基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103146835 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146835 A *CN103146835A* (21)申请号 201310098339.5 (22)申请日 2013.03.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/42(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 华南师范大学 地址 510631 广东省。

2、广州市天河区石牌中山 大道西 55 号 (72)发明人 邢达 詹芳芳 周小明 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 苏运贞 (54) 发明名称 基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法 及试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 NASBA 的试纸条检测 食源致病菌的方法及试剂盒， 属于生物检测技术 领域。该方法包括如下步骤 ：（1） 提取食源致病 菌的 RNA ；（2） 设计扩增引物 ；（3） 进行 NASBA 反 应 ；（4） 设计捕捉探针 ；（5） 制备纳米金探针 ；（6） 制备胶体金核酸试纸条 ；（7） 样品的检测。使用该 方法检测。

3、单增李斯特菌的试剂盒包括引物 （如SEQ ID NO.1 和 2 所示） 、 酶、 缓冲液、 RNaseH、 RNA 酶抑 制剂、 dNTPs、 NTPs、 探针 （如SEQ ID NO.4、 5和6所 示） 和胶体金核酸试剂条等。 本方法将NASBA与试 纸条检测结合， 可以实现定性或者定量检测， 成本 低， 检测速度快， 特异性好， 灵敏度高， 使用安全。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书7页 序列表3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 10314。

4、6835 A CN 103146835 A *CN103146835A* 1/3 页 2 1. 一种基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于包括如以下步骤 ： （1） 模板的准备 ： 提取食源致病菌的 RNA ； （2） 设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物 ： T7 引物和引物 2， T7 引物中含 有能被 T7RNA 聚合酶识别的 T7 启动子序列 ； （3） NASBA 反应 ： 将步骤 （1） 制备的模板、 步骤 （2） 设计合成的引物进行 NASBA 扩增反 应， 得到单链 RNA 产物 ； （4） 探针的设计 ： 根据单链 RNA 产物的序列设计三条捕捉。

5、探针， 探针 1 和探针 2 分别和 单链 RNA 产物的两端互补， 探针 3 与探针 1 完全互补 ； 三条探针的一端都修饰有功能基团 ； （5） 纳米金探针的制备 ： 将步骤 （4） 中所设计合成的探针 1 与纳米金连接制备纳米金探 针， 并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针 ； （6） 胶体金核酸试纸条的制备 胶体金核酸试纸条由底板、 样品板、 金垫、 硝酸纤维素膜和吸水板构成， 将样品板、 金 垫、 硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条 ； 所述的金垫包埋有步骤 （5） 制备的纳米金探针 ； 所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和 素和探针 3 的。

6、控制线和含链霉亲和素和探针 2 的检测线 ； （7） 检测 ： 将由步骤 （3） 得到的 RNA 产物与含甲酰胺的柠檬酸钠缓冲液混合， 混合液滴 加到胶体金核酸试纸条的样品板上， 再滴加柠檬酸钠缓冲液， 读取结果， 检测线和控制线都 变成红色表明有靶序列存在， 即有待测食源致病菌， 仅有控制线变成红色表明没有待测食 源致病菌。 2. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌、 沙门氏菌、 大肠杆菌 O157:H7、 志贺 氏菌、 金黄色葡萄球菌、 副溶血弧菌、 创伤弧菌和蜡状芽孢杆菌 ； 步骤 （。

7、2） 中所述的食源致病菌保守序列为食源致病菌 16S rRNA 基因的可变区序列或 毒力基因片段 ； 步骤 （2） 中所述的 T7 启动子序列为 TAATACGACTCACTATAGGGAGA。 3. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中所述的 NASBA 反应的体系包含 ： 模板 RNA、 AMV 逆转录酶、 AMV 逆转录酶缓 冲液、 T7RNA 聚合酶、 T7RNA 聚合酶缓冲液、 RNaseH、 RNA 酶抑制剂、 T7 引物、 引物 2、 dNTPs、 NTPs、 牛血清白蛋白、 DMSO 和 DEPC 处理水 ；。

