penicillium和Acremonium构成的组。优选的例子是，用于生产青霉素G或青霉素V的Penicillium chrysogenum，用于生产头孢菌素C的Acremonium chrysogenum，以及Aspergilli(比如Aspergillus niger或Aspergillus oryzae)，其作为野生型菌株或经经典改进的菌株，所述菌株生产酶(比如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、半纤维素酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和已知在工业中使用的其它酶)或者经遗传修饰以过量表达编码这类酶的基因。
在一种优选的实施方式中，真菌是Penicillium chrysogenum，并且次级代谢产物是己二酰‑7‑ADCA、己二酰‑7‑ACA、己二酰‑7‑ADCA、己二酰‑7‑ACCA、己二酰7‑PACA或己二酰‑7‑ACCCA，最优选的是己二酰‑7‑ADCA。如在WO93/05158中公开的，Penicillium chrysogenum菌株被用编码扩环酶的基因转化并表达编码扩环酶的基因。该经工程改造的Penicillium chrysogenum菌株在存在作为侧链前体的己二酸时于发酵容器中生长时，产生并排出己二酰‑7‑ADCA。
可由本发明的发酵工艺生产的青霉素的例子是青霉素G、青霉素V或如在WO 2008/040731中公开的阿莫西林以及许多其他青霉素。头孢菌素的例子是头孢菌素C，但优选地是如上述的7‑ADCA的N‑酰基衍生物。
出乎意料地发现，在其中100％的总能量输入是通过注入含氧气体来递送的并且没有能量输入是通过机械手段来递送的工业规模的发酵工艺中，甚至在相对高的粘度下获得了高生产力。因而，反应培养基中的合适的粘度是从5厘泊至500厘泊，优选地从10厘泊至200厘泊，更优选地从15厘泊至150厘泊，最优选地从25厘泊至75厘泊。为了使发酵罐中的发酵液充分混合以及氧从注入的含氧气体(比如空气)传递进入发酵液，发酵液的粘度不应该过高并且优选地在80厘泊以下。粘度通常主要由两个因素确定，即发酵液中的生物质浓度和微生物的形态(称为“生物质比粘度”)
本发明的工艺不涉及面包酵母生产并因而排除面包酵母生产。面包酵母的工业生产可以在通气而不用搅拌的鼓泡塔中进行。但是，在该工艺中，产生的生物质本身是生产工艺的目的，并且根据本发明的工艺，不能通过面包酵母生产有价值的化合物。
本发明的工艺可用但不限于下述建议的实施例来阐释。
将具有正常开管鼓风机和Rushton涡轮的100m3搅拌釜发酵罐改型来测定在粘性真菌发酵工艺中减少通过搅拌器的能量输入的作用。如期望地，降低能量输入将减少发酵罐底部的气泡分散，鼓风机被在发酵罐底部的全部表面积上分布空气的鼓风机所替代。通过改变搅拌器速率改变搅拌器的能量输入。空气流速保持恒定。在没有能量输入是通过搅拌完成的情况下，将搅拌器从容器中去除。
用通过空气流的能量输入相对于通过搅拌的能量输入的各种比率(40、50、75、95和100％)，进行具有从10厘泊逐渐增加至200厘泊的粘度的用Penicillium chrysogenum的青霉素发酵，以测定搅拌器能量输入的作用。在氧传递限制生产时的发酵阶段期间，实现所述比率。结果在图1和2中给出。
当通过叶轮的能量输入减少时，产物的量减少，这是因为氧传递减少。其在通过空气的从95％至100％能量输入的最后步骤中增加。这种作用被认为是由去除搅拌器引起的，搅拌器的存在和慢的动作可妨碍发酵罐中的气泡流。能量输入减少比生产量减少要多，因此每产物所需的能量的量减少(见图2)。
这些图显示了当通过通气输入所有的能量时，发现了最佳作用。这导致每产物量的总花费减少以及每产物量的碳足迹更小。
图例
图1展示了在用Penicillium chrysogenum的青霉素发酵中每次发酵产生的产物量。X‑轴是通过空气的能量输入的量(总能量输入的％)。Y‑轴是产生的产物量(相对于搅拌釜发酵)。
图2展示了在改变搅拌器速度时，用Penicillium chrysogenum的青霉素发酵中的比功率消耗。X‑轴是通过空气的能量输入的量(总能量输入的％)。Y‑轴是消耗的能量的量(相对于搅拌釜发酵)。