8、 所述的 T7 引物的终浓度为 300 500nM ； 所述 的引物 2 的终浓度为 300 500nM ； 步骤 （3） 中所述的单链 RNA 产物的长度为 120 270nt。 4. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 所述的NASBA反应的条件为每25L反应体系的组成如下 ： 模板RNA1ng/L、 T7 引物 400nM、 引物 2400nM、 AMV 逆转录酶 8U、 AMV 逆转录酶缓冲液、 T7RNA 聚合酶 36U、 RNA 酶抑制剂 10U、 RNaseH5U、 NTPs2mM、 dNTPs1mM、 DMSO。

9、 的体积百分比为 10%、 牛血清白蛋白终浓 度为0.1g/L ； 扩增过程为 ： 配制混合液A于65加热5分钟， 再于41冷却5min， 加入 酶混合液， 于 41孵育 90min， 4终止反应 ； 所述的混合液 A 包括 ： 模板 RNA、 T7 引物、 引物 2、 dNTPs、 NTPs、 5T7RNA 聚合酶缓冲液、 5AMV 逆转录酶缓冲液、 DMSO 和 DEPC 处理水 ； 所 述的酶混合液包括 ： 5T7RNA 聚合酶缓冲液、 5AMV 逆转录酶缓冲液、 AMV 逆转录酶、 T7RNA 权 利 要 求 书 CN 103146835 A 2 2/3 页 3 聚合酶、 RNaseH。

10、、 RNA 酶抑制剂、 牛血清白蛋白和 DEPC 处理水。 5. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中所述的探针 1 和探针 2 的长度为 20 30nt ； 步骤 （4） 中所述的探针 1 的功能基团为巯基， 探针 2 和探针 3 的功能基团为生物素。 6. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （5） 中所述的纳米金的粒径为 13nm ； 步骤 （5） 中所述的包埋缓冲液为 ： Na3PO420mM， BSA 质量百分比 5%， Tween X-100 体积百 分。

11、比 0.25%， 蔗糖质量百分比 8%。 7. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （6） 中所述的底板的材料为聚氯乙烯塑料 ； 步骤 （6）中所述的样品板的材料为玻璃纤维， 其处理方法为 ： 用样品板处理缓冲液 浸润， 置于干燥器中室温保存 ； 所述的样品板处理缓冲液为 ： pH8.0， 体积百分比 0.25% 的 Triton X-100， 0.05M Tris-HCl， 0.15M NaCl ； 步骤 （6） 中所述的金垫的材料为玻璃纤维， 其处理方法为 ： 用 50L 步骤 （4） 中所述的 用于包埋的纳米金探针喷在其上， 室。

12、温下干燥， 干燥器中 4保存 ； 步骤 （6） 中所述的硝酸纤维素膜的处理方法为 ： 用喷膜仪将 6L 链霉亲和素溶液和 探针 2 混合液喷到检测线的位置， 将 6L 链霉亲和素溶液和探针 3 混合液喷到控制线的位 置， 置于室温下干燥 1h， 并于 4干燥保存 ； 所述的链霉亲和素溶液浓度为 1.67mg/mL， 所述 的探针 2 和探针 3 的浓度为 1mM ； 步骤 （6） 中所述的吸水板的材料为吸水纤维 ； 步骤 （6） 中所述的组装为 ： 底板在最下层， 硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位， 金 垫位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠， 样品板位于金垫的上部与之重叠， 吸水板 位于。

13、硝酸纤维素膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠。 8. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 步骤 （7） 中所述的样品的检测的过程为 ： 将25L由步骤 （3） 得到的RNA产物与125L 含体积浓度 6% 甲酰胺的 4 柠檬酸钠缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品 板上， 10min 后， 再滴加 50L4 柠檬酸钠缓冲液， 15min 之内读取结果。 9. 根据权利要求 1 所述的基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法， 其特征在于 ： 所述的食源致病菌为单增李斯特菌时， 其保守序列为 16S rRNA。

14、 基因 ； 扩增保守序列的引物为 ： T7 引物 ： 5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3 ； 引物 2 ： 5 -AGCTTGCTCTTCCAA-3 ； 探针 1 为 ： 5 - 巯基 -GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3 ； 探针 2 为 ： 5 -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG- 生物素 -3 ； 探针 3 为 ： 5 - 生物素 -CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3 。 10. 使用权利要求 1 7 任一项所述的方法检测单增李斯特菌的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包含 A。

15、、 B 两个分试剂盒 ； A 分试剂盒包含引物、 酶、 酶缓冲液、 RNaseH、 RNA 酶抑制剂、 牛血清白蛋白、 dNTPs、 NTPs、 DMSO、 DEPC 处理水， 其中 ： 权 利 要 求 书 CN 103146835 A 3 3/3 页 4 所述的引物包括 T7 引物和引物 2 ： T7 引物 ： 5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAGC GATAGCC-3 ； 引物 2 ： 5 -AGCTTGCTCTTCCAA-3 ； 所述的酶包括 AMV 逆转录酶和 T7RNA 聚合酶 ； 所述的酶缓冲液包括 ： AMV 逆转录酶缓冲液、 T7R。

16、NA 酶缓冲液 ； B 分试剂盒包含探针、 缓冲液、 胶体金核酸试剂条 ； 所述的探针包括探针 1、 2 和 3 ： 探针 1 为 ： 5 - 巯基 -GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3 ； 探针 2 为 ： 5 -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG- 生物素 -3 ； 探针 3 为 ： 5 - 生物素 -CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3 ； 所述的缓冲液包括 4 柠檬酸钠缓冲液、 含体积浓度 6% 甲酰胺的 4 柠檬酸钠缓冲 液 ； 所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板上且依次搭接的样品板、 金垫、 硝酸纤维素 膜和吸水板 ； 金垫包埋有连接探针 1 。

17、的纳米金探针 ； 硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探 针 3 的控制线和含链霉亲和素和探针 2 的检测线， 检测线靠近金垫， 控制线靠近吸水板。 权 利 要 求 书 CN 103146835 A 4 1/7 页 5 基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物检测技术领域， 涉及一种基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的 方法及试剂盒。 背景技术 0002 我国是食品消费和生产的世界第一大国， 食品安全是重大的民生问题， 是国家和 人民密切关注的话题。然而近些年我国的食品安全事故频繁发生， 食品安全问题已然成为 国人心中挥之不去的梦魇。据调查， 。

18、让人不安的食品安全是导致民众幸福指数较低的主要 原因。 食源性疾病是食品安全的最大问题， 给消费者健康和安全带来严重威胁。 食源致病菌 是引起食源性疾病的主要致病因子。 2011年10月， 上海家乐福超市的思念牌三鲜水饺被检 出含有金黄色葡萄球菌， 该细菌很可能会导致肺炎。 2012年4月， 广东有两批次婴儿配方奶 粉被检出含有阪崎肠杆菌， 该病菌能引起严重的新生儿脑膜炎、 小肠结肠炎和败血症， 死亡 率高达 50% 以上。2012 年 11 月， 国家质检总局组织了产品质量国家监督抽查， 福建省的扭 扭虾味条大肠菌群实测值是标准值的 100 倍以上。食源致病菌一直难以得到及时有效的监 控， 。

19、不仅对食品卫生和人民健康构成严重威胁， 也对食品工业和国民经济造成很大的影响。 因此， 发展一种快速、 灵敏、 特异、 安全的检测食源致病菌的方法对食品安全体系的完善、 预 防人类食源性疾病的发生具有重要意义。 0003 传统的食源致病菌的检测方法主要有培养鉴定法、 电子显微镜观察法、 免疫学检 测方法等。 培养鉴定法的操作烦琐， 需时较长， 而其他方法具有灵敏度低、 特异性不高、 耗时 长、 需要昂贵仪器等缺点。 传统的方法在相当程度上限制了对食源致病菌的快速检测能力， 而近年来发展的分子生物学新技术就能够实现高通量、 快速、 准确的检测， 其中核酸扩增技 术使得分子检测的灵敏度和准确性大大。

20、提高。为了使扩增技术更适应现代分子诊断的需 求， 许多研究都集中在新的检测技术的开发。试纸条检测技术无疑为分子检测提供了便捷 的途径。近期， 基于与核酸扩增技术相结合的核酸试纸条发展迅速， 其与免疫试纸条相比， 具有成本低、 应用范围广、 灵敏度高、 准确性好的特点。 0004 依赖核酸序列扩增 （Nucleic acid sequence-based amplification， NASBA） 是一 种特别适合扩增 RNA 的技术， 是由 1 对带有 T7 启动子序列的引物引导的灵敏的恒温扩增技 术， 其产生的大量单链 RNA 易于在试纸条上实现快速、 准确、 高灵敏度检测。 发明内容 00。

21、05 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种基于 NASBA 与试纸 条检测结合的快速、 灵敏、 准确、 操作简便的检测食源致病菌的方法。 0006 本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法检测单增李斯特菌的试剂盒。 0007 本发明的目的通过下述技术方案实现， 基于 NASBA 的试纸条检测食源致病菌的方 法， 具体包括以下步骤 ： 0008 （1） 模板的准备 ： 提取食源致病菌的 RNA。 说 明 书 CN 103146835 A 5 2/7 页 6 0009 （2） 设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物 ： T7 引物和引物 2， T7 引物 中含有能被 T7。

22、RNA 聚合酶识别的 T7 启动子序列。 0010 （3） NASBA 反应 ： 将步骤 （1） 制备的模板、 步骤 （2） 设计合成的引物进行 NASBA 扩 增反应， 得到单链 RNA 产物。 0011 （4） 探针的设计 ： 根据单链 RNA 产物的序列设计三条捕捉探针， 探针 1 和探针 2 分 别和单链RNA产物的两端互补， 探针3与探针1完全互补 ； 三条探针的一端都修饰有功能基 团。 0012 （5） 纳米金探针的制备 ： 将步骤 （4） 中所设计合成的探针 1 与纳米金连接制备纳米 金探针， 并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。 0013 （6） 胶体金核酸试。

23、纸条的制备 0014 胶体金核酸试纸条由底板、 样品板、 金垫、 硝酸纤维素膜 （NC 膜） 和吸水板构成， 将 样品板、 金垫、 硝酸纤维素膜 （NC 膜） 和吸水板依次搭接固定于底板上 （如图 5 所示结构） 组 装得到胶体金核酸试纸条。 0015 所述的金垫包埋有步骤 （5） 制备的纳米金探针 ； 所述的硝酸纤维素膜上有含链霉 亲和素和探针 3 的控制线 （C 线） 和含链霉亲和素和探针 2 的检测线 （T 线） ， 检测线靠近金 垫， 控制线靠近吸水板。 0016 （7） 检测 ： 将由步骤 （3） 得到的 RNA 产物与含甲酰胺 （甲酰胺能够破坏 RNA 的二级 结构， 从而提高其与。

24、探针的杂交效率） 的 SSC 缓冲液 （柠檬酸钠缓冲液） 混合， 混合液滴加到 胶体金核酸试纸条的样品板上， 再滴加 SSC 缓冲液， 读取结果， 检测线和控制线都变成红色 表明有靶序列存在， 即有待测食源致病菌， 仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌。 0017 步骤 （1）中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌 （Listeria monocytogenes） 、 沙门氏菌 （Salmonella enterica） 、 大肠杆菌 O157:H7（Escherichia coli O157:H7） 、 志贺氏菌 （Shigella.Spp） 、 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcu。

25、s aureus） 、 副溶血弧菌 （Vibrio parahaemolyticus） 、 创伤弧菌 （Vibrio vulnificus） 和蜡状芽孢杆菌 （Yersinia enterocolitica） 等。 0018 步骤 （2） 中所述的食源致病菌保守序列优选为食源致病菌 16S rRNA 基因的可变 区序列或毒力基因片段， 如单增李斯特菌 16S 核糖体 RNA 基因 （16S rRNA 基因） 、 沙门氏菌 的侵袭基因 A（invA） 等。 0019 步骤 （2） 中所述的 T7 启动子序列为 TAATACGACTCACTATAGGGAGA。 0020 步骤 （3） 中所述的 N。

26、ASBA 反应的体系包含 ： 模板 RNA、 AMV 逆转录酶、 AMV 逆转录酶 缓冲液、 T7RNA 聚合酶、 T7RNA 聚合酶缓冲液、 RNaseH、 RNA 酶抑制剂、 T7 引物、 引物 2、 dNTPs、 NTPs、 牛血清白蛋白 （BSA） 、 二甲基亚砜 （DMSO） 和 DEPC（焦碳酸二乙酯） 处理水 ； 所述的 T7 引物的终浓度为 300 500nM ； 所述的引物 2 的终浓度为 300 500nM。 0021 步骤 （3）中所述的 NASBA 反应的条件优选为每 25L 反应体系的组成如下 ： 模 板 RNA1ng/L、 T7 引物 400nM、 引物 2400n。

27、M、 AMV 逆转录酶 8U、 AMV 逆转录酶缓冲液、 T7RNA 聚合酶 36U、 RNA 酶抑制剂 10U、 RNaseH5U、 NTPs2mM（每种核糖核苷三磷酸的浓度为 2mM） 、 dNTPs1mM（每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为 1mM） 、 DMSO 的体积百分比为 10%、 BSA 终浓度 为 0.1g/L ； 扩增过程优选为 ： 配制混合液 A 于 65加热 5 分钟， 再于 41冷却 5min， 加入酶混合液， 于 41孵育 90min， 4终止反应 ； 所述的混合液 A 包括 ： 模板 RNA、 T7 引物、 说 明 书 CN 103146835 A 6 3/7 页 7。

28、 引物 2、 dNTPs、 NTPs、 5T7RNA 聚合酶缓冲液、 5AMV 逆转录酶缓冲液、 DMSO 和 DEPC 处理 水 ； 所述的酶混合液包括 ： 5T7RNA聚合酶缓冲液、 5AMV逆转录酶缓冲液、 AMV逆转录酶、 T7RNA 聚合酶、 RNaseH、 RNA 酶抑制剂、 BSA 和 DEPC 处理水。 0022 步骤 （3） 中所述的单链 RNA 产物的长度优选为 120 270nt。 0023 步骤 （4） 中所述的探针 1 和探针 2 的长度优选为 20 30nt。 0024 步骤 （4） 中所述的探针 1 的功能基团优选为巯基， 探针 2 和探针 3 的功能基团优 选为。

29、生物素。 0025 步骤 （5） 中所述的纳米金的粒径优选为 13nm。 0026 步骤 （5） 中所述的包埋缓冲液为 ： Na3PO420mM， BSA（牛血清白蛋白） 质量百分比 5%， Tween X-100 体积百分比 0.25%， 蔗糖质量百分比 8%。 0027 步骤 （6） 中所述的底板的材料优选为 PVC 塑料 （聚氯乙烯塑料） 。 0028 步骤 （6）中所述的样品板的材料优选为玻璃纤维， 其处理方法为 ： 用样品板处 理缓冲液浸润， 置于干燥器中室温保存 ； 所述的样品板处理缓冲液为 ： pH8.0， 体积百分比 0.25% 的 Triton X-100， 0.05M Tr。

30、is-HCl， 0.15M NaCl。 0029 步骤 （6） 中所述的金垫的材料优选为玻璃纤维， 其处理方法为 ： 用 50L 步骤 （4） 中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上， 室温下干燥， 干燥器中 4保存。 0030 步骤 （6） 中所述的硝酸纤维素膜的处理方法优选为 ： 用喷膜仪将 6L 链霉亲和素 溶液和探针 2 混合液喷到检测线 （T 线） 的位置， 将 6L 链霉亲和素溶液和探针 3 混合液 喷到控制线 （C 线） 的位置， 置于室温下干燥 1h， 并于 4干燥保存 ； 所述的链霉亲和素溶液 浓度为 1.67mg/mL， 所述的探针 2 和探针 3 的浓度为 1mM ； 所述。

31、的检测线宽 2mm 与金垫相隔 6mm， 所述的控制线宽 2mm 与金垫相隔 12mm。 0031 步骤 （6） 中所述的吸水板的材料优选为吸水纤维。 0032 步骤 （6） 中所述的组装优选为 ： 底板在最下层， NC 膜粘贴在底板上的中间部位， 金 垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠2mm， 样品板位于金垫的上部与之重叠2mm， 吸水板位 于NC膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与NC膜重叠2mm， 最后用切条机切成4mm宽 的条。 0033 步骤 （7） 中所述的样品的检测的过程优选为 ： 将 25L 由步骤 （3） 得到的 RNA 产 物与 125L 含体积浓度 6% 甲酰胺的 4S。

32、SC 缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条 的样品板上， 10min 后， 再滴加 50L4SSC 缓冲液， 15min 之内读取结果。 0034 所述的食源致病菌为单增李斯特菌时， 其保守序列为 16S rRNA 基因 ； 0035 扩增保守序列的引物为 ： 0036 T7 引物 ： 5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3 ； 0037 引物 2 ： 5 -AGCTTGCTCTTCCAA-3 ； 0038 单链 RNA 产物的序列为 ： 5 -CAUCUGUAAGCGAUAGCCGAAACCAUC UUUCAAAAGCGUG。

33、GCAU GCGCCACACUUUAUCAUUCGGUAUUAGCUCCGGUUUCCCGGAGUUAUCCCCAACUUACAGGCAGGUUGCCCACGUGU UA CUCACCCGUCCGCCACUAACUUUGGAAGAGCAAGCU-3 ； 单下划线部分为与探针1互补配对的， 双 下划线表示的是探针 2 结合的区域 ； 探针 3 与探针 1 完全互补 ； 0039 探针 1 为 ： 5 -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3 （SH 表示巯基） ； 0040 探针 2 为 ： 5 -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bio-3 （Bio 表示生物素） 。

34、； 说 明 书 CN 103146835 A 7 4/7 页 8 0041 探针 3 为 ： 5 -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3 （Bio 表示生物素） 。 0042 使用上述方法检测单增李斯特菌的试剂盒， 包含 A、 B 两个分试剂盒 ； 0043 A 分试剂盒包含引物、 酶、 酶缓冲液、 RNaseH、 RNA 酶抑制剂、 牛血清白蛋白 （BSA） 、 dNTPs、 NTPs、 DMSO、 DEPC 处理水， 其中 ： 0044 所述的引物包括 T7 引物和引物 2 ： 0045 T7 引物 ： 5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACA。

35、TCTGTAAG CGATAGCC-3 ； 0046 引物 2 ： 5 -AGCTTGCTCTTCCAA-3 ； 0047 所述的酶包括 AMV 逆转录酶和 T7RNA 聚合酶 ； 0048 所述的酶缓冲液包括 ： AMV 逆转录酶缓冲液、 T7RNA 酶缓冲液 ； 0049 B 分试剂盒包含探针、 缓冲液、 胶体金核酸试剂条 ； 0050 所述的探针包括探针 1、 2 和 3 ： 0051 探针 1 为 ： 5 -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3 （SH 表示巯基） ； 0052 探针 2 为 ： 5 -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bio-3 （Bio。

36、 表示生物素） ； 0053 探针 3 为 ： 5 -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3 （Bio 表示生物素） ； 0054 所述的缓冲液包括 4SSC 缓冲液、 含体积浓度 6% 甲酰胺的 4SSC 缓冲液。 0055 所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板 （材料为PVC塑料） 上且依次搭接的样品 板 （材料为玻璃纤维） 、 金垫 （材料为玻璃纤维） 、 硝酸纤维素膜和吸水板 （材料为吸水纤维） ； 金垫包埋有连接探针 1 的纳米金探针 ； 硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针 3 的控制线 （C 线） 和含链霉亲和素和探针 2 的检测线 （T 线） ， 检测线靠近金垫。

37、， 控制线靠近吸水板。 0056 本发明的基本原理 （如图 1 所示） ： 当检测体系存在目的基因片段时， T7 引物与其 结合进行退火， 同时体系中还存在 AMV 逆转录酶、 RNase H 和 T7RNA 聚合酶。在 AMV 逆转录 酶作用下， 形成 DNA-RNA 杂合体， 接着体系里的 RNase H 将杂合体中的 RNA 链特异降解。引 物 2 随后与此单链 DNA 结合退火， 由于 AMV 逆转录酶具有 DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性， 因此 在 AMV 逆转录酶作用下， 催化合成双链 DNA。因 T7 引物的 5 端带有能被 T7RNA 聚合酶识别 的启动子序列， 所以此双链。

38、 DNA 就可作为 T7RNA 聚合酶的催化底物转录合成反义 RNA。反 义RNA可与引物2结合退火， 在AMV逆转录酶作用下， 催化合成RNA-DNA杂合体， 然后RNase H 特异降解 RNA 链， 形成的单链 DNA 与 T7 引物结合退火， 在 AMV 逆转录酶作用下合成带有 T7RNA 聚合酶识别位点的双链 DNA， 又转录合成反义 RNA。反义 RNA 重复循环进行 DNA 合成、 RNA 降解、 T7RNA 聚合酶的转录扩增， 使得 RNA 不断得以扩增。扩增所得的 RNA 产物滴加到 样品板上时， 通过层析作用， 先与金垫处已经包埋的纳米金探针杂交， 当其到达已包埋有与 RN。

39、A 产物互补的探针 2 的检测线 （T 线） 处时， RNA、 纳米金探针和探针 2 形成 “三明治结构” ， 就会形成一条红色的线， 过量的纳米金探针继续层析， 到达已包埋有探针 3 的控制线 （C 线） 处时形成第二条红色的线。 0057 而不含目的基因片段时， 检测线 （T线） 处因不能形成 “三明治” 结构的杂交产物， 而 没有红色的线出现， 只有过量的纳米金探针继续层析， 到达已包埋有探针 3 的控制线 （C 线） 处时形成一条红色的线。 0058 若检测线 （T 线） 和控制线 （C 线） 处都无红色的线出现， 则表明试纸条已经失效， 检 测失败， 样品需要重新检测。 0059 本。

40、发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 说 明 书 CN 103146835 A 8 5/7 页 9 0060 （1） 依赖核酸序列扩增 （NASBA） 可在 2h 内将模板 RNA 扩增 109倍， 比常规 PCR 法 高 1000 倍。NASBA 技术由于它的引物上带有 T7 启动子序列， 而外来双链 DNA 无 T7 启动子 序列， 不可能被扩增， 因此在有 DNA 污染的条件下， NASBA 技术同样具有较高的特异性和灵 敏度。NASBA 将反转录过程直接合并到扩增反应中， 缩短了反应时间。 0061 （2） 将 NASBA 与试纸条检测结合， 可以实现定性或者定量检测， 结果稳定。

41、。 0062 （3） 检测速度快， 特异性好， 灵敏度高。 0063 （4） 设备简单， 成本低， 无需昂贵的仪器。 0064 （5） 探针设计简单， 操作步骤简短， 易于推广。 0065 （6） 本发明没有溴化已锭、 同位素等有害物质的使用， 没有安全隐患， 使用安全。 附图说明 0066 图 1 是基于 NASBA 的试纸条检测食源性致病菌的原理图。 0067 图 2 是单增李斯特菌总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图。 0068 图 3 是 NASBA 反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。 0069 图 4 是 13nm 胶体金的吸收光谱图， 在 520mm 处有最大吸收峰。 0070 图 5 是试纸。

42、条的组装结构以及各部分包埋情况图。 0071 图 6 是基于 NASBA 的试纸条检测单增李斯特菌结果图， 阴性结果 （1 号试纸条） 和 阳性结果 （2 号试纸条） 。 具体实施方式 0072 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0073 将本发明的方法应用于单增李斯特菌的检测。如图 1 所示为基于 NASBA 的试纸条 检测食源性致病菌的原理图。实施例中所用试剂均购自宝生物工程 （大连） 有限公司和生工 生物工程 （上海） 股份有限公司， 试纸条材料及设备均购自上海金标生物科技有限公司。 0074 实施例 1 0075 （1） 单增李斯特菌 （。

43、菌株 CMCC54007， 购买于广州微生物研究所） 总 RNA 的提取 ： 0076 液氮研磨， 取大约 5mL 菌液于研钵内， 加入少量液氮， 迅速研磨， 研磨过程中不 断加入液氮， 直到研磨充分为止。研磨后将细胞裂解物转入 1.5mL EP 管中， 再在研磨器内 加入 0.8mL Trizol， 吹打研钵上的残余裂解物， 倒入 EP 管中。 0077 盖好盖子， 颠倒混匀 10 次， 室温静置 5 分钟。 0078 往 EP 管中加入 0.2mL 氯仿， 盖好盖子， 用力摇晃 15 秒钟， 使液体充分混匀， 室温 静置 5 分钟后， 12000 转离心 15 分钟。 0079 将上清转移。

44、至新的1.5mL EP管中 （大约为0.5mL） ， 加入0.5mL异丙醇， 用力摇晃 15 秒钟， 使液体充分混匀， 放置于 -20冰箱中 1 小时。 0080 12000转离心10分钟， 小心弃去上清， 加入1毫升预冷的75%酒精的DEPC溶液， 震荡洗涤。 0081 7500转离心5分钟， 小心弃去上清， 开盖于超净台内30分钟吹干沉淀， 此时RNA 沉淀变为透明。 说 明 书 CN 103146835 A 9 6/7 页 10 0082 EP 管中加入 20L DEPC 溶液溶解沉淀， 如沉淀溶解困难， 可在 55 60水浴 中最多 10 分钟助溶。提取后的 RNA 可放置于 -80冰。

45、箱中保存或立即进行实验。 0083 提取结果如图 2 所示， M 为 DL2000， 1 为单增李斯特菌总 RNA， 细菌的核糖体亚基中 包含 3 种沉降系数不同的 rRNA， 分别是 16S rRNA， 5S rRNA 和 23S rRNA。其余 RNA 的丰度 低， 在琼脂糖电泳中看不出条带。 0084 （2） 引物及探针设计 ： 根据单增李斯特菌的 16S rRNA 基因可变区序列设计可以扩 增出 159nt 的 RNA 片段 （如图 3 所示， M 为 DL2000， 1、 2 分别为 1ng/L、 0.1ng/L 模板浓 度下的扩增条带） 的引物 （T7 引物和引物 2） 。探针 1。

46、 和探针 2 分别和 RNA 产物的两端互补， 探针 3 与探针 1 完全互补。所用到的引物和探针如表 1 所示 ： 0085 表 1 引物列表 0086 0087 （3） NASBA 反应 ： 0088 于 PCR 管中配制下列混合液 ： 模板 RNA1L、 T7 引物和引物 2（10M） 各 1L、 dNTPs（10mM） 2.5L、 NTPs（10mM） 5L、 5T7RNA 聚合酶缓冲液 2L、 5AMV 逆转录酶 缓冲液 2L、 DMSO2.5L， DEPC 处理水 3L， 总体积 20L ； 0089 65孵育 5 分钟后， 41冷却 5min ； 0090 在上述 PCR 管中迅。

47、速加入以下酶混合液 （5L） ： 5T7RNA 聚合酶缓冲液 0.5L、 5AMV 逆转录酶缓冲液 0.5L、 AMV 逆转录酶 （10U/L） 0.8L、 T7RNA 聚合酶 （20U/L） 1.8L、 RNaseH（5U/L） 0.1L、 RNA 酶抑制剂 （40U/L） 0.25L、 BSA（10g/ L） 0.25L、 DEPC 处理水 0.8L ； 0091 41孵育 90 分钟， 4终止反应， 得到的产物可直接用于试纸条检测。 0092 （4） 纳米金的制备 0093 采用柠檬酸盐还原法制备纳米金， 将 100mL1mM 的 HAuCl4加热沸腾， 快速搅拌下迅 速加入 10mL3。

48、8.8mM 的柠檬酸钠溶液， 2min 内溶液颜色由金黄色灰色酒红色透亮的 红色， 继续搅拌 20min， 冷却至室温得到纳米金胶体溶液， 用紫外吸收光谱仪测得其吸收峰 在 520nm 左右处 （图 4 所示） ， 即得到 13nm 的纳米金胶体溶液。 0094 （5） 探针 1 与纳米金的连接 （TCEP 法标记纳米金探针） 0095 向 PCR 管中加入 20L200M 的 5 端修饰有巯基的探针 1， 接着向 PCR 管中加入 0.66L500M 的醋酸缓冲液 （pH5.2） 和 1L10M TCEP（磷酸三氯乙酯） 以活化巯基， 室 温、 避光孵育1小时 ； 取洁净的离心管， 加入1mL10nM的纳米金胶体溶液， 然后在不断的摇动 下， 加入TCEP处理过的探针1溶液， 盖上管盖， 室温避光放置至少16小时， 用振荡器600rpm 说 明 书 CN 103146835 A 10 7/7 页 11 加速反应 ； 缓慢震荡下向管中逐滴加入20L500mM的Tris醋酸缓冲液 （pH8.2） ， Tris醋酸 缓冲液的终浓度为 5mM ； 再向管中逐滴加入 200L1M NaCl， 避光孵育一天 ； 12000rpm， 4 离心 30 分钟， 取出。